徐 康，王遠(yuǎn)興

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330047）

豆粕為一種植物源蛋白，具有高濃度的蛋白質(zhì)和適宜的氨基酸比例，有著很高的開發(fā)利用價(jià)值[1-2]。目前，豆粕主要作為飼料直接喂養(yǎng)動(dòng)物，其中的大豆抗原蛋白和抗?fàn)I養(yǎng)因子，大大限制了動(dòng)物對(duì)豆粕蛋白的消化吸收[3]。酶解豆粕克服了豆粕本身的缺陷，提高了蛋白質(zhì)的消化率，降低其過敏性，并能生產(chǎn)出功能特性更好的大豆小肽。大豆小肽主要由3～6 個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量約1 000 u，主要分布在300～700 u 范圍，除易吸收外[4]，還具有調(diào)節(jié)血壓[5]，抑制慢性腎病[6]，免疫調(diào)節(jié)[7]，抗癌活性[8]，抗菌、抗病毒[9]，改善腸道微生物活性[10]，降低膽固醇和抗糖尿病[11]等生物活性。

酶解蛋白質(zhì)已被廣泛利用，與酸解和堿解等方式相比，酶解不僅反應(yīng)溫和，而且具有很強(qiáng)的特異性[12]?，F(xiàn)有研究主要以液態(tài)酶解豆粕肽為主，對(duì)半固態(tài)酶解豆粕的工藝鮮有報(bào)道。半固態(tài)酶解豆粕通過加入適當(dāng)?shù)乃苟蛊梢怨虘B(tài)存在，通過調(diào)節(jié)溫度、時(shí)間、加酶量等條件優(yōu)化酶解工藝[13]。半固態(tài)酶解相對(duì)于液態(tài)酶解來說，半固態(tài)酶解豆粕易于烘干，有利于豆粕飼料的規(guī)模性生產(chǎn)。酶水解程度通常以水解度來量化，它表示被切割的肽鍵與初始肽鍵數(shù)的百分比。然而，水解度并不能完全反映酶水解情況，需以小肽含量和肽段長(zhǎng)度共同判斷[14-15]。

本試驗(yàn)以豆粕為原料，以豆粕水解度、豆粕肽含量、小肽分子質(zhì)量和疏水值為半固態(tài)酶解的重要指標(biāo)，篩選適合半固態(tài)酶解的蛋白酶，優(yōu)化酶水解條件，旨在為豆粕的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆粕，中糧佳悅（天津）有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、角蛋白酶（70 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg），源葉生物科技有限公司；L-甘氨酸、桿菌肽，北京索萊寶科技有限公司；Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Try-Arg，Sigma 公司；胰島素（豬胰腺），上海阿拉丁試劑有限公司；其它試劑均為AR 級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104 電子天平，瑞士Mettler Toledo 公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Agilent Technologies 1290 infinity 高效液相色譜儀（配有DAD 檢測(cè)器），安捷倫科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 半固態(tài)酶解方法 將豆粕粉碎過60 目篩，準(zhǔn)確稱取適量的豆粕于反應(yīng)器中，根據(jù)酶活力單位準(zhǔn)確稱取適量的蛋白酶加入反應(yīng)器中，攪拌均勻后加入適量的蒸餾水，攪拌至水在豆粕中均勻分散，封上保鮮膜在恒溫箱中反應(yīng)。反應(yīng)到預(yù)定時(shí)間，取出放置于105 ℃烘箱中，滅酶15 min。冷卻，放到烘箱中35 ℃低溫烘干，得到半固態(tài)酶解的豆粕。

1.3.2 半固態(tài)酶解豆粕中多肽液提取 稱取半固態(tài)酶解豆粕0.5000 g，溶于50 mL 的離心管中恒溫振蕩6 h，將振蕩后的豆粕酶解液置于冰箱中4℃冷藏過夜。冷藏后的豆粕酶解液4 000 r/min 離心15 min，收集上清液。

1.3.3 水解度的測(cè)定

1）豆粕完全水解液制備 稱取7.5 g 豆粕于燒杯中，加入75 mL 6 mol/L HCI 密封后放入110～120 ℃烘箱中水解24 h，取出后冷卻。用濾紙過濾，濾液用蒸餾水定容75 mL。吸取適量豆粕完全酶解液，用40%和2%的NaOH 調(diào)pH 值中性（pH=6），定容。取完全水解液2 mL 于25 mL 比色管中，加入1 mL 茚三酮溶液混勻，沸水浴加熱15 min，然后快速冷卻，加入5 mL 40%乙醇溶液反應(yīng)15 min，570 nm 測(cè)吸光度。

2）工作曲線的繪制 取100 mg 甘氨酸溶于蒸餾水后定容至100 mL 作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，取相應(yīng)體積標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法測(cè)定吸光度。以甘氨酸的濃度與吸光度制作工作曲線，取線性部分做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3）水解液水解度的測(cè)定 取多肽提取液，稀釋至可測(cè)濃度，取水解液2 mL 于25 mL 比色管中，加入1 mL 茚三酮溶液混勻，沸水浴加熱15 min，冷卻，加入5 mL 40%乙醇溶液反應(yīng)15 min，于波長(zhǎng)570 nm 處測(cè)吸光度，根據(jù)吸光度計(jì)算蛋白質(zhì)含量[16]。按下式計(jì)算水解度：

式中，A——蛋白質(zhì)質(zhì)量（mg）；M——樣品質(zhì)量（g）；V1——水解液的總體積（mL）；V2——顯色時(shí)所用的稀釋液的體積（mL）。

1.3.4 小肽含量的測(cè)定 參考余勃等[17]的方法。取等體積的三氯乙酸（0.4 mol/L）加入酶解液中，混勻反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束以10 000 r/min 離心10 min，取上清液1 mL 加入4 mL 雙縮脲試劑，混勻室溫放置30 min，于波長(zhǎng)540 nm 處測(cè)吸光度。

1.3.5 酶解液分子質(zhì)量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[18]和[19]的方法。采用Agilent Technologies 1290 infinity高效液相色譜儀（配置Agilent Technologies 1200 series DAD 檢測(cè)器）對(duì)制備的豆粕酶解液進(jìn)行分子質(zhì)量分布的測(cè)定。色譜柱：TSKgeL2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流動(dòng)相：水（0.1%三氟乙酸）；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.6 疏水值的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[20]和[21]的方法。用0.01 mol/L pH 6.5 的磷酸緩沖液將豆粕酶解液稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%，0.04%，0.06%，0.08%，0.10%，并配制8.0 mmol/L ANS 溶液。取2 mL 上述配制稀釋液，加入10 μL ANS 立即混勻。在熒光分光光度計(jì)中于激發(fā)波長(zhǎng)390 nm、發(fā)射波長(zhǎng)470 nm 檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)和發(fā)射夾縫寬均為5 mm。以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，豆粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，以線性回歸斜率為疏水值指數(shù)。

1.3.7 蛋白酶的篩選 以豆粕肽的得率、水解度、分子質(zhì)量分布和疏水值為指標(biāo)，考察胰蛋白酶、角蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶5種蛋白酶在適宜的條件下酶的水解特性，確定最佳蛋白酶的類型。

表1 5 種蛋白酶酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of 5 proteases

1.3.8 單因素實(shí)驗(yàn) 在豆粕質(zhì)量30 g，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間36 h，液固比為1 mL/g 的條件下，考察加酶量（10，20，30，40，50，60 mg/g）對(duì)水解度的影響。

在豆粕質(zhì)量30 g，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間36 h，加酶量40 mg/g 的條件下，考察液固比（0.5，1，1.5，2，2.5 mL/g）對(duì)水解度的影響。

在豆粕質(zhì)量30 g，酶解溫度50 ℃，液固比為1 mL/g，加酶量40 mg/g 的條件下，考察酶解時(shí)間（12，24，36，48，60，72 h）對(duì)水解度的影響。

在豆粕質(zhì)量30 g，酶解時(shí)間36 h，液固比為1 mL/g，加酶量40 mg/g 的條件下，考察溫度（30，40，50，60，70，80 ℃）對(duì)水解度的影響。

在酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間36 h，液固比為1 mL/g，加酶量40 mg/g 的條件下，豆粕質(zhì)量（10，20，30，40，50，60 g）對(duì)水解度的影響。

1.3.9 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken Design 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。選擇試驗(yàn)中可優(yōu)化因素（豆粕質(zhì)量、酶解溫度和液固比）進(jìn)行優(yōu)化，因素與水平見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 Level table of response surface design factors

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

2.1.1 不同蛋白酶對(duì)水解度的影響 由圖1 可知，木瓜蛋白酶和角蛋白酶隨著加酶量的增大，水解度先增大后降低，在酶添加量為30 mg/g 時(shí)達(dá)到頂點(diǎn)，木瓜蛋白酶的水解效率最高，角蛋白酶水解效率偏低。胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶均隨加酶量的增大，水解度持續(xù)增大，到達(dá)一定值后，水解度上升趨于平緩，可能是由于水解產(chǎn)物中氨基酸和小肽的不斷增加，酶被底物完全飽和。蛋白酶濃度增加，豆粕中的蛋白質(zhì)會(huì)被高度水解，當(dāng)酶濃度超過最佳濃度時(shí)，酶活性會(huì)顯著減弱，過量的蛋白酶聚集導(dǎo)致底物擴(kuò)散抑制增加，反應(yīng)速率飽和，進(jìn)而導(dǎo)致水解度降低[20-22]。由圖1 可以看出，木瓜蛋白酶的水解效果最好，豆粕大部分被酶解成游離的氨基酸和不同鏈長(zhǎng)的多肽，胰蛋白酶和堿性蛋白酶的水解度比木瓜蛋白酶低，而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，胰蛋白酶水解度上升趨勢(shì)明顯，隨著加酶量升高，水解度高于堿性蛋白酶，與木瓜蛋白酶相接近。

圖1 5 種蛋白酶對(duì)豆粕水解度的影響Fig.1 Effects of 5 proteases on hydrolysis degree of soybean meal

2.1.2 不同蛋白酶對(duì)豆粕肽得率的影響 由圖2可知，隨著加酶量的增大，胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶均隨著加酶量的增多，豆粕肽得率呈遞增趨勢(shì)。圖1、圖2 結(jié)果顯示木瓜蛋白酶的水解度較高，呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，豆粕肽得率最低且持續(xù)增長(zhǎng)，這可能主要是由于木瓜蛋白酶在酶解過程中，前期豆粕蛋白主要被酶解為長(zhǎng)鏈肽。然而隨著加酶量增多，底物抑制增強(qiáng)，形成長(zhǎng)鏈肽的速率降低，短鏈肽形成速率增加，總體酶解速率降低。通過對(duì)豆粕肽得率的研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶、堿性蛋白酶、角蛋白酶酶解產(chǎn)物的豆粕肽得率較高，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物中多肽濃度處于較低水平。

圖2 5 種蛋白酶對(duì)豆粕肽得率的影響Fig.2 Effects of 5 proteases on peptide yield of soybean meal

2.1.3 分子質(zhì)量的測(cè)定 從表3 可知，角蛋白酶酶解產(chǎn)物中分子質(zhì)量＞1 000 u 的肽占比較高，說明角蛋白酶酶解產(chǎn)物中含有大量的長(zhǎng)鏈肽，其它蛋白酶酶解產(chǎn)物中分子質(zhì)量＜1 000 u 的低分子肽含量較高，其中胰蛋白酶、中性蛋白酶的酶解產(chǎn)物中，分子質(zhì)量在150～500 u 的肽含量較高，主要為二肽和三肽的小肽，研究表明，短鏈的大豆肽具有特定的生物活性，其中二肽和三肽比完整蛋白或者游離氨基酸更容易消化，因此被認(rèn)為是人類營(yíng)養(yǎng)合適的蛋白質(zhì)來源[23]。木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物中分子質(zhì)量＜150 u 的肽含量較高。結(jié)果表明，胰蛋白酶和中性蛋白酶的酶解產(chǎn)物中小肽含量高，可以有效增加產(chǎn)品品質(zhì)，促進(jìn)消化吸收。角蛋白酶酶解后大分子肽含量高，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物主要以游離氨基酸為主，在制備豆粕肽的工藝中效果欠佳。

表3 5 種蛋白酶最適條件下分子質(zhì)量分布表Table 3 Molecular weight distribution of 5 proteases in optimal conditions

2.1.4 疏水值測(cè)定 ANS 熒光探針法測(cè)得的疏水性指數(shù)，可以在一定程度上反映肽鏈上疏水氨基酸的含量。表面疏水值越高，說明肽鏈中的疏水性氨基酸殘基越多，所產(chǎn)生的苦味就越強(qiáng)[24]。從表4可以看出，角蛋白酶的酶解產(chǎn)物表面疏水值為60.47，是所有蛋白酶酶解產(chǎn)物中的最低水平。堿性蛋白酶作為一種內(nèi)切酶，與疏水性和堿性殘基C 末端結(jié)合的特異性較差[25]，疏水性指數(shù)在5 種蛋白酶中最高。胰蛋白酶主要作用于精氨酸和賴氨酸殘基，具有很強(qiáng)的特異性，疏水性指數(shù)變化不大，中性蛋白酶是一種外源性蛋白酶，對(duì)肽鍵的專一性不強(qiáng)，疏水值變化明顯。因此角蛋白酶的酶解產(chǎn)物苦味較淡，易于接受。胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的苦味適中，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物受反應(yīng)條件影響，口味差異大。堿性蛋白酶在水解過程中，非極性基團(tuán)在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中暴露出來，酶解的產(chǎn)物苦味較重。

表4 5 種蛋白酶最適條件下的疏水值Table 4 Hydrophobic values of 5 proteases under optimal conditions

綜合考慮蛋白酶酶解產(chǎn)物以上幾種因素，胰蛋白酶的水解度較高，豆粕肽得率達(dá)到18.06%，是幾種蛋白酶中肽得率最高的，而且豆粕肽主要為二肽、三肽，品質(zhì)較優(yōu)，苦味偏淡，故選擇胰蛋白酶作為最優(yōu)的水解酶。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 加酶量對(duì)酶解的影響 由圖3a 可知，當(dāng)加酶量達(dá)到40 mg/g 時(shí)，豆粕的水解度和豆粕肽得率的變化趨勢(shì)都逐漸變緩。表明隨著酶添加量的不斷增多，豆粕蛋白轉(zhuǎn)化為豆粕多肽的數(shù)量增加。然而，當(dāng)酶添加量到達(dá)一定值時(shí)，酶與酶之間會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，隨著酶添加量增加，酶解反應(yīng)速率不會(huì)產(chǎn)生顯著性變化。在圖3b 中隨加酶量增加，分子質(zhì)量＞1 000 u 和分子質(zhì)量在500～1 000 u 之間的豆粕肽占比逐漸減小，分子質(zhì)量在150～500 u之間的占比逐漸增加。結(jié)合圖3a 的豆粕肽得率可以看出，隨加酶量逐漸增加，酶解產(chǎn)生的長(zhǎng)鏈肽增量逐漸減少，一方面，豆粕蛋白大分子大部分被酶催化，另一方面，酶的濃度過大，一部分酶轉(zhuǎn)移方向，開始酶解長(zhǎng)鏈的豆粕肽。當(dāng)酶添加量超過40 mg/g 時(shí)，豆粕肽得率處于近乎停滯的狀態(tài)，豆粕肽的分子質(zhì)量分布也沒有明顯變化，從經(jīng)濟(jì)成本和效率綜合考慮，胰蛋白酶的加酶量確定為40 mg/g。

圖3 加酶量對(duì)酶解的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on enzymatic hydrolysis

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)酶解的影響 如圖4a 所示，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到36 h 時(shí)，豆粕的水解度和肽得率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯。超過36 h 后，一方面反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，參加酶促反應(yīng)的底物減少，另一方面胰蛋白酶可能受到多肽和氨基酸的抑制，豆粕的水解度和肽得率增長(zhǎng)趨于平緩甚至降低。從圖4b 可以看出，豆粕肽分子質(zhì)量在150～1 000 u 之間的占比處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，只會(huì)產(chǎn)生更多氨基酸。這是由于胰蛋白酶具有廣泛的特異性，主要切割精氨酸或賴氨酸的肽鍵，因此在36 h 內(nèi)，胰蛋白酶的酶解程度增加速率不斷上升，酶解物主要與酶切位點(diǎn)的偏好有關(guān)。酶解時(shí)間超過36 h，豆粕肽的得率逐漸減少，水解度上升，這是因?yàn)樗夥磻?yīng)一直在進(jìn)行，反應(yīng)生成的豆粕肽一部分被降解成游離的氨基酸[26]，故酶解36 h 是最優(yōu)的酶解時(shí)間。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)酶解的影響Fig.4 Influence of enzymatic hydrolysis time on enzymatic hydrolysis

2.2.3 豆粕量對(duì)酶解的影響 如圖5a 所示，當(dāng)豆粕添加量達(dá)到30 g 時(shí)，豆粕的水解度和肽得率達(dá)到最高。在底面積相同的容器中，隨著豆粕量的增加，豆粕的表面積和內(nèi)部面積發(fā)生變化，表面易干燥內(nèi)部水分遷移較弱，表面溫度與內(nèi)部溫度不同等問題都會(huì)影響豆粕的酶解。當(dāng)酶添加量超過30 g 時(shí)，豆粕的水解度和肽得率降低，長(zhǎng)鏈的豆粕肽占比不斷增大，說明豆粕添加量的變化會(huì)對(duì)胰蛋白酶的作用產(chǎn)生影響，豆粕添加量為40 g 時(shí)，小分子肽占比略高于豆粕添加量為30 g，而肽得率明顯下降。故確定豆粕量為30 g。

圖5 豆粕量對(duì)酶解的影響Fig.5 Influence of soybean meal content on enzymatic hydrolysis

2.2.4 酶解溫度對(duì)酶解的影響 如圖6a 所示，隨著溫度的升高，豆粕的水解度和肽得率不斷上升，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，豆粕的水解度和肽得率效果最好，分別達(dá)到14.8%和16.13%。升高溫度，蛋白的活化能和酶的活性都會(huì)升高，豆粕的水解度和肽得率也會(huì)提高。然而隨溫度的進(jìn)一步升高會(huì)導(dǎo)致酶失活，酶解的速度降低。在酶解溫度為50 ℃的條件下，豆粕肽的二肽、三肽含量最高，說明適宜的溫度有助于蛋白的解離，蛋白酶更容易到達(dá)適宜的酶切位點(diǎn)，酶解產(chǎn)物多為豆粕肽。當(dāng)溫度超過50 ℃，解聚的蛋白亞基會(huì)重新聚集成團(tuán)，不利于豆粕的酶解，而且酶解多發(fā)生在折疊的豆粕蛋白表面，產(chǎn)物中多為游離氨基酸，因此選擇酶解溫度50 ℃為最適溫度。

圖6 酶解溫度對(duì)酶解的影響Fig.6 Influence of enzymatic hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysis

2.2.5 液固比對(duì)酶解的影響 如圖7a 所示，當(dāng)液固比為1 mL/g 時(shí)，豆粕的水解度、肽得率，還有二肽、三肽的含量占比均最高，胰蛋白酶來自動(dòng)物的胰臟，其酶解特性更加接近于生物，當(dāng)液固比不斷增大，水解度和肽得率都會(huì)隨之降低，豆粕被直接酶解成游離的氨基酸，適宜的液固比，更容易得到酶解的中間產(chǎn)物豆粕肽。從生產(chǎn)成本角度而言，液固比越高，后續(xù)的干燥成本就越高，故液固比確定為1 mL/g。

圖7 液固比對(duì)酶解的影響Fig.7 Influence of liquid-solid ratio on enzymatic hydrolysis

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及回歸模型的建立 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，以液固比（A）、豆粕量（B）、溫度（C）3 個(gè)因素為相應(yīng)變量，以肽得率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3 因素3 水平試驗(yàn)17 組，結(jié)果見表5。

表5 試驗(yàn)方案和結(jié)果Table 5 Experimental scheme and results

采用Design-Expert 8.0.6 軟件程序?qū)σ陨显囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，分析結(jié)果得出胰蛋白酶酶解豆粕制備豆粕肽的回歸方程為：

由表6 可知，回歸模型P＜0.001，說明胰蛋白酶酶解豆粕制備豆粕肽的模型極顯著，同時(shí)失擬值P 為0.4909＞0.05 不明顯，說明該模型合理，數(shù)據(jù)可信，且模型的R2=0.9881 說明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系顯著，可以進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。

表6 回歸模型方差分析及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 6 Regression model variance analysis and regression equation coefficient significance test

從回歸分析的結(jié)果可以得出，一次項(xiàng)中A 影響極顯著，B 影響顯著，C 影響不顯著，說明單因素中液固比在豆粕肽得率的影響更加顯著。根據(jù)F 值的大小，可以判斷3 個(gè)因素對(duì)豆粕肽得率的影響是液固比（A）＞酶解溫度（C）＞豆粕量（B）。

2.3.2 響應(yīng)曲面分析圖示 由圖8 可知，設(shè)計(jì)的3 個(gè)因素中對(duì)豆粕肽得率影響最大的是液固比，其次是酶解溫度，最后是豆粕量，與表中方差分析的顯著性結(jié)果一致。

圖8 各因子交互作用的等高線圖和曲面圖Fig.8 Contour diagram and surface diagram of interaction of various factors

2.3.3 最佳酶解工藝確定 采用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)上述回歸方程進(jìn)行分析，確定最佳酶解工藝：液固比為1.13 mL/g，豆粕質(zhì)量為28.61 g，溫度為50.34 ℃，豆粕肽得率預(yù)測(cè)值為18.81%。

2.3.4 試驗(yàn)可行性 考慮到試驗(yàn)的可行性和實(shí)際操作方便，修正酶解工藝條件為：液固比1 mL/g，豆粕量30 g，溫度50 ℃。在此條件下經(jīng)過3 次平行試驗(yàn)，測(cè)得豆粕肽得率為18.87%，與理論值基本吻合，證明響應(yīng)面分析法對(duì)豆粕酶解制備豆粕肽的條件優(yōu)化是可行的。

3 結(jié)論

隨著酶制劑的發(fā)展逐步成熟，通過酶解手段提取豆粕肽將成為一種主流，半固態(tài)酶解工藝相較于液態(tài)酶解操作簡(jiǎn)易，生產(chǎn)成本低，更容易被市場(chǎng)接受。曹夢(mèng)笛等[27]通過半固態(tài)酶解制備全谷物多肽，其抗氧化、ACE 抑制活性顯著高于液態(tài)酶解產(chǎn)物，說明半固態(tài)酶解工藝具有可行性。堿性蛋白酶的水解能力較強(qiáng)[28]，然而在本次試驗(yàn)中，豆粕肽得率和水解度都低于胰蛋白酶，主要原因可能是堿性蛋白酶具有一定的耐堿性，可以在堿性水解液中酶解，堿性水解液使堿性蛋白酶更容易接近蛋白分子內(nèi)部的催化位點(diǎn)，然而在固態(tài)酶解中堿性蛋白酶失去優(yōu)勢(shì)。胰蛋白酶作為一種內(nèi)肽酶，對(duì)蛋白質(zhì)的肽鍵具有專一性，酶解產(chǎn)物主要以多肽、小肽的形式存在，風(fēng)味趨于穩(wěn)定。通過疏水值的測(cè)定，反映出胰蛋白酶酶解產(chǎn)物具有較低的苦味，適宜作為一種低苦味肽進(jìn)行生產(chǎn)。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)中，對(duì)豆粕肽分子質(zhì)量分布的測(cè)定，可以更加直觀的看出各種因素對(duì)酶解產(chǎn)物的影響。在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中，溫度對(duì)酶解的影響不顯著，與液態(tài)酶解有差異[29]，主要是因?yàn)楣虘B(tài)酶解主要在烘箱中反應(yīng)，設(shè)置的溫度差與酶解物感受到的溫度差有一定差距。

本試驗(yàn)采用半固態(tài)酶解豆粕工藝，通過豆粕肽得率、豆粕水解度、豆粕肽分子質(zhì)量和熒光探針法確定的苦味值，綜合考慮選出酶解效果較佳的胰蛋白酶進(jìn)行酶解。通過單因素實(shí)驗(yàn)選取對(duì)酶解影響較大的3 個(gè)因素，然后通過響應(yīng)面分析優(yōu)化豆粕肽得率，得到最優(yōu)的酶解條件：液固比為1 mL/g，豆粕質(zhì)量為30 g，溫度為50 ℃。本試驗(yàn)工藝簡(jiǎn)單，豆粕肽得率高，小分子肽占比高，操作成本低，在規(guī)?；a(chǎn)中起著重要作用，為豆粕資源的合理開發(fā)利用提供理論參考。