屈巖峰，于殿宇

（1 哈爾濱學(xué)院 哈爾濱 150086 2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱 150030 3 九三糧油工業(yè)集團有限公司 哈爾濱 150090 4 屈巖峰高技能人才（勞模）創(chuàng)新工作室 哈爾濱 150086）

玉米赤霉烯酮（ZEN）是一種著名的F2毒素，由鐮刀菌產(chǎn)生[1-2]，主要污染玉米、小麥、大麥、燕麥等谷物及其制品，是世界上分布最廣泛的霉菌毒素之一[3-5]，不僅影響食品安全，而且在食物鏈中積累，對動物甚至人類造成嚴重傷害[6-7]。

目前ZEN 的脫除方法主要有物理[8]、化學(xué)[9]和生物法[10]，以削除或削弱其中毒性。然而，物理和化學(xué)方法具有選擇性弱、成本高、不可回收等缺點[11]。生物酶法由于具有低毒、高效的優(yōu)點，因此過氧化物酶如辣根過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶的氧化降解被認為是一種潛在環(huán)保的方法[12]。辣根過氧化物酶（HRP）是一種血紅素酶，具有易得和高比活性的優(yōu)點，在過氧化氫作用下，能夠催化氧化多種化合物[13]，如芳香胺化合物、酚類化合物、吲哚類和有毒物質(zhì)的催化氧化[14]。Sabrina 等[15]利用從米糠中提取并純化的辣根過氧化物酶，成功應(yīng)用于嘔吐毒素的降解。然而，游離酶具有在高溫和強酸堿條件下容易失活，重復(fù)使用性低，應(yīng)用條件苛刻等問題，嚴重制約了其廣泛使用。

固定化是克服以上問題的常用方法。近幾年，酶的固定化被廣泛應(yīng)用于生物催化中，酶經(jīng)過固定化后，有效提高了酶的熱穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，拓寬了pH 使用范圍。Mirjana 等[16]將辣根過氧化物酶固定在生物炭上，用于去除水中的苯酚，洗滌4 次后，辣根過氧化物酶的活性保持在79%以上。二氧化硅因較小的擴散限制，較高的單位質(zhì)量表面積和酶負載能力，故常作為固定化酶的載體[17]。近期，具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性納米粒子被廣泛作為載體并應(yīng)用于生物催化劑。磁性載體具有超順磁性，磁響應(yīng)強，毒性低等優(yōu)勢，可實現(xiàn)快速分離和回收。Reza 等[18]將漆酶共價固定在核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4-SiO2，并將其作為高效非均相催化劑，成功應(yīng)用于芝麻油中酚類物質(zhì)的生物降解，降解效率為74.5%。

磁性納米粒子在長期使用過程中可能會發(fā)生聚集或沉淀，可以通過修飾表面的化學(xué)基團的方法來提高其生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性。一種有效的方法是用親水聚合物，如聚丙烯酸、聚酰胺酸和超支鏈聚甘油（HPG）改性到納米粒子表面。HPG是具有高度支化結(jié)構(gòu)的高分子材料，屬于第4 代生物相容性聚合物，含有大量的活性羥基，良好的水溶性和易用性[19]。近幾年，羧基化磁性載體被廣泛應(yīng)用于酶的固定化，羧基可與酶上的氨基共價結(jié)合，解決了傳統(tǒng)固定化方法的固定化位點隨機，固定化后酶活性大幅降低的問題。Kazenwadel等[20]將葡萄糖氧化酶的-NH2定向固定化在經(jīng)過EDC 活化的磁性載體上，制備的定向固定化酶相對酶活力比非定向固定化酶高36%。

本試驗將制備的Fe3O4-SiO2-HPG-COOH 作為載體，并將HRP 共價固定在磁性納米顆粒上，對固定化酶進行表征分析，應(yīng)用于ZEN 的降解，并測試固定化HRP 的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，以ZEN 降解效率為指標，研究固定化HRP 對模型溶液中ZEN 的降解作用。利用單因素實驗確定反應(yīng)溫度、溶液pH 值、過氧化氫濃度、反應(yīng)時間等最佳條件，為連續(xù)性去除ZEN 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣根過氧化物酶（HRP，酶代碼EC 1.11.1.7，酶活性＞300 units/mg），上海麥克林生化科技有限公司；ZEN 標準品（純度＞99%）、縮水甘油、愈創(chuàng)木酚、乙二醇、FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、丁二酸酐、H2O2（30%），甲醇鉀（CH3OK），氨水（NH3·H2O），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），美國Sigma-Aldrich 公司；乙腈（色譜級），甲醇（色譜級），氯仿（色譜級），其它化學(xué)試劑均為分析純級，無需進一步純化即可使用。

1.2 儀器與設(shè)備

AXTD5A 型臺式離心機，鹽城市安信實驗儀器有限公司；MixPlus 型旋渦震蕩器，合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；SB25-12DT 型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；MTN-28000D型氮吹濃縮裝置，天津奧德賽恩斯儀器有限公司；TQZ-312 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海精宏有限公司；Agilent-7104 型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；F-7100 型熒光檢測器，日本日立公司；BRUKERTENSOR-27 型紅外光譜儀，德國布魯克公司；JSM-6610 型掃描電子顯微鏡，日本島津公司；NANOPHOX 型振動樣品磁強計，美國MicroSense 公司；Siemens D5005 型X 射線衍射儀，美國FEI 公司；CJB-DS 型數(shù)顯定時磁力攪拌器，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；HYL-1076 型激光粒度分布儀，丹東市皓宇科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 Fe3O4-SiO2的HPG 活化與羧基修飾 按照Deng 等[21]的方法制備Fe3O4-SiO2磁性納米粒子，并稍作修改。將Fe3O4-SiO2進行HPG 活化，具體步驟如下：將0.1 g Fe3O4-SiO2加入30 μL CH3OK和2.5 mL 二甲基酰胺溶液中，在50 ℃，100 r/min條件下攪拌反應(yīng)1 h，加入10 mL 無水二氧六環(huán)，于95 ℃反應(yīng)，然后緩慢向溶液中滴加2.0 g 縮水甘油，并將混合物保持攪拌4 h，加入甲醇分散，利用磁鐵分離，用甲醇反復(fù)沖洗，得到的固體顆粒在真空烘箱中干燥12 h。接著用琥珀酸酐修飾Fe3O4-SiO2-HPG，將0.1 g Fe3O4-SiO2-HPG 加入100 mg 三乙胺和10 mL 二甲基甲酰胺混合溶液中，加入70 mL 丁二酸酐，將該混合體系在氮氣氣氛及黑暗中攪拌5 h。隨后，通過施加外部磁鐵收集產(chǎn)物，并用甲醇沖洗3 次。固體物質(zhì)在真空干燥箱中干燥12 h[22]。

1.3.2 辣根過氧化物酶的固定化 取1 g 上述制備好的載體在50 mL PBS 緩沖溶液（100 mmol/L）中浸泡24 h，磁分離后，緩慢加入25 mg/mL 的EDC，在溫度50 ℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min 的條件下攪拌2 h。再加入400 U/mL HRP 溶液。隨后以50 r/min 的轉(zhuǎn)速在45 ℃下攪拌，反應(yīng)5 h 后，利用磁鐵分離收集納米顆粒。用磷酸鹽緩沖溶液洗滌固定化HRP 除去未結(jié)合的酶，得到的固定化酶在4 ℃條件下貯藏備用。

1.3.3 載體表征方法

1.3.3.1 掃描電子顯微鏡（SEM）參考蘇鵬飛等[23]的方法。取適量樣品粉末，經(jīng)過凍干后分散在導(dǎo)電膠上，經(jīng)過真空條件對樣品進行鍍金處理，利用日本島津公司生產(chǎn)的JSM-6610 進行掃描電鏡觀察磁性樣品固定化前、后的形貌變化。

1.3.3.2 傅里葉紅外光譜分析（FTIR）參考Fang等[24]的方法使用蒸餾水洗滌樣品，放在55 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，使用研缽將干燥后的200 mg KBr 粉末和2 mg 上述制備的樣品（200 ℃下脫水處理24 h）混合研磨均勻，在10 kPa 的壓力下將其制成1 mm 厚，直徑為13 mm 的透明薄片，使用紅外光譜儀在室溫（25 ℃）條件下，于400～4 000 cm-1波長范圍內(nèi)掃描32 次收集樣品光譜信息。

1.3.3.3 X-射線衍射分析（XRD）參照馬云輝等[25]的方法預(yù)先將樣品在55 ℃真空烘干至恒重，研磨100 mg 樣品制成粉末后壓成平面，X 射線衍射儀在Cu 靶，Ni 濾波，Si-Li 探測器，40 kV×40 mA，掃描范圍：15～80°，掃描速度：2°/min，測試制得的磁性載體和磁酶顆粒內(nèi)分子排列結(jié)構(gòu)。

1.3.3.4 粒徑分析 參照Xia 等[26]的方法，取適量上述制備的樣品放在容器中，使用乙醇作為分散劑，超聲10 min 進行分散，將分散均勻的樣品放入激光衍射儀中進行檢測。

1.3.3.5 磁性能 參照李梅基[27]的方法，將上述制備的磁性載體和磁性固定化酶以比飽和磁化強度作為磁強度檢測的指標，分析樣品的磁性能。熱封住一段7 mm 帶棉簽的塑料管的一端，將樣品壓實在其中，用棉花將另一端塞住。通過振蕩樣品磁強計進行測定。

1.3.4 酶活力的測定 按照Tonami 等[28]的方法測定辣根過氧化物酶的催化活性，并計算酶的相對活性。用紫外可見分光光度計在波長510 nm 處測定酶活性。一個酶活力單位表示為：30 ℃時1 min 催化氧化1 μmol 愈創(chuàng)木酚所消耗的酶量。

1.3.5 酶學(xué)特性的研究 研究了不同溫度和pH值條件下游離酶和固定化酶活性的差異。以溫度為影響因素，在最適pH 值的條件下，將游離酶和固定化酶分別在不同溫度下（20，30，40，50，60℃）貯藏1 h。溶劑為磷酸鹽緩沖溶液（100 mmol/L，pH 7.0），得到了不同溫度下酶活性的效應(yīng)曲線；以pH 值為影響因素，在最適溫度下，在不同pH值（4～8）的磷酸鹽緩沖液（100 mmol/L）中進行酶活性試驗，得到不同pH 值下酶活性的效應(yīng)曲線。

1.3.6 固定化酶降解ZEN 的單因素實驗 首先用乙腈制備質(zhì)量濃度為500 μg/mL 的ZEN 作為儲備溶液。然后用乙腈梯度稀釋至一定濃度，在-20 ℃避光保存。為實現(xiàn)ZEN 的高效降解，對反應(yīng)條件（反應(yīng)溫度、溶液pH 值、過氧化氫濃度、反應(yīng)時間）進行優(yōu)化。具體操作如下：將磷酸鹽緩沖液（100 mmol/L）、水和一定濃度的過氧化氫組成模型溶液，將ZEN 標準溶液在氮氣氣氛中蒸發(fā)溶劑，然后與模型溶液渦旋攪拌30 s 并超聲3 min使其完全溶解，攪拌后加入0.6 U/mL 的固定化酶。將模型溶液置于TQZ-312 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，在150 r/min 的軌道攪拌下反應(yīng)，分別選取反應(yīng)溫度25，30，35，40，45 ℃，過氧化氫濃度13，26，39，52，65 mmol/L，溶液pH 值4.0，5.0，6.0，7.0，7.5，反應(yīng)時間0，30，60，90，120，150，210，320，480，1 440 min，研究對ZEN 降解率的影響。

反應(yīng)結(jié)束后通過磁鐵分離固定化酶來終止反應(yīng)，用0.5 mL 氯仿加入到1 mL 樣品中，并渦旋攪拌2 min，用氯仿重復(fù)萃取3 次，每次收集有機相。然后超聲20 min，將樣品中的氯仿用氮吹儀吹干，并用1 mL 乙腈復(fù)溶，經(jīng)過0.45 μm 有機濾膜過濾，溶液通過高效液相色譜熒光檢測器（HPLCFL）進行檢測和定量。測定不同條件下ZEN 的降解率，所有試驗重復(fù)3 次。

ZEN 的脫除效率E（%）通過公式（2）計算：

式中，Zi——反應(yīng)溶液中ZEN 的初始質(zhì)量濃度（μg/mL）；Zf——反應(yīng)溶液ZEN 的最終質(zhì)量濃度（μg/mL）。

1.3.7 ZEN 檢測和方法驗證 ZEN 含量測定參考《食品安全國家標準-食品中玉米赤霉烯酮的測定》（GB 5009.209-2016）[29]并稍作修改，利用HPLC-FL 測定樣品中ZEN 含量。

色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 柱，柱長100 mm×4.6 mm；流動相：乙腈∶甲醇∶水（46∶46∶8，V/V）；流動相流速：1 mL/min；進樣量：10 μL，柱溫：35 ℃；運行時間：7 min；熒光檢測器的激發(fā)波長：270 nm，發(fā)射波長：455 nm。ZEN 測定的驗證參數(shù)為線性度、分析曲線、相關(guān)系數(shù)、檢測限（LD）、定量限（LQ）和精度。

1.3.8 固定化酶的可重復(fù)使用性 為考察固定化酶的可重復(fù)性，對酶活性進行7 次重復(fù)測定。每次借助外部磁鐵得到固定化酶，然后用去離子水和磷酸鹽緩沖液（100 mmol/L，pH 7.0）洗滌3 次，以去除反應(yīng)中留下的溶液，根據(jù)上述最佳方法測量酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗一式三份，結(jié)果表示為“平均值±標準偏差”。數(shù)據(jù)采用Origin 2018 進行分析和繪制。使用SPSS 26.0 進行方差分析，并進行Duncan's test（P＜0.05）以評估數(shù)據(jù)差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米復(fù)合材料的表征

2.1.1 FTIR 分析 Fe3O4-SiO2、Fe3O4-SiO2-HPGCOOH、Fe3O4-SiO2-HPG-COOH-HRP、HRP 的 傅里葉紅外光譜如圖1 所示，575 cm-1處的譜帶對應(yīng)于Fe3O4中Fe-O 的伸縮振動，3 420 cm-1處為-OH 的吸收峰，證明Fe3O4組分存在，這和Feng等[30]的研究一致。799 cm-1和1 089 cm-1處分別為Si-OH 和Si-O-Si 的對稱和不對稱伸縮振動吸收峰，說明SiO2包覆良好。經(jīng)過超支化聚合后，曲線（b）中2 860 cm-1和2 927 cm-1處出現(xiàn)了HPG 的亞甲基的吸收峰，證明HPG 已成功改性。并且在1 730 cm-1處出現(xiàn)了羧基中C=O 的吸收峰，證明羧基已經(jīng)成功修飾到載體表面。

圖1 樣品的FTIR 光譜圖像Fig.1 The FTIR spectra of the samples

曲線（d）中2 959 cm-1處的條帶代表了HRPNH2的拉伸振動。在1 655 cm-1和1 310 cm-1處的特征峰與酰胺I 和酰胺II 振動的拉伸帶有關(guān)。辣根過氧化物酶固定在Fe3O4-SiO2-HPG-COOH 后，曲線（c）在1 393 cm-1處出現(xiàn)較弱的酰胺特征峰，表明HRP 成功固定在載體上，這和Basem 等[31]的研究一致。

2.1.2 XRD 分析 Fe3O4-SiO2、Fe3O4-SiO2-HPGCOOH 和Fe3O4-SiO2-HPG-COOH-HRP 的XRD譜如圖2 所示。3 種納米粒子的衍射峰位置和強度結(jié)果都與粉末衍射標準聯(lián)合委員會數(shù)據(jù)庫（JCPDS-19-0629）的標準數(shù)據(jù)相一致，分別在30°，36°，42.5°，53.5°，57.3°，62.7°出現(xiàn)尖銳的特征峰。該現(xiàn)象證明3 種磁性納米粒子均含有Fe3O4。同時也表明在包覆SiO2、改性及固定化HRP 的過程中，納米粒子的晶型依然保持穩(wěn)定，然而由于改性劑和酶涂層具有一定厚度，樣品的結(jié)晶度略有降低[32]。

圖2 樣品的XRD 圖Fig.2 XRD images of the samples

2.1.3 SEM 分析 如圖3a 所示，合成的Fe3O4-SiO2納米粒子為球形，粒徑一般在90～120 nm 左右，表面較為光滑，分散性略差，這與二氧化硅表面存在羥基有關(guān)，羥基之間的氫鍵作用降低了納米粒子之間的分散性。圖3b 為Fe3O4-SiO2-HPGCOOH 載體的表面形態(tài)，從圖中可以看出載體分散情況較好，有少數(shù)團聚現(xiàn)象，這可能是由于磁性Fe3O4-SiO2--HPG-COOH 復(fù)合載體表面引入了羧基；具有較為均一的粒徑，載體表面較為粗糙且凹凸不平，磁性載體的表面積增大，有利于固定化。由圖3c 所示，HRP 經(jīng)固定化后部分發(fā)生團聚[33]，這可能是由于固定化過程中載體與酶的交聯(lián)作用，而整體仍保持良好的分散性，有利于固定化酶和底物發(fā)生反應(yīng)。

圖3 樣品的SEM 圖像Fig.3 SEM images of the samples

2.1.4 磁性能 Fe3O4-SiO2、磁性Fe3O4-SiO2-HPG-COOH 復(fù)合載體、磁性固定化HRP 的磁性性能如圖4 所示，F(xiàn)e3O4-SiO2的飽和磁強度為（31.70±0.60）emu/g，而磁性復(fù)合Fe3O4-SiO2-HPGCOOH 載體和磁性固定化HRP 的飽和磁強度分別為（25.80±0.60）emu/g 和（24.60±0.80）emu/g。3種磁性納米顆粒剩磁和矯頑力均為0，磁滯回歸線呈現(xiàn)“S”型，符合閉合的特征均具有超順磁性[34]。結(jié)果表明Fe3O4-SiO2經(jīng)過改性和固定化HRP 后，其飽和磁化值略有降低，而負載酶后仍可以在外加磁場下被很好的磁化，在反應(yīng)體系中均可以被快速而簡單的分離出來。

圖4 樣品的磁性能分析Fig.4 Analysis of magnetic properties of samples

2.1.5 粒徑分析 磁性復(fù)合載體和磁性固定化HRP 的粒徑測定結(jié)果如圖5 所示。由圖5a 可知，磁性Fe3O4-SiO2-HPG-COOH 復(fù)合載體平均粒徑為（103.15±1.90）nm，分布范圍為79.40～118.88 nm，粒徑均較小，且分布范圍較窄，較小的粒徑有利于提高固定化酶的比表面積，有利于酶和底物的接觸，促進反應(yīng)的進行[35]。由圖5b 可知，磁性固定化HRP 的粒徑分布是均勻的，粒徑分布范圍為93.02～131.03 nm，平均粒徑為（109.20±1.10）nm。酶經(jīng)固定化后平均粒徑增大，粒徑分布也向右移動，粒徑變化表明HRP 已經(jīng)成功負載到磁性載體上。

圖5 樣品的粒徑分析Fig.5 Particle size analysis of samples

2.2 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.1 最適溫度 溫度對游離和固定化酶活性的影響如圖6 所示。游離酶的最適溫度為30 ℃，經(jīng)固定化后溫度轉(zhuǎn)移到35 ℃，酶是一種蛋白質(zhì)，高溫可導(dǎo)致酶失活。從圖中可知，當(dāng)溫度超過30 ℃時，游離HRP 的活性急劇下降，而固定化HRP 的活性則緩慢下降。固定化HRP 的最適溫度較游離酶高，主要是由于酶與磁性載體共價結(jié)合后，降低了HRP 分子的運動活性，以及構(gòu)象的自由變化[36]，因此固定化酶比游離酶具有更好的熱穩(wěn)定性。

圖6 游離酶和固定化酶的最適溫度Fig.6 Optimal temperature for the free and immobilized enzymes

2.2.2 最適pH pH 對游離和固定化辣根過氧化物酶相對活性的影響如圖7 所示。從圖中可以看出，當(dāng)酸性或堿性過強時，游離酶和固定化酶的相對活性降低。在pH 值為6.5 和7.0 時，游離酶和固定化酶表現(xiàn)出最大的催化活性。與pH 值為6.5 和7.0 相比，pH 值為8 時，游離HRP 和固定HRP 的最大活性分別顯著降低了約30%和10%。酶在磁性載體上固定后，固定化HRP 在更寬的pH 值范圍內(nèi)表現(xiàn)出更高的酶活性，這是因為固定化酶對酶的構(gòu)象有一定限制，從而保護了酶的空間結(jié)構(gòu)，此結(jié)論與Clarissa 等[37]的研究一致。

圖7 游離酶和固定化酶的最適pHFig.7 Optimal pH for the free and immobilized enzymes

2.3 固定化辣根過氧化物酶降解模型溶液中ZEN 單因素實驗結(jié)果

2.3.1 反應(yīng)溫度對玉米赤霉烯酮降解率的影響 模型溶液中固定化酶添加量為0.6 U/mL，過氧化氫濃度為26 mmol/L，溶液pH 值為7.0，反應(yīng)時間為480 min 的條件下，反應(yīng)溫度對ZEN 降解率的影響見圖8。

圖8 反應(yīng)溫度對ZEN 降解率的影響Fig.8 Effect of temperature on the degradation of ZEN

如圖8 所示，ZEN 降解率隨著溫度的升高呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)溫度在25～35 ℃時，ZEN降解率隨著溫度的升高而增大，這是因為溫度升高使得自由能水平增加而導(dǎo)致反應(yīng)活化能降低，從而增大降解效率[38]，當(dāng)溫度為35 ℃時，降解率最高為64.35%。當(dāng)溫度超過35 ℃后，隨著反應(yīng)溫度的升高，ZEN 的降解率反而下降，這是由于溫度過高導(dǎo)致酶部分發(fā)生變性，因此選擇模型溶液溫度為35 ℃。

2.3.2 過氧化氫濃度對玉米赤霉烯酮降解率的影響 模型溶液中固定化酶添加量為0.6 U/mL，反應(yīng)溫度為35 ℃，溶液pH 值為7.0，反應(yīng)時間為480 min 的條件下，過氧化氫濃度對ZEN 降解率的影響見圖9。

圖9 過氧化氫濃度對ZEN 降解效率的影響Fig.9 Effect of hydrogen peroxide concentration on the degradation of ZEN

如圖9 所示，隨著過氧化氫濃度的增加，ZEN降解率呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)過氧化氫濃度為26 mmol/L 時，ZEN 降解率最高為65.67%。當(dāng)過氧化氫濃度超過26 mmol/L 后，ZEN 降解率逐漸下降。過氧化氫促使酶促反應(yīng)過程中產(chǎn)生過氧化物酶中間體，然而當(dāng)過氧化氫濃度過高時，過氧化氫可以通過氧化或破壞HRP 的天然構(gòu)象而使酶失去活性[39]，因此模型溶液中過氧化氫最佳濃度為26 mmol/L。

2.3.3 溶液pH 值對玉米赤霉烯酮降解率的影響模型溶液中固定化酶添加量為0.6 U/mL，反應(yīng)溫度為35 ℃，過氧化氫濃度為26 mmol/L，反應(yīng)時間為480 min 的條件下，溶液pH 值對ZEN 降解率的影響見圖10。

圖10 溶液pH 值對ZEN 降解效率的影響Fig.10 Effect of solution pH value on the degradation of ZEN

如圖10 所示，ZEN 的降解效率隨溶液pH 值的變化趨勢為先快速升高后趨于平穩(wěn)。當(dāng)pH 值小于7.0 時，ZEN 降解率隨溶液pH 值的增加而顯著升高；當(dāng)溶液pH 值為7.0 時，ZEN 的降解率最高為63.96%，隨溶液pH 值繼續(xù)增加，ZEN 降解率趨于穩(wěn)定，并沒有顯著變化。造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于pH 值的變化會影響酶的相對活性和酶活性中心氨基酸鏈的電離形式，繼續(xù)增加pH值會導(dǎo)致固定化酶的活性降低[40]，因此模型溶液的最佳pH 值為7.0。

2.3.4 反應(yīng)時間對玉米赤霉烯酮降解率的影響 模型溶液中固定化酶添加量為0.6 U/mL，反應(yīng)溫度為35 ℃，過氧化氫濃度為26 mmol/L，溶液pH 值為7.0 的條件下，反應(yīng)時間對ZEN 降解率的影響見圖11。

圖11 反應(yīng)時間對ZEN 降解率影響Fig.11 Effect of reaction time on the degradation of ZEN

由圖11 所示，當(dāng)反應(yīng)時間小于480 min 時，隨著反應(yīng)時間的延長，ZEN 降解率呈逐漸升高的趨勢，在480 min 后降解率最高為67.37%，磁性固定化HRP 與ZEN 幾乎達到完全反應(yīng)。隨著反應(yīng)時間持續(xù)延長，酶解反應(yīng)達到平衡，ZEN 降解率的變化較小，降解率趨于平衡可能是由于反應(yīng)產(chǎn)物對酶反應(yīng)產(chǎn)生抑制或部分酶發(fā)生失活，繼續(xù)增大反應(yīng)時間并不能取得更好的結(jié)果，因此固定化HRP 降解ZEN 的最佳時間為480 min。

2.4 重復(fù)使用性

與游離酶相比，固定化酶可以通過施加外部磁場使其很容易的從反應(yīng)溶液中分離。如圖12 所示，酶的相對活性隨使用次數(shù)增加呈下降趨勢。重復(fù)使用5 次后，HRP 的相對活性仍保持了79.85%的催化活性。酶活性減少的原因可能是由于酶經(jīng)過反復(fù)洗滌，不可避免的導(dǎo)致了酶從載體上部分脫落[41]。此外，酶的活性中心附近反應(yīng)產(chǎn)物的增加，也會導(dǎo)致酶活性降低。由此可知，HRP 經(jīng)過固定化后，具有良好的重復(fù)使用性。

圖12 固定化HRP 的重復(fù)使用性Fig.12 Reusability of immobilized HRP

2.5 液相色譜分離譜圖

采用高效液相色譜法對反應(yīng)溶液進行分析，ZEN 的液相色譜圖如圖13 所示，圖13a 表示ZEN標準溶液質(zhì)量濃度為2 μg/mL 時的色譜圖，ZEN的出峰時間為1.2 min。如圖13b 所示，經(jīng)固定化HRP 酶解后，ZEN 的含量明顯下降，并在1.0 min附近出現(xiàn)了新的峰。結(jié)果表明，在過氧化氫的存在下，過氧化物酶可以有效催化ZEN 的降解。由于ZEN 的檢測和定量濃度較低，為了確保精確的結(jié)果，使用的高效液相色譜結(jié)合熒光檢測器檢測ZEN 定量方法的驗證參數(shù)見表1，結(jié)果表明，曲線方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.9982，其值可用于微量元素的分析。因此，經(jīng)過驗證該方法可以可靠地用于監(jiān)測模型溶液中HRP 對ZEN 的降解作用。

表1 HPLC-FL 評價ZEN 分析方法的驗證參數(shù)Table 1 Validation parameters of the analytical method evaluated in HPLC-FL for ZEN detection

圖13 ZEN 標準品（a）和酶解產(chǎn)物（b）的色譜圖Fig.13 Chromatograms of ZEN standard（a）and enzymolysis product（b）

3 結(jié)論

本試驗提供了一種降低ZEN 的方法，將游離HRP 共價固定在磁性復(fù)合載體Fe3O4-SiO2-HPGCOOH 上，酶與磁性載體結(jié)合后，平均粒徑為納米級，呈現(xiàn)超順磁性。固定化酶的pH 耐受性和熱穩(wěn)定性均高于游離酶。ZEN 降解試驗表明在固定化酶濃度為0.6 U/mL，反應(yīng)溫度為35 ℃，過氧化氫濃度為26 mmol/L，溶液pH 值為7.0，反應(yīng)時間為480 min 的最優(yōu)條件下，ZEN 降解效率為68%，高效液相色譜顯示經(jīng)磁性固定化HRP 處理后模型溶液ZEN 含量明顯降低。磁性固定化HRP 具有良好的重復(fù)使用性，經(jīng)5 次循環(huán)后，固定化HRP的相對活性仍較高。本試驗研究表明磁性固定化HRP 可實現(xiàn)對模型溶液中ZEN 的有效降解，為促進HRP 在真菌毒素降解中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。