呂欣然，呂孟敏，楊冰艷，顧振辰，劉雪晴，勵(lì)建榮，2*，白鳳翎，檀茜倩，李英美

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧錦州 121013 2 大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連 116034 3 達(dá)蓮食品（錦州）有限公司 遼寧錦州 121019）

群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）是細(xì)菌間進(jìn)行信息交流的一種機(jī)制。細(xì)菌通過(guò)自身合成來(lái)釋放信號(hào)分子-自誘導(dǎo)物（Autoinducer，AI）以感知環(huán)境變化，當(dāng)信號(hào)分子濃度達(dá)到一定閾值后，與受體蛋白結(jié)合激活信號(hào)通路，從而調(diào)控細(xì)菌生物發(fā)光，生物膜形成，毒力基因產(chǎn)生等[1-2]。革蘭氏陰性菌主要分泌N-乙?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserine lactone，AHLs）類信號(hào)分子，而革蘭氏陽(yáng)性菌主要分泌寡肽類（Autoinducing peptides，AIP）信號(hào)分子進(jìn)行種內(nèi)交流。自誘導(dǎo)因子2（Autoinducter-2，AI-2）作為一種菌種間交流信號(hào)分子，存在于革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌中，包括哈維氏弧菌（Vibro harveyi）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）及植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）等[3-5]。感應(yīng)激酶蛋白LuxQ 由周質(zhì)結(jié)合蛋白LuxP 調(diào)控后識(shí)別信號(hào)分子AI-2，AI-2 信號(hào)分子的濃度達(dá)到一定的閾值時(shí)，LuxQ 發(fā)揮磷酸酶的作用，使LuxO 去磷酸化而失去活性，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[6-8]。

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類能將碳水化合物發(fā)酵形成乳酸的革蘭氏陽(yáng)性菌的統(tǒng)稱，具有改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)，延緩機(jī)體衰老等功能[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，多種乳酸菌的基因組序列中都含有l(wèi)uxS基因的同系物，且能夠分泌AI-2 信號(hào)分子，如嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）NCC2705 和糞腸球菌（Enterococcus faecalis）等。AI-2/LuxS 介導(dǎo)的QS 系統(tǒng)參與調(diào)控乳酸菌的抑菌性、耐酸性、黏附性及在動(dòng)物消化道中的定植與存活率等益生特性。張騰等[11]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌（L.plantarum）HE-1 中含有l(wèi)uxS基因，AI-2 信號(hào)分子和生物膜的形成量均是在12 h 開(kāi)始大量產(chǎn)生，18 h 達(dá)到高峰期，AI-2 信號(hào)分子的產(chǎn)量與生物膜的形成量呈正相關(guān)，說(shuō)明AI-2 信號(hào)分子參與調(diào)控其生物膜形成。楊杰[12]研究發(fā)現(xiàn)外源添加AI-2 信號(hào)分子對(duì)植物乳桿菌（L.plantarum）KLDS1.0391 的生長(zhǎng)雖無(wú)明顯影響，但能促進(jìn)細(xì)菌素的形成。姜黎明[13]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌（L.plantarum）AY01 和YM4-3 的AI-2 群體感應(yīng)系統(tǒng)能夠調(diào)控其抑菌、耐酸、耐膽鹽的益生特性。乳酸菌除具有良好的益生特性外，還具備較強(qiáng)的抗氧化能力和產(chǎn)香特性。然而，關(guān)于AI-2/LuxS 群體感應(yīng)系統(tǒng)是否可以調(diào)控乳酸菌的抗氧化活性和產(chǎn)香特性還有待探究。

本文從傳統(tǒng)發(fā)酵食品、鯉魚(yú)腸道等天然環(huán)境中分離產(chǎn)AI-2 信號(hào)分子的乳酸菌，比較高產(chǎn)與低產(chǎn)AI-2 信號(hào)分子的乳酸菌的生物膜形成、抗氧化活性及產(chǎn)香能力的差異，驗(yàn)證AI-2 信號(hào)分子對(duì)它們的調(diào)控作用，進(jìn)而找到AI-2/LuxS 群體感應(yīng)與上述三者之間的關(guān)系，為開(kāi)發(fā)乳酸菌發(fā)酵劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑和儀器

1.1.1 菌株 乳酸菌菌株：16 株乳酸菌DBM2-4、YF-7、YF-10、DF-9、XCT1-7、LJM2-2、LJM1-3、LJ2-2、LJ2-1、LJ3-1、LD1-4、LY2-1、LY1-2-2、L-3、ZHG2-1、ZHG1-4，以上菌株分離自丹東酸面湯（DBM、YF、DF）、葫蘆島酸菜湯（XCT、LJM）、遼寧錦州面團(tuán)（LJM、LJ）、鯉魚(yú)腸道（LD、LY、L）、遼寧彰武酸黃瓜（ZHG），均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

抗氧化陽(yáng)性對(duì)照菌株：鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）ATCC53103，北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

報(bào)告菌株：哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）BB170，通過(guò)哈維氏弧菌BB120 定向突變獲得，菌株BB170 對(duì)AI-2 非常敏感，可以檢測(cè)到極少量的AI-2，并誘導(dǎo)其生物發(fā)光，作為檢測(cè)AI-2 信號(hào)分子的報(bào)告菌株[14]。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 MRS 固體培養(yǎng)基、MRS 肉湯，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；AB 培養(yǎng)基，山東拓普生物工程有限公司；鄰苯三酚、鄰苯二胺、亞硫酸氫鈉，上海麥克林生化科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、PCR 擴(kuò)增引物、DNA marker-D、Taq PCR Master mix，上海生工生物工程有限公司；DPPH，Sigma-Aldrich。

1.1.3 儀器與設(shè)備 Imark 酶標(biāo)儀，美國(guó)BIORAD 公司；UV2550 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津有限公司；HT-ECP3000 高壓電泳儀、HT8300/8500 全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)，北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限公司；Bioscreen C 全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，上海謂載商貿(mào)發(fā)展有限公司；KS50R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；VOSHIN96-IIL 超聲細(xì)胞破碎機(jī)，無(wú)錫沃信儀器制造有限公司；SW-CJ-1D 型超凈工作臺(tái)，蘇州博萊爾凈化設(shè)備。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)AI-2 信號(hào)分子乳酸菌的篩選 培養(yǎng)至2 代的乳酸菌按2.0%接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h 后，于6 000 r/min 離心10 min，棄去菌泥，用0.22 μm 的濾菌器過(guò)濾，得到乳酸菌的無(wú)細(xì)胞上清液。按同樣方法收集30 ℃振蕩培養(yǎng)16 h 的哈維氏弧菌BB170 無(wú)細(xì)胞上清液。

將哈維氏弧菌BB170 按2.0%接種于AB 液體培養(yǎng)基，30 ℃搖床培養(yǎng)至OD595nm為0.8 左右，然后用新鮮的AB 培養(yǎng)基以1∶1 000 稀釋哈維氏弧菌BB170，充分混勻后備用。參照蔡針華等[15]研究方法檢測(cè)其熒光強(qiáng)度值。

1.2.2 產(chǎn)AI-2 信號(hào)分子乳酸菌菌株鑒定 形態(tài)學(xué)：對(duì)1.2.1 節(jié)篩選的高產(chǎn)AI-2 信號(hào)分子的乳酸菌進(jìn)行革蘭氏染色和形態(tài)學(xué)觀察。

生理生化：對(duì)1.2.1 節(jié)篩選的高產(chǎn)AI-2 信號(hào)分子的乳酸菌參考凌代文等[16]的方法進(jìn)行生理生化鑒定。

16S rRNA 序列分析：采用DNA 快速抽提試劑盒提取乳酸菌DNA，以通用引物27F（5'-A GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件參照崔天琦等[17]方法，利用瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，擴(kuò)增成功的產(chǎn)物在上海生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI 中已知菌株序列進(jìn)行比對(duì)，尋找同源性較高的菌株，并利用MEGA5.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 乳酸菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 培養(yǎng)至2 代的乳酸菌按2.0%接種于滅活的MRS 液體培養(yǎng)基中，使用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線儀在OD595nm下每隔3 h 測(cè)定菌密度，確定各菌株的生長(zhǎng)情況。

1.2.4 生物膜形成的測(cè)定 生物膜定量分析：向96 孔板中加入200 μL MRS 液體培養(yǎng)基，將乳酸菌以2.0%接種于培養(yǎng)基中，置于37 ℃分別培養(yǎng)24，48，72 h。棄去上層培養(yǎng)液后，用PBS 清洗2～3次去除浮游細(xì)胞，晾干后，加100 μL 結(jié)晶紫染色20 min，去除染液后用PBS 緩慢沖洗至無(wú)明顯紫色。晾干后加入200 μL 3.0%的冰醋酸脫色，將脫色后的菌液吸入到新的96 孔板中，用酶標(biāo)儀在OD595nm下測(cè)定吸光度值。

生物膜形態(tài)觀察：向放置有硅片（使生物膜黏附于硅片上）的24 孔板中加入1.0 mL MRS 液體培養(yǎng)基，乳酸菌以2.0%接種于培養(yǎng)基中，置于37℃分別培養(yǎng)24，48，72 h。硅片取出用無(wú)菌水清洗2～3 次后，在4 ℃2.5%戊二醛溶液中固定12 h，用無(wú)菌水洗去剩余的戊二醛后用40%，70%，90%，100%乙醇分別脫水15 min，干燥，噴金，掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM）觀察。

1.2.5 產(chǎn)AI-2 信號(hào)分子乳酸菌抗氧化能力測(cè)定乳酸菌連續(xù)活化3 代后獲得的菌懸液在4 ℃，6 000 r/min 離心15 min 后收集菌體，收集的菌體用PBS 緩沖液洗滌2 次后重懸于緩沖液中，調(diào)節(jié)菌液終濃度為108CFU/mL，一部分作為完整細(xì)胞試驗(yàn)，另一部分菌懸液置于0 ℃下超聲破碎（變幅桿：φ6；超聲開(kāi)1 s，超聲關(guān)2 s；功率33%；15 min）后，于4 ℃，6 000 r/min 離心15 min，收集上清為乳酸菌無(wú)細(xì)胞提取物。

取1.0 mL 樣品（完整細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞提取物）加入1.0 mL 0.2 mmol/L DPPH-無(wú)水乙醇溶液，在室溫下避光反應(yīng)30 min，3 500 r/min 離心10 min，在波長(zhǎng)517 nm 下測(cè)定上清吸光度值。清除率按公式（1）計(jì)算，式中，Ai——1.0 mL 樣品加1.0 mL DPPH-無(wú)水乙醇；Aj——1.0 mL 樣品加1 mL PBS；Ac——1.0 mL PBS 加1.0 mL DPPH-無(wú)水乙醇；以LGG 為陽(yáng)性對(duì)照[18]。

超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定：取2.0 mL Tris-HCl 緩沖液（150 mmol/L，pH 8.0）加入0.6 mL 樣品，在25 ℃下水浴預(yù)熱，在加入0.4 mL 25℃水浴預(yù)熱后的鄰苯三酚，25 ℃水浴20 min 后在波長(zhǎng)325 nm 下測(cè)定吸光度值。清除率按公式（2）計(jì)算，式中，A11——含樣品和鄰苯三酚；A10——含樣品，鄰苯三酚以蒸餾水代替；A01——只含鄰苯三酚，A00——不含樣品不含鄰苯三酚。以LGG 為陽(yáng)性對(duì)照[19]。

1.2.6 產(chǎn)信號(hào)分子AI-2 乳酸菌產(chǎn)香能力測(cè)定 發(fā)酵乳的制備和預(yù)處理：培養(yǎng)至3 代的乳酸菌用PBS 緩沖液洗滌2 次后的重懸液（108CFU/mL）按4.0%接于12%無(wú)菌脫脂乳中，37 ℃培養(yǎng)至乳凝固，4 ℃下放置24 h 進(jìn)行后熟。制備好的發(fā)酵乳按1∶1 加入16%三氯乙酸溶液混勻，8 000 r/min 離心10 min，取上清液備用。

丁二酮的測(cè)定：參照俞本杰[20]的研究方法，以不加鄰苯二胺的試管為參比液調(diào)零，在波長(zhǎng)335 nm 下測(cè)定吸光度值。回歸方程y=0.0793x ＋0.0507，R2=0.9952（n=5），計(jì)算出樣品中丁二酮的含量。

乙醛的測(cè)定：參照李妍等[21]的方法，發(fā)酵乳中乙醛含量采用碘滴定法測(cè)定。按公式（3）計(jì)算，式中，V1——空白滴定消耗I2標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；V2——樣品滴定消耗I2標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；C——1/2I2標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mmol/L）；25——乙醛樣品稱樣量（mg）；0.022——乙醛化學(xué)反應(yīng)基本單位（g）。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)結(jié)果均平行測(cè)定3 次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并采用IBM SPSS 23 軟件以及OriginPro 9.1 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)AI-2 信號(hào)分子乳酸菌的篩選

如圖1a 所示，介質(zhì)對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及陰性對(duì)照的熒光強(qiáng)度值均呈先下降后上升的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)槌跗诠S氏弧菌BB170 稀釋液中存在一定量的AI-2 信號(hào)分子，產(chǎn)生一定量的熒光物質(zhì)，然而由于菌體密度較低，熒光會(huì)逐漸被猝滅，導(dǎo)致其熒光值逐漸下降。但經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，菌體密度增加到一定程度后，開(kāi)始產(chǎn)生AI-2 信號(hào)分子并重新誘導(dǎo)菌株發(fā)光，使其熒光強(qiáng)度快速增加。陰性和介質(zhì)對(duì)照的熒光強(qiáng)度在4 h 達(dá)到最低值，后又逐漸增強(qiáng)，而陽(yáng)性對(duì)照在3 h 達(dá)到最低值后逐漸增強(qiáng)，這可能是由于陰性和介質(zhì)對(duì)照沒(méi)有外源添加信號(hào)分子AI-2，只有稀釋液中的哈維氏弧菌BB170 菌體密度增加到一定值后，產(chǎn)生的信號(hào)分子AI-2 重新誘導(dǎo)發(fā)光。本結(jié)果與廉雪花[22]的研究結(jié)果相似，其介質(zhì)對(duì)照和陰性對(duì)照在4 h 達(dá)到最低點(diǎn)，陽(yáng)性對(duì)照在3 h 時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，相對(duì)熒光強(qiáng)度計(jì)算時(shí)間點(diǎn)為4 h。

圖1 高產(chǎn)AI-2 信號(hào)分子乳酸菌的篩選Fig.1 Screening of high-yield AI-2 signal molecule LAB

圖1b 展示了8 株乳酸菌的相對(duì)熒光強(qiáng)度，由圖可知，菌株YF-10、DF-9、L-3 的相對(duì)熒光強(qiáng)度均低于陰性對(duì)照，說(shuō)明其不產(chǎn)生AI-2 信號(hào)分子。其余5 株乳酸菌的相對(duì)熒光強(qiáng)度均高于陰性對(duì)照，具有產(chǎn)AI-2 信號(hào)分子的能力，其中菌株DBM2-4 的相對(duì)熒光強(qiáng)度值最高（P＜0.05），因此，選取高產(chǎn)AI-2 信號(hào)分子菌株DBM2-4 進(jìn)行后續(xù)特性研究。

2.2 乳酸菌菌株鑒定

由圖2 可知，菌株DBM2-4 菌落呈圓形、光滑、乳白色、不透明，可以產(chǎn)生溶鈣圈，且革蘭氏染色呈紫色的桿菌，同時(shí)結(jié)合表1 的生理生化鑒定結(jié)果，該菌株被初步確定為乳酸桿菌。

表1 乳酸菌DBM2-4 的生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical identification results of strain DBM2-4

圖2 菌株DBM2-4 菌落形態(tài)（a）及革蘭氏染色（b）（1 000×）Fig.2 The colony morphology（a）and Gram stain（b）of strain DBM2-4（1 000×）

圖3a 是菌株DBM2-4 的16S rRNA 電泳圖，可以看出片段在1 500 bp 左右，表明該片段擴(kuò)增成功。構(gòu)建的發(fā)育樹(shù)的結(jié)果見(jiàn)圖3b，從圖中可以看出菌株DBM2-4 與Lactiplantibacillus plantarumG2-5-6 最為相似，相似度達(dá)到99%，因此可以確定菌株DBM2-4 為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）。

圖3 菌株DBM2-4 16S rRNA 基因擴(kuò)增電泳圖（a）和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（b）Fig.3 The 16S rRNA gene amplification electrophoresis diagram（a）and phylogenetic tree（b）of strain DBM2-4

2.3 乳酸菌生長(zhǎng)曲線及生物膜的測(cè)定

8 株乳酸菌的生長(zhǎng)曲線如圖4a 所示，菌株LJM2-2、DBM2-4、LJ2-2、LJ2-1、YF-7 的生長(zhǎng)曲線變化趨勢(shì)一致，在3 h 時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在9 h 左右進(jìn)入對(duì)數(shù)末期后進(jìn)入穩(wěn)定期。同時(shí)，結(jié)合5株乳酸菌的相對(duì)熒光強(qiáng)度值，選取菌株YF-7 作為低產(chǎn)AI-2 乳酸菌，比較其與高產(chǎn)AI-2 菌株DBM2-4 在生物膜形成、抗氧化活性和產(chǎn)香能力的差異。

圖4 乳酸菌的生長(zhǎng)曲線（a）、生物膜形成量（b）和形態(tài)結(jié)果（c：DBM2-4；d：YF-7）Fig.4 Growth curve（a），biofilm formation（b）and morphological results（c：DBM2-4；d：YF-7）of LAB

在自然環(huán)境中，細(xì)菌生物膜不僅能抵抗外界環(huán)境的脅迫，而且能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫防御的功能[23]。研究發(fā)現(xiàn)，AI-2/LuxS 能夠調(diào)控乳酸菌生物膜的形成，提高其環(huán)境適應(yīng)能力[24]。圖4b 顯示了產(chǎn)AI-2 能力不同的乳酸菌、在不同時(shí)間產(chǎn)生物膜的能力，由圖可知，高產(chǎn)和低產(chǎn)AI-2 乳酸菌的生物膜形成量均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。其中，高產(chǎn)AI-2 菌株DBM2-4 在24，48，72 h 3 個(gè)時(shí)間段的生物膜形成量比菌株YF-7 分別高出85.48%，135.54%，63.03%，且在48 h 時(shí)生物膜形成能力差異最顯著（P＜0.05）。圖4c 和圖4d 分別是菌株DBM2-4 和YF-7 生物膜在24，48，72 h 3個(gè)時(shí)間段的掃描電鏡圖，由圖可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)菌株DBM2-4 形成的生物膜變得更加致密，厚度也逐漸增加。與DBM2-4 相比YF-7 形成的生物膜比較分散，這會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌形成的生物膜不牢固。這與吳榮[25]研究的結(jié)果相似，外源添加60 μmol/L AI-2 信號(hào)分子菌體與未添加AI-2 信號(hào)分子相比表面更加平整，菌膜更加光滑，分布更加密集，并且對(duì)生物膜的形成也有一定的促進(jìn)作用。因此，說(shuō)明群體感應(yīng)AI-2 信號(hào)分子正向調(diào)控乳酸菌生物膜的形成。

2.4 乳酸菌抗氧化能力

DPPH 是一個(gè)穩(wěn)定的自由基，常被用來(lái)評(píng)價(jià)菌株的抗氧化能力。圖5a 是以DPPH 為指標(biāo)比較產(chǎn)AI-2 能力不同乳酸菌的抗氧化能力，結(jié)果表明，3 株乳酸菌的DPPH 自由基清除率均是完整細(xì)胞的高于無(wú)細(xì)胞提取物的，這可能是因?yàn)槿樗峋陌饣钚晕镔|(zhì)如表面蛋白、胞外多糖等具有清除DPPH 自由基作用的結(jié)果[26]。與低產(chǎn)AI-2 的菌株YF-7 相比，高產(chǎn)菌株DBM2-4 完整細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞提取物的DPPH 自由基清除能力提高了24.49%和11.37%，且DBM2-4 的DPPH 自由基的清除率高于LGG 陽(yáng)性對(duì)照，而YF-7 略低于LGG陽(yáng)性對(duì)照。說(shuō)明AI-2 信號(hào)分子可以調(diào)節(jié)乳酸菌表面蛋白、胞外多糖等活性物質(zhì)，進(jìn)而起到清除DPPH 自由基的作用。

圖5 乳酸菌清除DPPH 自由基（a）和超氧陰離子能力（b）Fig.5 The scavenging ability of DPPH free radicals（a）and superoxide anions（b）by LAB

此外，許多自由基是以超氧陰離子（O2-）為前體物質(zhì)通過(guò)一系列的反應(yīng)得到的，超氧陰離子能夠損害細(xì)胞進(jìn)而引發(fā)一系列的氧化反應(yīng)[27]。圖5b以超氧陰離子為指標(biāo)比較產(chǎn)AI-2 不同的乳酸菌的抗氧化能力，結(jié)果表明，3 株乳酸菌的超氧陰離子清除率均是無(wú)細(xì)胞提取物的高于完整細(xì)胞的，這是因?yàn)榇蟛糠值目寡趸溉绯趸锲缁福⊿OD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）存在于細(xì)胞內(nèi)[28]。而菌株DBM2-4 與YF-7 的超氧陰離子的清除率沒(méi)有顯著性差異。說(shuō)明AI-2 信號(hào)分子對(duì)乳酸菌胞內(nèi)的SOD、GSH-Px 等抗氧化酶沒(méi)有顯著的調(diào)節(jié)作用，使得超氧陰離子的清除率差異不顯著。

乳酸菌的DPPH 自由基清除作用主要依靠其胞外的多糖和蛋白等物質(zhì)，而清除超氧陰離子的能力取決于胞內(nèi)SOD、GSH-Px 等抗氧化酶，研究結(jié)果表明，AI-2 信號(hào)分子可以調(diào)節(jié)乳酸菌胞外表面蛋白、多糖等活性物質(zhì)，對(duì)乳酸菌胞內(nèi)的SOD、GSH-Px 等抗氧化酶沒(méi)有顯著的調(diào)節(jié)作用，該研究結(jié)果與AI-2/LuxS 群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控乳酸菌胞外代謝產(chǎn)物相一致[11-12]。

2.5 丁二酮及乙醛含量測(cè)定

優(yōu)良的乳酸菌發(fā)酵劑需要具有抗氧化特性還應(yīng)具有較好的產(chǎn)香特性，丁二酮和乙醛作為特征性風(fēng)味物質(zhì)，能夠改善發(fā)酵乳的風(fēng)味及提升產(chǎn)品品質(zhì)[29-30]。從表2 可得出菌株DBM2-4 的丁二酮和乙醛的產(chǎn)量均高于菌株YF-7，產(chǎn)量分別高出3.88 mg/L 和5.86 mg/L。因此，說(shuō)明AI-2 信號(hào)分子能夠增加乳酸菌產(chǎn)生丁二酮和乙醛特征性風(fēng)味物質(zhì)的能力。本結(jié)果與李妍等[21]研究的乳酸菌菌株的丁二酮和乙醛含量測(cè)定結(jié)果相似，其中丁二酮含量在7.19～39.21 mg/L，乙醛含量在9.65～20.03 mg/L。

表2 乳酸菌中丁二酮和乙醛含量Table 2 The content of diacetyl and acetaldehyde in lactic acid bacteria

3 結(jié)論

本文從丹東酸湯面中獲得1 株高產(chǎn)AI-2 信號(hào)分子的植物乳桿菌DBM2-4。與低產(chǎn)AI-2 菌株YF-7 相比，植物乳桿菌DBM2-4 培養(yǎng)48 h 后，生物膜形成量增加了135.54%；其完整細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞提取物DPPH 自由基清除能力分別提高了24.49%和11.37%，香味物質(zhì)丁二酮和乙醛產(chǎn)量分別增加了3.42 mg/L 和5.86 mg/L。上述結(jié)果表明AI-2/LuxS 群體感應(yīng)系統(tǒng)介導(dǎo)乳酸菌生物膜形成、抗氧化活性及產(chǎn)香能力。本研究為開(kāi)發(fā)具有高生物活性產(chǎn)AI-2 信號(hào)分子的乳酸菌發(fā)酵劑提供一定的理論基礎(chǔ)。