肖 宇，石文琪，于宏偉，馬愛(ài)進(jìn)，桑亞新，孫紀(jì)錄*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定 071000 2 河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院 河北昌黎 066600 3 北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院 北京 100048）

殼聚糖（Chitosan）是一種經(jīng)過(guò)乙?；摮幚淼奈镔|(zhì)，它的優(yōu)點(diǎn)包括易降解、耐水、耐藥、易生長(zhǎng)、抗微生物、可循環(huán)利用、安全、無(wú)毒等，因此在食品、醫(yī)療、造紙、化妝品、環(huán)境保護(hù)、農(nóng)業(yè)等眾多行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用[1]。在食品領(lǐng)域，殼聚糖可以用于保鮮海鮮、水果和肉類[2-4]，延緩淀粉的老化，增強(qiáng)面包的持水性[5]，并能夠澄清果汁[6]等。

目前，高溫濃堿法是幾丁質(zhì)制備殼聚糖最為常用的方法。然而，濃堿的使用會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題，且具有產(chǎn)物不穩(wěn)定，耗能高等缺點(diǎn)[7]。采用酶分解技術(shù)降解幾丁質(zhì)，可以有效實(shí)現(xiàn)殼聚糖的綠色制備，這將成為殼聚糖制造行業(yè)的一個(gè)重要發(fā)展趨勢(shì)[8]。

幾丁質(zhì)脫乙酰酶（Chitin deacetylase，CDA）能夠催化水解幾丁質(zhì)中的乙?；?，使其轉(zhuǎn)化為殼聚糖[9]。這種酶被認(rèn)為是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最能夠?qū)锥≠|(zhì)轉(zhuǎn)變成殼聚糖的酶[9]。此外，迄今為止，已報(bào)道的CDA 大多數(shù)來(lái)源是真菌，也有少部分來(lái)源于細(xì)菌[10]，并且，微生物產(chǎn)生的CDA 大多為胞內(nèi)酶。柴金龍等[11]篩選了1 株產(chǎn)CDA 的海水硝酸鹽還原菌（Nitratireductor aquimarinus）MCDA3-3，優(yōu)化培養(yǎng)條件后，酶活力達(dá)到4.07 U/mL。通過(guò)多級(jí)紫外線誘變育種，魏麗蓉等[12]以海洋微紫青霉（Penicillium janthinellum）UV-0S 為原始菌株，成功獲得了高產(chǎn)的CDA 突變株UV-3S，在最佳發(fā)酵條件下，酶活力達(dá)到11.83 U/mL。岳洪霞等[13]經(jīng)篩選，發(fā)現(xiàn)1 株具有較強(qiáng)CDA 酶活性的菌株11-3，經(jīng)鑒定為紅球菌（Rhodococcussp.），研究發(fā)現(xiàn)該菌所產(chǎn)CDA 為胞內(nèi)酶。張建旭等[14]通過(guò)優(yōu)化該菌的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，將其CDA 酶活力由58 U/mL 提高到5 890 U/mL。由此可見(jiàn)，紅球菌是非常好的CDA 來(lái)源。然而，該菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，具有多層肽聚糖細(xì)胞壁，且當(dāng)細(xì)胞老化時(shí)，其細(xì)胞壁厚度還會(huì)增加，更難以破碎。因此，從紅球菌細(xì)胞中獲得大量CDA 的最大難題是細(xì)胞破碎[15-18]。

常見(jiàn)的微生物細(xì)胞破壁方法有很多，不同方法對(duì)胞內(nèi)酶的提取效果的影響不盡相同。按照作用方式可分為化學(xué)法、物理法和生物法。其中，化學(xué)法有表面活性劑處理法等[19]；物理法有機(jī)械法、反復(fù)凍融法、玻璃珠法、超聲處理法等[19]；生物法有酶解法等[20]。這些方法均有各自的局限性。機(jī)械法損耗大，且會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的熱量，導(dǎo)致酶失活[21]；酶解法的價(jià)格昂貴，而且可能導(dǎo)致產(chǎn)物的降解；化學(xué)方法的效率很低，需要很長(zhǎng)時(shí)間才能發(fā)揮作用，而且使用的試劑有很高的毒性，容易導(dǎo)致細(xì)胞酶失活，此外，還有可能對(duì)后續(xù)試驗(yàn)造成干擾；使用超聲波進(jìn)行冷卻可能會(huì)使一些敏感的化學(xué)物質(zhì)失去活性[22]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于產(chǎn)CDA 微生物的研究較多集中在高產(chǎn)菌株的選育、發(fā)酵特性、異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)方面，對(duì)于CDA 高產(chǎn)菌株破壁處理的報(bào)道很少。本研究擬通過(guò)物理、化學(xué)和生物方法，包括超聲、反復(fù)凍融、液氮研磨、球磨、均質(zhì)、表面活性劑處理、氯仿處理以及溶菌酶處理等，對(duì)紅球菌11-3 進(jìn)行破壁處理，以提取的CDA 酶活力為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合菌體掃描電鏡觀察，篩選出適合紅球菌11-3 的單一細(xì)胞破壁方法。以此為基礎(chǔ)，研究聯(lián)合破壁方法對(duì)提取紅球菌11-3 胞內(nèi)CDA的效果，以期探尋出一種紅球菌高效破壁提取CDA 的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 紅球菌（Rhodococcussp.）11-3（以下簡(jiǎn)稱紅球菌），山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院劉建軍教授惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑 溶菌酶（20 000 U/mg）、SDS、Twiton X-100，Biotopped 公司；EDTA，美國(guó)Solarbio 公司；氯仿，江蘇普樂(lè)司生物科技有限公司；4-硝基乙酰苯胺，上海源葉生物有限公司；對(duì)硝基苯胺，天津市華東試劑廠；其它所用化學(xué)試劑均為分析純級(jí)。

1.1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂18.0 g/L，pH 7.0～7.2；種子培養(yǎng)基：葡萄糖2.5 g/L，酵母膏5.0 g/L，硫酸銨4.0 g/L，磷酸二氫鉀1.5 g/L，pH 值自然；發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨2.5 g/L，蔗糖7.0 g/L，硫酸銨2.5 g/L，磷酸二氫鉀1.5 g/L，乙酸鈉2.0 g/L，玉米漿5.0 g/L，pH 值為7.5。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004 電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；PHS-3DW 型pH 計(jì)，安徽合肥橋斯儀器設(shè)備有限公司；WP25AB 臺(tái)式電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；ZWY-2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市良友儀器有限公司；TGL-16MG 低溫高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘銳離心機(jī)有限公司；FSH-2 可調(diào)高速勻漿機(jī)，常州國(guó)華電器有限公司；JY92-ⅡDN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；QM-100S 多功能高效球磨儀，五洲鼎創(chuàng)（北京）科技有限公司；721G 可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；CPD 030臨界點(diǎn)干燥器，北京裕隆時(shí)代科技有限公司；SPIModule 濺射鍍膜機(jī)，上海鉑悅儀器上海有限公司；日本Hitachi s4800 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，昆山工研院新型平板顯示技術(shù)中心有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與培養(yǎng) 將斜面上的紅球菌菌株接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯（Nutrient broth，NB）固體培養(yǎng)基上，在30 ℃下培養(yǎng)24 h，然后再將其轉(zhuǎn)移至NB 液體培養(yǎng)基上，進(jìn)行3 次活化培養(yǎng)。將經(jīng)過(guò)活化的菌株以5%的比例注入發(fā)酵培養(yǎng)液，于30 ℃，180 r/min 培養(yǎng)60 h[23]。在培養(yǎng)完成后，將液體培養(yǎng)物于4 ℃，8 000 r/min 離心20 min，棄上清，使其沉淀，接著將菌體用無(wú)菌水洗滌2～3 次，最終將其離心得到的濕菌體置于-20 ℃，以便進(jìn)行后續(xù)的破壁試驗(yàn)。細(xì)胞破壁前，將菌體用緩沖液懸浮即可。

1.3.2 物理方法

1.3.2.1 反復(fù)凍融破壁處理 從培養(yǎng)60 h 的紅球菌液體培養(yǎng)液中抽取10 mL，以8 000 r/min 的轉(zhuǎn)速，在4 ℃下離心20 min，然后將菌體懸浮于10 mL 0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）中，并在液氮和37 ℃水浴中重復(fù)凍融10 次[24]，以獲得最終結(jié)果。

1.3.2.2 超聲波破壁處理 將菌體懸浮于10 mL 0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）中，在不同處理時(shí)間（5，15，25，35，45 min）及不同功率（200，300，400，500，600 W）下分別對(duì)紅球菌進(jìn)行破碎處理（開(kāi)5 s，關(guān)1 s），處理過(guò)程需在冰浴中進(jìn)行[25]。

1.3.2.3 球磨破壁處理 將菌體懸浮于10 mL 0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）中，加入玻璃珠，在球磨儀最大振動(dòng)頻率30 Hz 的條件下研磨處理（5，10，15，20，25，30 min）。

1.3.2.4 勻漿破壁處理 將菌體懸浮于10 mL 0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）中，以13 000 r/min 的冰浴條件下勻漿處理（10，20，30，40，50 min）。

1.3.2.5 液氮研磨破壁處理 將取得的50 mL 菌液以8 000 r/min 的轉(zhuǎn)速，在4 ℃下離心20 min，收集菌體，將其放入液氮預(yù)冷的研缽中，加入適量的液氮，充分研磨，直至菌體變成均勻的粉末狀，然后將其溶解于40 mL 0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液中，并將其轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，最后用10 mL緩沖液洗滌研缽[26]，并將其轉(zhuǎn)移至離心管中。

1.3.3 化學(xué)方法

1.3.3.1 表面活性劑破壁處理 將菌體細(xì)胞重新懸浮在同體積的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）中，分別添加EDTA、Triton X-100 和十二烷基硫酸鈉（SDS），質(zhì)量濃度均為20 g/L。懸浮液在30 ℃，180 r/min 的搖瓶中處理30 min[27]。

1.3.3.2 氯仿破壁處理 將菌體懸浮于同體積的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）后，添加2.5%氯仿并在30 ℃，180 r/min 溫育30 min[28]。

1.3.4 溶菌酶破壁處理 將菌體懸浮于同體積的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）后，分別添加溶菌酶使其終質(zhì)量濃度分為0.2，0.4，0.8，1.0，2.0 mg/mL，在37 ℃搖床中分別處理0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 h。

1.3.5 聯(lián)合破壁處理方法 處理1：從50 mL 菌液中取出濕菌體，將其放入液氮預(yù)冷的研缽內(nèi)，加入適量液氮，徹底研磨，使菌體形成細(xì)膩的粉末后，加入40 mL 0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0），使其完全溶解，然后將其轉(zhuǎn)入清潔的離心管中，加入10 mL 緩沖液清洗研缽并將其轉(zhuǎn)入離心管，制成重懸液，將其在13 000 r/min 的冰浴下均質(zhì)30 min。

處理2：將菌體懸浮于同體積的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）中，制成重懸液；重懸液以13 000 r/min 冰浴均質(zhì)30 min 后，于10 000 r/min 離心5 min，留存上清液備用，并將收集到的濕菌體移入液氮預(yù)冷的研缽中，倒入適量的液氮充分研磨，直至菌體成均勻粉末狀后用40 mL 留存的上清液溶解，并轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，再用10 mL 上清液洗滌研缽一并轉(zhuǎn)入離心管中，制成重懸液。

1.3.6 胞內(nèi)CDA 的提取及酶活力測(cè)定

1.3.6.1 胞內(nèi)CDA 酶的提取 將紅球菌培養(yǎng)60 h，此時(shí)CDA 酶活力最高，取50 mL 發(fā)酵液，于8 000 r/min，4 ℃離心10 min 收集菌體，用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)洗滌2～3 次，之后加入50 mL 0.5 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）分別進(jìn)行反復(fù)凍融、超聲、球磨、勻漿、液氮研磨、EDTA、TritonX-100 和SDS、氯仿、溶菌酶、液氮研磨和勻漿聯(lián)合進(jìn)行破壁處理。將懸浮液于10 000 r/min，4 ℃離心10 min，以除去細(xì)胞殘片和未破碎的細(xì)胞，上清液即為胞內(nèi)酶粗酶液。

1.3.6.2 CDA 酶活力測(cè)定 對(duì)硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確稱取0.01 g 對(duì)硝基苯胺溶解于100 mL 蒸餾水中獲得100 mg/L 的對(duì)硝基苯胺母液，然后用蒸餾水將母液稀釋為0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mg/mL 的對(duì)硝基苯胺標(biāo)液。通過(guò)蒸餾水作為參照物，測(cè)量各標(biāo)準(zhǔn)液體在波長(zhǎng)400 nm 處的吸光度（A400）。重復(fù)3 次試驗(yàn)，以A400為橫坐標(biāo)，繪制出硝基苯胺濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1 所示。

圖1 對(duì)硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 P-nitroaniline standard curve

CDA 酶活力測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[23]，將1 mL 200 mg/L 的硝基乙酰苯胺水溶液、1 mL 合適濃度的酶液和3 mL 50 ℃的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）混合均勻，構(gòu)建反應(yīng)體系，在50 ℃水浴中反應(yīng)15 min，然后在沸水浴中終止反應(yīng)，待反應(yīng)液冷卻到室溫，再加入10 mL 水，攪拌均勻，以8 000 r/min 離心10 min，測(cè)定上清液的吸光度?？瞻讓?duì)照體系為添加1 mL 相應(yīng)濃度的高溫滅活酶液，其余同上，測(cè)定上清液的吸光度值。設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，取平均值，根據(jù)對(duì)硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CDA 酶活力（U/mL）。

1.3.7 掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscopy，SEM）觀察 按照Spiden 等[29]所述，通過(guò)SEM 對(duì)經(jīng)1.3.3～1.3.6 節(jié)各方法處理后所得到的破碎上清液CDA 酶活力最高的樣品進(jìn)行可視化分析。具體步驟如下，在蓋玻片上添加0.1%的聚乙烯亞胺溶液，并在火焰下加熱干燥。將新鮮勻漿的懸浮液在蓋玻片上溫育1 h。然后，將蓋玻片浸入2.5%戊二醛中1 h，在PBS 中沖洗3 次，每次10 min。將蓋玻片轉(zhuǎn)移到70%乙醇和二甲氧基甲烷（1∶1，V/V）的混合物中5 min，此后浸入純二甲氧基甲烷中20 min。然后將蓋玻片在臨界點(diǎn)干燥器中干燥，其中溶劑逐漸被液態(tài)CO2（8 ℃，50 bar）代替。將干燥的蓋玻片安裝在帶有雙面碳片的鋁片上，并使用濺射鍍膜機(jī)涂金。最后，采用掃描電子顯微鏡觀察紅球菌的細(xì)胞形態(tài)，放大倍數(shù)為5 000倍。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

破壁處理與酶活力測(cè)定試驗(yàn)重復(fù)3 次，運(yùn)用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；使用Origin 2017 處理CDA 酶活力數(shù)據(jù)，結(jié)果用折線圖呈現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾丁質(zhì)脫乙酰酶在紅球菌中的定位

將已活化好的紅球菌以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min，30 ℃培養(yǎng)，每12 h 測(cè)定培養(yǎng)物的OD600值，反映菌株的生長(zhǎng)情況，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別以O(shè)D600、CDA 酶活力為縱坐標(biāo)，繪制其生長(zhǎng)曲線和CDA 酶活力產(chǎn)生曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 紅球菌細(xì)胞生長(zhǎng)和幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)生曲線Fig.2 Cell growth and CDA production curves for Rhodococcus sp.11-3

由圖2a 可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CDA 酶活力逐漸增加，在60 h 時(shí)，達(dá)到最大。由圖2b 可知，重懸液酶活力基本接近發(fā)酵液酶活力，上清液酶活力很低，初步判斷原因是該酶可能存在于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞壁。

為避免發(fā)酵液中有其它物質(zhì)影響酶活力測(cè)定的準(zhǔn)確性，將發(fā)酵液離心收集菌體，對(duì)菌體進(jìn)行反復(fù)洗滌，并用緩沖液懸浮（重懸液），分別測(cè)定上清液及重懸液的酶活力，如果上清液中CDA 酶活力較低，則該酶存在于胞內(nèi)或者附著在細(xì)胞表面，可用表面活性劑洗滌菌體，離心分別測(cè)定上清液及重懸液的酶活力，若上清液中酶活力仍很低，結(jié)合圖2 結(jié)果可以初步判斷該酶屬于胞內(nèi)酶，結(jié)果如表1 所示。

表1 菌體反復(fù)洗滌后上清液和重懸液中CDA 酶活力Table 1 CDA activity in supernatant and resuspension after repeated washing

從表1 可以看出，上清液與重懸液相比CDA酶活力很低，因此，該酶不屬于胞外酶。進(jìn)一步在重懸液中加入表面活性劑吐溫80，混勻，于室溫靜置20 min，離心測(cè)定上清液酶活力，以確定該酶具體位置，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 吐溫80 處理后上清液和重懸液中CDA 酶活力Table 2 CDA enzyme activity in supernatant and resuspension after Tween 80 treatment

從表2 可以看出，用表面活性劑處理后，上清液中的CDA 酶活力仍很低，因此排除了該酶存在于細(xì)胞表面的可能性，可判定該酶為胞內(nèi)酶，若要進(jìn)一步確認(rèn)此結(jié)論，應(yīng)對(duì)紅球菌細(xì)胞進(jìn)行破壁處理。

2.2 物理破壁方法對(duì)紅球菌胞內(nèi)CDA 釋放的影響

2.2.1 反復(fù)凍融破壁處理 采用反復(fù)凍融法對(duì)紅球菌細(xì)胞進(jìn)行破壁處理，觀察CDA 的釋放效果。離心收集沉淀和上清液，再將沉淀分散到同體積的緩沖液中，離心前、后分別測(cè)定重懸液和上清液CDA 酶活力，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 反復(fù)凍融法對(duì)紅球菌釋放CDA 的影響Fig.3 The effect of repeated freezing and thawing on the release of CDA from Rhodococcus sp.11-3

從圖3 可以看出，反復(fù)凍融法對(duì)紅球菌細(xì)胞的破碎效果不明顯。凍融前后重懸液、上清液酶活力相差甚微，CDA 僅釋放了1.82%，說(shuō)明僅采用凍融法不能顯著破壞紅球菌細(xì)胞壁，其胞內(nèi)CDA 不能得到有效釋放。

2.2.2 超聲破壁處理

1）超聲輸出功率對(duì)細(xì)胞釋放CDA 的影響超聲處理已被用于釋放許多重要的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物[30-32]。水浴超聲處理也已成功地應(yīng)用于改善各種微生物的細(xì)胞壁通透性[33-37]。超聲波將電輸入能量轉(zhuǎn)換為高頻超聲波能量，這種機(jī)械能通過(guò)水浴超聲波中的液體傳輸[38]。分別在200，300，400，500，600 W 的超聲波輸出功率下對(duì)紅球菌細(xì)胞進(jìn)行超聲處理，處理總時(shí)間為25 min。測(cè)定上清液中CDA 的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 超聲輸出功率對(duì)紅球菌釋放CDA 的影響Fig.4 The effect of ultrasound output power on the release of CDA from Rhodococcus sp.11-3

由圖4 可知，當(dāng)功率為200～400 W 時(shí)，破壁上清液中CDA 酶活力隨著超聲波輸出功率的增加而漸強(qiáng)。這是由于較大的超聲輸出功率使液體中形成較多的空穴，進(jìn)而產(chǎn)生更多的空化泡，使破碎作用增強(qiáng)。當(dāng)功率為400～600 W 時(shí)，隨著超聲波輸出功率增強(qiáng)，對(duì)CDA 的破壞逐漸變大，CDA 酶活力逐漸減小。因此，選擇400 W 為適宜的輸出功率。

2）超聲處理總時(shí)間對(duì)細(xì)胞釋放CDA 的影響輸出功率為400 W，冰浴條件下，研究不同超聲波處理總時(shí)間對(duì)細(xì)胞釋放CDA 的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)紅球菌釋放CDA 的影響Fig.5 The effect of total working time of ultrasonic on the release of CDA from Rhodococcus sp.11-3

超聲波處理總時(shí)間為5～35 min 時(shí)，上清液中CDA 酶活力隨著超聲波處理總時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。到達(dá)35 min 時(shí)，CDA 酶活力達(dá)到最大。當(dāng)超聲波處理總時(shí)間超過(guò)35 min 后，CDA 酶活力驟降為0。這可能是由于超聲過(guò)程中處理液局部溫度驟增，導(dǎo)致酶失活。

3）在優(yōu)化條件下超聲處理對(duì)細(xì)胞釋放CDA的影響 在400 W，35 min 的最優(yōu)超聲處理?xiàng)l件下，研究其對(duì)CDA 酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 超聲處理對(duì)紅球菌釋放CDA 的影響Fig.6 The effect of ultrasonic treatment on the release of CDA from Rhodococcus sp.11-3

在400 W，35 min 的超聲處理?xiàng)l件下，處理前、后總酶活力損失了49.89%，且CDA 僅釋放了5.13%，因此超聲波破壁法并不適用于紅球菌。

2.2.3 球磨破壁處理 球磨是在物料研磨中是一種常用的設(shè)備，物料經(jīng)球磨處理后，其表面積和孔隙率會(huì)大幅增加，其分散性、化學(xué)活性也會(huì)相應(yīng)升高[39]。采用球磨法對(duì)紅球菌進(jìn)行破壁處理，在最大振動(dòng)頻率30 Hz 的條件下研磨0～30 min，分時(shí)段取樣，離心收集上清液并測(cè)定其酶活力，觀察CDA的釋放效果，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 球磨處理時(shí)間對(duì)紅球菌釋放CDA 的影響Fig.7 The effect of ball milling treatment time on the release of CDA from Rhodococcus sp.11-3

由圖7 可知，球磨時(shí)間為0～30 min 時(shí)，細(xì)胞破碎液的上清液中CDA 酶活力隨著球磨時(shí)間的延長(zhǎng)而均勻增大。球磨時(shí)間為30 min 時(shí)，CDA 酶活力達(dá)到最大，為40.3 U/mL，CDA 釋放率僅為6.97%。

2.2.4 勻漿破壁處理 勻漿器可以產(chǎn)生流體動(dòng)力空化作用。在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞壁被勻漿機(jī)產(chǎn)生的水動(dòng)力裂解。在勻漿器中以最大可達(dá)到的水動(dòng)力運(yùn)行會(huì)產(chǎn)生最大數(shù)量的破碎細(xì)胞，從而使酶的釋放達(dá)到最大化。據(jù)Pandi[40]報(bào)道，水動(dòng)力空化對(duì)于釋放位于周質(zhì)空間中的酶最有效。本試驗(yàn)采用勻漿法對(duì)紅球菌細(xì)胞進(jìn)行破壁處理。在功率185 W，13 000 r/min 轉(zhuǎn)速的條件下勻漿0～50 min，分時(shí)段取樣，離心收集上清液并測(cè)定其酶活力，觀察CDA的釋放效果，結(jié)果如圖8 所示。

圖8 勻漿時(shí)間對(duì)紅球菌釋放CDA 的影響Fig.8 The effect of homogenization time on the release of CDA from Rhodococcus sp.11-3

由圖8 可知，勻漿時(shí)間為0～50 min 時(shí)，細(xì)胞破碎液的上清液中CDA 酶活力隨著勻漿時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，勻漿時(shí)間為50 min 時(shí)，CDA 酶活力達(dá)到最大，為114.1 U/mL，釋放率達(dá)到16%，且在勻漿過(guò)程中酶活力損失較小，為9.18%。

2.2.5 液氮研磨破壁處理 液氮研磨可以將細(xì)胞冷凍起來(lái)，質(zhì)地變得很脆，這樣更容易破壞細(xì)胞壁。同時(shí)，液氮的超低溫可防止胞內(nèi)酶被降解。另一方面，研磨細(xì)膩，能對(duì)細(xì)胞造成更大程度的破壞。本試驗(yàn)用液氮對(duì)紅球菌進(jìn)行充分研磨，將得到的細(xì)胞破碎液于10 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液，測(cè)定其中的CDA 酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 液氮研磨處理對(duì)紅球菌釋放CDA 的影響Fig.9 The effect of liquid nitrogen grinding treatment on the release of CDA from Rhodococcus sp.11-3

由圖9 可以看出，紅球菌經(jīng)液氮研磨后，上清液中CDA 酶活力明顯提高，釋放率達(dá)到45.13%，且在處理過(guò)程中重懸液中基本沒(méi)有酶活力損失，僅為2.03%。因此與其它方法相比，液氮研磨提取CDA 是有效的。

2.3 化學(xué)破壁方法對(duì)紅球菌胞內(nèi)CDA 釋放的影響

2.3.1 表面活性劑破壁處理 化學(xué)方法的選擇是基于它們攻擊細(xì)胞膜中特定抗性區(qū)域的能力。這些方法被用于改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性或弱化。本試驗(yàn)采用EDTA、TritonX-100、SDS 和聯(lián)合方法對(duì)紅球菌細(xì)胞進(jìn)行破壁處理。懸浮液在30 ℃的搖瓶中培養(yǎng)30 min，并在4 ℃，12 000 r/min 離心5 min。離心前、后，分別測(cè)定重懸液和上清液的CDA 酶活力，觀察CDA 的釋放效果，結(jié)果如圖10所示。

圖10 EDTA、TritonX-100 和SDS 處理對(duì)紅球菌細(xì)胞釋放CDA 的影響Fig.10 The effect of EDTA，TritonX-100 and SDS treatment on the release of CDA from Rhodococcus sp.11-3

由圖10 可知，用EDTA 處理紅球菌細(xì)胞，上清液CDA 酶活力得到提高，達(dá)到12.8 U/mL；用TritonX-100 和SDS 及聯(lián)合方法對(duì)紅球菌細(xì)胞進(jìn)行破壁處理時(shí)，上清液酶活與未處理前上清液CDA 酶活力相比并未得到提高。此外，分別用4 種方法處理后總酶活比未處理前分別降低了8.2%，10.2%，19.5%，11.9%。綜上所述，在4 種化學(xué)方法中，用質(zhì)量濃度為20 g/L 的EDTA 處理紅球菌細(xì)胞，總酶活損失最小，且破碎后上清液CDA 酶活力最高，然而CDA 釋放率僅1.57%。

2.3.2 氯仿破壁處理 經(jīng)2.5%氯仿處理的重懸液以4 ℃，10 000 r/min 離心5 min。離心前、后，分別測(cè)定重懸液和上清液的CDA 酶活力，觀察CDA的釋放效果，結(jié)果如圖11 所示。

由圖11 可知，用氯仿處理紅球菌細(xì)胞，總酶活僅損失了2.06%，且上清液CDA 酶活力得到提高，達(dá)到30.1 U/mL，CDA 釋放率為3.70%。由此可見(jiàn)，該方法雖然能保持較低的總酶活損失，但破碎效果并不理想，因此該方法并不適用。

2.4 溶菌酶破壁方法對(duì)紅球菌胞內(nèi)CDA 釋放的影響

溶菌酶可專一地作用于革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁肽聚糖分子中的β-1，4 鍵，從而使其細(xì)胞壁輕易裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)含物[28]。本試驗(yàn)采用不同濃度的溶菌酶于37 ℃處理紅球菌，觀察在不同溶菌酶質(zhì)量濃度下，處理時(shí)間對(duì)CDA 酶活的影響，結(jié)果如圖12 所示。

圖12 不同溶菌酶濃度下處理時(shí)間對(duì)紅球菌釋放CDA 的影響Fig.12 The effect of treatment time under different lysozyme concentrations on the release of CDA from Rhodococcus sp.11-3

結(jié)果表明，溶菌酶質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，處理6 h，上清液CDA 酶活力達(dá)到最大，為6.6 U/mL，釋放率為1.38%。用溶菌酶處理紅球菌菌體細(xì)胞，酶解后菌體殘留CDA 酶活力與未處理基本沒(méi)有差別。

2.5 聯(lián)合破壁方法對(duì)紅球菌胞內(nèi)CDA 釋放的影響

根據(jù)2.2～2.4 節(jié)各單一破壁方法的CDA 釋放率及總酶活損失率，選擇液氮研磨和勻漿兩種方法聯(lián)合對(duì)紅球菌進(jìn)行破壁處理。將處理1 和處理2 中的重懸液分別以4 ℃，10 000 r/min 離心5 min。離心前、后，分別測(cè)定重懸液和上清液的CDA 酶活力，觀察CDA 的釋放效果，結(jié)果如圖13所示。

圖13 液氮研磨和勻漿聯(lián)合處理對(duì)紅球菌釋放CDA 的影響Fig.13 The effect of combined treatment of liquid nitrogen grinding and homogenization on the release of CDA from Rhodococcus sp.11-3

由圖13 可知，用處理1 和處理2 兩種聯(lián)合方法處理紅球菌細(xì)胞，上清液CDA 酶活力得到大幅度提高，分別達(dá)到313.3 U/mL 和480.2 U/mL，CDA釋放率分別為55.52%和86.17%，兩種處理總酶活力損失分別為9.11%和3.27%。由此可見(jiàn)，用處理2 破碎紅球菌效果較理想。

2.6 不同破壁方法處理的紅球菌細(xì)胞的SEM 觀察

利用掃描電子顯微鏡觀察經(jīng)不同破壁方法處理的紅球菌，包括：未處理組、反復(fù)凍融組、超聲波處理組（400 W，35 min）、球磨處理組（30 Hz，50 min）、勻漿處理組（13 000 r/min，30 min）、液氮研磨組、EDTA 處理組、氯仿處理組、溶菌酶處理組（1.0 mg/mL，6 h）、處理1（液氮研磨后，勻漿處理13 000 r/min，30 min）、處理2（勻漿處理13 000 r/min，30 min 后，液氮研磨），結(jié)果見(jiàn)圖14。

圖14 不同破壁方法處理的紅球菌細(xì)胞的SEM 圖Fig.14 SEM images of Rhodococcus sp.11-3 cells treated by different breaking methods

由圖14 可知，未經(jīng)過(guò)處理的紅球菌細(xì)胞表面光滑（圖14A）；經(jīng)反復(fù)凍融、超聲波、球磨、EDTA、氯仿、溶菌酶處理后的紅球菌細(xì)胞表面變化很小，僅有個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)小孔洞（圖14B、14C、14D、14G、14H、14I）。經(jīng)勻漿處理的紅球菌個(gè)別細(xì)胞表面出現(xiàn)較大孔洞，內(nèi)容物外泄（圖14E）；經(jīng)液氮研磨處理的紅球菌細(xì)胞表面都遭到破壞，出現(xiàn)密密麻麻的孔洞，個(gè)別細(xì)胞表面被嚴(yán)重破壞，出現(xiàn)較大的孔洞（圖14F）；經(jīng)液氮研磨和勻漿聯(lián)合處理的紅球菌細(xì)胞表面出現(xiàn)更多密集孔洞（圖14J）；經(jīng)勻漿和液氮研磨聯(lián)合處理的紅球菌細(xì)胞表面的孔洞比圖14J 的更大且密集。以上結(jié)果表明，勻漿處理和液氮研磨對(duì)紅球菌細(xì)胞破壁有效果，勻漿處理和液氮研磨聯(lián)合處理效果更明顯。

3 結(jié)論

不同的破壁方法對(duì)紅球菌菌株的胞內(nèi)CDA釋放效率及細(xì)胞形態(tài)變化的影響有明顯差別。對(duì)于紅球菌細(xì)胞，液氮研磨和勻漿是兩種較優(yōu)的破壁方法。破壁處理后的細(xì)胞表面出現(xiàn)明顯孔洞，CDA 釋放率分別達(dá)到45.13%和16.00%，處理過(guò)程中總酶活力損失較小。利用先勻漿后液氮研磨的聯(lián)合方法處理紅球菌，能夠在更大程度上破壞細(xì)胞壁，產(chǎn)生更多、更大的密集孔洞，CDA 釋放率達(dá)到86.17%。由此可見(jiàn)，勻漿和液氮研磨聯(lián)合處理有效提高了紅球菌胞內(nèi)CDA 的釋放程度，作為一種操作簡(jiǎn)單且高效的處理方式，為胞內(nèi)CDA 的分離純化提供了一種有效途徑，同時(shí)，也為紅球菌應(yīng)用于殼聚糖的酶法工業(yè)化生產(chǎn)，提供了重要的推動(dòng)作用。