董乃慧，薛思宇，董 亮，陳映羲，黃治國，張素芳*

（1 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心 遼寧大連 116034 2 四川輕化工大學(xué) 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室 四川宜賓 644000）

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC），又名尿烷、烏拉坦，是一種普遍存在于發(fā)酵食品和酒精飲料中的對人體存在潛在遺傳毒性和較強致癌性的化學(xué)物質(zhì)[1-2]。隨著EC 的致癌性被不斷證實[3]，2007 年，國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）將EC 的致癌級變更為2A 類[4]。

目前對發(fā)酵食品中EC 的控制方法主要集中在以下幾個方面：1）改良發(fā)酵工藝，如精制或充分清洗原料以減少尿素（EC 主要前體物質(zhì)）含量，避免酒精飲料光照的幾率，減少氰化物（EC 前體物質(zhì)）的生成[5]；2）通過代謝工程改造釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），如敲除其精氨酸酶編碼基因（CAR1）[6-7]或高效表達脲基酰胺酶基因（DUR1、DUR2、DUR3）[8-9]來控制黃酒和米酒中EC 含量；3）酶法降解EC，主要分為脲酶和氨基甲酸乙酯水解酶（Ethyl carbamate hydrolase，ECH）。脲酶是酶法降解EC 最常見的酶，它可將尿素降解為CO2和氨。自1976 年Moreau 等[10]首次從乳酸桿菌中發(fā)現(xiàn)1 種酸性脲酶，國內(nèi)外研究者在脲酶的篩選、酶學(xué)性質(zhì)等方面進行了一系列研究。田亞平等[11]從雷式普羅威登斯菌（Providenciasp.）中獲得1種酸性脲酶，當(dāng)黃酒中加酶量達0.2 U/mL 時，EC去除率為25%。周建立等[12]發(fā)現(xiàn)1 種可以同時降解尿素和EC 的雙功能酸性脲酶，將其應(yīng)用于黃酒時，其降解EC 效果不是很理想。綜上所述，目前報道的絕大多數(shù)脲酶對尿素具有高特異性，對EC沒有活性，且發(fā)酵食品體系的復(fù)雜性導(dǎo)致其中的EC 形成途徑多樣，控制EC 的主要前體物質(zhì)只能部分降低體系中EC 的含量，若要達到從產(chǎn)品中完全清除EC 是極其困難的。反觀ECH，其能從源頭將EC 分解成乙醇和CO2，具有巨大的潛在應(yīng)用價值。應(yīng)用ECH 去除發(fā)酵食品中的EC，是上述方法的一個有效補充。

白酒是世界上消費量最大的酒類（2019 年超過78 億L[13]）。加拿大、法國、巴西和日本規(guī)定[14-15]蒸餾酒中EC 含量應(yīng)低于150 μg/L，然而，卓俊納等[16]研究發(fā)現(xiàn)，中國白酒中EC 檢出率為100%，高端濃香型白酒中EC 平均含量為201.3 μg/kg，高端醬香型白酒中EC 平均含量為195.03 μg/kg。黃松等[17]研究發(fā)現(xiàn)白酒基酒中EC 均有檢出，最高達544.74 μg/kg，均高于上述規(guī)定，不利于我國白酒的出口。同時，白酒酒精度數(shù)多為50%vol 以上，相較于目前應(yīng)用在黃酒、米酒等酒精飲料中去除EC的酶或菌株，能夠耐受白酒中高濃度乙醇且具有高降解效率的幾乎沒有。此外，發(fā)酵食品多偏酸性，比如葡萄酒的pH 值在3.0～3.8 之間[18]，黃酒的pH 值在3.5～4.6 之間[19]，泡菜的pH 值在3.5～3.8之間[20]。ECH 因pH 耐受范圍的原因在發(fā)酵食品中的應(yīng)用會受到限制[21]。篩選能夠耐受高濃度乙醇、耐偏酸性環(huán)境的EC 降解菌株是控制EC 含量的關(guān)鍵。

本文選擇王村醋醋醅和四川成都某酒廠酒糟作為篩選來源，其中，王村醋興于明朝，距今已有500 年左右的歷史，被認定為中華老字號、省級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。其發(fā)酵采用傳統(tǒng)的常溫自然發(fā)酵法，以“色淡香醇、營養(yǎng)健康”的風(fēng)格廣受民眾歡迎。醋的固態(tài)發(fā)酵工藝[22]中含有酒精發(fā)酵過程，從中篩選出的能夠降解EC 的菌株對乙醇和酸性環(huán)境均有較好的耐受能力。

本文對醋醅、酒糟中菌株的分離純化，基于16S rDNA、26S rDNA 的PCR 擴增和Blastn 分析，多序列比對分析，對所分離菌株的種屬進行鑒定，并將酒糟來源的1 株細菌和1 株酵母應(yīng)用于商品白酒中EC 的消減。試驗結(jié)果對耐酸、耐高濃度乙醇的EC 降解菌的篩選具有重要意義，并為ECH 的篩選利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 樣品醋醅，山東華王釀造有限公司；樣品酒糟，四川省某酒廠；樣品白酒（53%vol），大連當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.1.2 試劑 氨基甲酸乙酯（≥99%）、殼聚糖、甲醇（色譜級），麥克林公司；乙酸乙酯（色譜級），斯百全化學(xué)（上海）有限公司；氯化銨、氯化鈉（分析純），國藥集團化學(xué)試劑（上海）有限公司；海藻酸鈉（食品級）、無水氯化鈣、硼酸、氯仿、異戊醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（分析純）、無水乙醚（色譜級），天津市大茂化學(xué)試劑廠；正己烷（色譜級），瑞典歐普森（Oceanpak）化學(xué)公司；LB 肉湯、YPD 液體培養(yǎng)基，高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)（青島）有限公司；瓊脂粉、Tris、EDTA、SDS、蛋白酶K、RNase A 溶液（10 mg/mL）、Tris 飽和酚溶液、醋酸鈉、TE 緩沖液，生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Taq Master Mix（Dye Plus），南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DL 2000 DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司；GoldView I 型核酸染色劑，索萊寶科技（北京）有限公司；Genview 原裝瓊脂糖，GEN-VIEW SCIENTIFIC INC.；50×TAE緩沖液，生工生物工程（上海）股份有限公司；Cleanert EC 氨基甲酸乙酯專用固相萃取柱，天津博納Agela 科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基（g/L）：Na2HPO4·12 H2O 6.0，KH2PO43.0，NH4Cl 1.0，NaCl 0.5，EC 5.0，pH 7.4，121 ℃滅菌15 min。

篩選培養(yǎng)基（g/L）：Na2HPO4·12H2O 6.0，KH2PO43.0，NH4Cl 1.0，NaCl 0.5，EC 10.0，瓊脂20.0，pH 7.4，121 ℃滅菌15 min。

LB 培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 10.0，胰蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，瓊脂20.0（固體培養(yǎng)基），pH 7.0±0.1，121 ℃滅菌15 min。

YPD 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨20.0，葡萄糖20.0，酵母浸粉10.0，瓊脂20.0（固體培養(yǎng)基），pH 6.5±0.2，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司；回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床，上海知楚儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；微量臺式離心機、DNA 濃度測定儀，賽默飛世爾科技公司；PCR 儀，美國伯樂公司；水平電泳儀，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像儀，以色列DNR 公司；固相萃取儀，上海那艾精密儀器有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜儀（GC-MS），安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株篩選

1.3.1.1 富集培養(yǎng) 以EC 為唯一碳源的培養(yǎng)基中，由于缺乏優(yōu)勢碳源（葡萄糖），菌株的生長速度較慢，故先富集培養(yǎng)，再篩選培養(yǎng)。利用滅菌水重懸醋醅和酒糟制成懸液，吸取300 μL 醋醅或酒糟重懸液于10 mL 富集培養(yǎng)基，28 ℃，200 r/min 培養(yǎng)至培養(yǎng)液渾濁，吸取200 μL 接種于10 mL 新鮮富集培養(yǎng)基，重復(fù)5 代。

1.3.1.2 篩選培養(yǎng) 菌體富集培養(yǎng)后，進行倍比稀釋，分別取200 μL 不同稀釋度的溶液，均勻涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃靜置培養(yǎng)，每12 h 觀察1 次平板上的菌株形態(tài)，選取菌落數(shù)低于300 的平板，挑取不同形態(tài)的單菌落于LB 平板劃線分離純化3 代，直至獲得純種單菌落，隨后挑取單菌落接種于LB 肉湯中，200 r/min，28 ℃培養(yǎng)至菌液渾濁，添加體積分數(shù)20%的甘油后，凍存于-80 ℃，備用。

1.3.2 菌株基因組的提取 菌株基因組提取方法參考文獻[23]的方法。

1.3.3 菌株鑒定

1.3.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 對篩選到的具有EC 降解能力的菌株從菌落大小、形狀、邊緣、光澤和顏色等方面觀察并采集圖像。取單菌落于40 倍物鏡下，對菌體形態(tài)進行觀察，做好記錄并采集圖像。

1.3.3.2 分子生物學(xué)鑒定 細菌16S rDNA PCR擴增采用通用引物27 F 和1492 R[24]。酵母26S rDNA PCR 擴增采用通用引物D1/D2[23]。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，基因組模板（50 ng/μL）1 μL，滅菌水22 μL。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，30 次循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

取4 μL PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，剩下的45 μL PCR 產(chǎn)物進行測序。測序結(jié)果采用基本局部比對搜索工具（Basic local alignment search tool，BLASTn）進行比對分析?；诒葘Y(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用MEGA 11.0 軟件中的鄰近法（Neighbor-joining method）。

1.3.4 氨基甲酸乙酯降解菌株在白酒中的應(yīng)用

1.3.4.1 海藻酸鈉-殼聚糖法固定化菌株 固定化菌株技術(shù)是將菌株固定在載體上，使菌株高度密集并保持其生物活性，利于菌株抵抗不利環(huán)境[25]，以及實際生產(chǎn)后反應(yīng)結(jié)束時的固液分離，提高生產(chǎn)效率。

挑取從酒糟中篩選得到的J29 純種菌落接種于10 mL LB 肉湯，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)至OD600nm值為0.6。JY1 接種于YPD 液體培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min 培養(yǎng)至OD600nm值為0.6。菌株培養(yǎng)液于13 000 r/min 離心8 min，10 mL 滅菌水重懸菌體沉淀。固定化菌株方法參考文獻[26]的方法。

1.3.4.2 白酒中氨基甲酸乙酯的降解能力鑒定取1.3.4.1 節(jié)制備的固定化EC 降解菌，置于10 mL 白酒樣品中，20 ℃靜置反應(yīng)12 h。樣品提取方法、標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制方法參考文獻[27]的方法；標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法參考文獻[28]的方法。樣品檢測方法參考文獻[29]的方法，但略有不同，其中，采用HP-INNOWAX 色譜柱，長度30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚度0.25 μm。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

以醋醅、酒糟為原材料，通過篩選培養(yǎng)基分離出44 株細菌和4 株酵母。采用平板劃線法（LB 瓊脂或YPD 瓊脂）對其進行純化，經(jīng)3 次平板劃線后獲得純菌落。部分菌株的平板圖及鏡檢圖見圖1，具體的菌落形態(tài)學(xué)描述見表1。

表1 醋糟、酒糟中細菌的形態(tài)學(xué)特征Table 1 Morphological characteristics of bacteria in vinegar brewing mass and fermented grains of Baijiu

圖1 醋醅、酒糟中部分菌落形態(tài)學(xué)及細菌鏡檢觀察（40×）Fig.1 Colony morphology and microscopy of partial bacteria in vinegar brewing mass and fermented grains of Baijiu（40×）

通過形態(tài)學(xué)觀察可知（圖1），在顏色方面，44株細菌中有20 株呈乳白色，20 株呈淺黃色，4 株呈黃色，均不透明；在表面光滑程度方面，31 株表面光滑，4 株表面粗糙，9 株表面光滑且有同心環(huán)；在邊緣形狀方面，15 株呈葉狀邊緣，6 株呈鋸齒狀邊緣，3 株呈根狀邊緣。其中，有2 株菌落形態(tài)呈雪花狀，分別是C2、C22，二者表面光滑，邊緣有毛邊。4 株酵母在室溫下均呈白色，表面光滑，邊緣整齊，而CY1、CY2 菌落經(jīng)4 ℃保存12 h 后呈紅色。

通過鏡檢可知，44 株細菌共有21 株短桿菌、21 株球菌、2 株弧菌，且醋醅中篩選得到的多為球菌，而酒糟中篩選得到的多為桿菌。4 株酵母多為出芽狀態(tài)，醋醅來源的酵母呈卵形，而酒糟來源的酵母呈橢圓形。

2.2 菌株的分子學(xué)鑒定

2.2.1 菌株基因組的提取及PCR 擴增結(jié)果 提取44 株細菌、4 株酵母基因組，以其為模板，細菌采用引物27F 和1492R，酵母采用引物D1 和D2，PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2 所示?？捎^察到所有細菌的泳道在1 500 bp 左右，所有酵母的泳道在500 bp 左右出現(xiàn)了1 條清晰條帶。PCR 產(chǎn)物經(jīng)測序后獲得菌株基因組序列。

圖2 PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplification result

2.2.2序列同源性分析 利用BLAST 分析菌株的測序結(jié)果，48 株菌分別歸屬于14 個種屬，結(jié)果如表2 所示。

表2 細菌16S rDNA 序列、酵母26S rDNA 分析結(jié)果Table 2 Results of 16S rDNA sequence analysis for bacteria and 26S rDNA sequence analysis for yeasts

耐久腸球菌有9 株（均來自醋醅），是兩種樣品中分離數(shù)量最多的菌種，占總數(shù)的18.75%；戴爾福特菌（Delftia tsuruhatensis）有8 株（7 株來自醋醅，1 株來自酒糟），占總數(shù)的16.67%；戴爾福特菌屬（Delftiasp.）有7 株（均來自醋醅），占總數(shù)的14.58%；賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillussp.）有6 株（均來自酒糟），占總數(shù)的12.50%。另外，還從醋醅中分離到2 株多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa），2 株大仁紅酵母（Rhodotorula dairenensis），1 株池生戴爾福特菌（Delftia lacustris），1株屎腸球菌（Enterococcus faecium），1 株加米那類芽孢桿菌（Paenibacillus jamilae）；從酒糟中分離到2 株芽孢桿菌（Bacillussp.），2 株紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis），2 株乙醇假絲酵母（Candida ethanolica），2 株蛋白水解芽孢桿菌（Bacillus proteolyticus），1 株短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），1 株耐硼賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus boronitolerans），1 株燦爛類芽孢桿菌（Paenibacillus lautus）。

Liu 等[30]從副地衣芽孢桿菌（Bacillus paralicheniformis）中篩選能夠同時降解EC 和尿素的雙效脲酶；Cui 等[31]通過在白酒發(fā)酵過程中接種球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericus）可以有效降低其中的EC 和尿素含量；Jia 等[32]從賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）中獲得能夠降解EC 的氨基甲酸乙酯水解酶，且該酶對尿素?zé)o作用；Mohapatra 等[33]從海綿微球菌（Micrococcussp.）中獲得氨基甲酸乙酯水解酶。本文從發(fā)酵食品來源篩選到的菌株多為球菌和芽孢桿菌，與已報道的降解氨基甲酸乙酯菌株在屬水平較為一致。

2.2.3 建立氨基甲酸乙酯降解細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹利用List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature 網(wǎng)站（https：//lpsn.dsmz.de/）檢索不同種屬細菌的模式菌株，測序結(jié)果與模式菌株使用本地軟件Mega 11.0，運用N-J 法建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 醋醅、酒糟細菌分離株16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacteria from in vinegar brewing mass and fermented grains of Baijiu based on 16S rDNA sequence

由圖3 可以看出，J22、J25、J26 與短小芽孢桿菌EU138517 聚為一支，表明這3 株菌均為短小芽孢桿菌，與分子鑒定結(jié)果較為一致，形成第1 類群。J21、J24 與蠟樣芽胞桿菌AJ841873 在同一分支，表明三者遺傳距離較近，形成第2 類群。J1、J13、J29 與賴氨酸芽孢桿菌1031108 在同一分支，并與J27 聚為一支形成第3 類群；C2、C21、C22 與加米那類芽胞桿菌AJ271157 聚為一支，形成第4類群；J19 與燦爛類芽孢桿菌D78473 形成第5 類群；C3、C12、C20、C23、C29 與耐久腸球菌Y18359聚為一支，形成第6 類群；C7、C13、C19、C25、C30與戴爾福特菌AB075017 形成第7 類群。

2.3 氨基甲酸乙酯降解菌株在白酒中的應(yīng)用

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按照1.3.4.2 節(jié)中GCMS 相關(guān)條件，測定10～1 000 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，以EC 定量離子峰面積對質(zhì)量濃度構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Calibration curve of ethyl carbamate

為考察樣品提取方法的準(zhǔn)確度，進行100 μg/L 的添加回收試驗，結(jié)果見表3?；厥章蕿?1.87%，在70%～110%之間，說明樣品提取方法的準(zhǔn)確度能夠滿足檢測的需要。

表3 預(yù)處理方法的回收率Table 3 Spiked recoveries of the pretreatment methods

2.3.2 白酒中氨基甲酸乙酯的消減 目前，在白酒發(fā)酵過程中，接種是去除EC 或其前體物質(zhì)的主要方法，比如孟慶達等[34]通過向固態(tài)發(fā)酵的白酒酒醅中接種高于107CFU/g 酒醅的羅伊氏乳桿菌，30 ℃發(fā)酵70 d，尿素去除率在97.3%以上。然而白酒在發(fā)酵過程中的酒精度一般在10%左右，最高達18%，本研究是將酒糟來源的J29 和JY1經(jīng)固定化后添加到商品白酒中（53%vol），20 ℃處理12 h，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 固定化菌株對白酒中氨基甲酸乙酯的去除效果Fig.5 Removal effect of immobilized strains on EC in Baijiu

商品白酒中EC 質(zhì)量濃度為230.37 μg/L，處理12 h 后白酒中EC 質(zhì)量濃度顯著降低，其中J29處理后EC 質(zhì)量濃度降低至78.12 μg/L，降解率為66.09%，JY1 處理后EC 質(zhì)量濃度降低至86.97 μg/L，降解率為62.25%。

3 結(jié)論

本文從醋醅、酒糟中篩選出以EC 為唯一碳源，可降解EC 的細菌44 株、酵母4 株，經(jīng)分子鑒定后發(fā)現(xiàn)，得到戴爾福特菌（15 株）、耐久腸球菌（9 株）、梭狀芽胞桿菌（6 株）、紡綞形賴氨酸芽孢桿菌（2 株）、多粘芽孢桿菌（2 株）、芽孢桿菌（2株）、大仁紅酵母（2 株）、乙醇假絲酵母（2 株）、蛋白水解芽孢桿菌（2 株）、賴氨酸芽孢桿菌（1 株）、燦爛類芽孢桿菌（1 株）、加米那類芽胞桿菌（1株）、短小芽孢桿菌（1 株）、池生戴爾福特菌（1株）、屎腸球菌（1 株）。從酒糟來源的細菌、酵母中各選1 株，包埋后應(yīng)用于降解商品白酒中的EC，結(jié)果表明，處理12 h 的白酒中EC 質(zhì)量濃度由230.37 μg/L 降至78.12 μg/L（細菌）和86.97 μg/L（酵母），降解率均高于60%，包埋后的兩株菌株不僅能夠耐受高濃度乙醇（53%vol）且降解效率高。

本研究通過分離、鑒定醋醅和酒糟中氨基甲酸乙酯降解菌株，并分析了其EC 降解能力，為研究耐酸、耐乙醇的ECH 奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)將通過分子生物學(xué)方法克隆ECH 基因并進行表達，以期篩選出耐酸、耐乙醇的ECH，控制白酒中的EC。研究不同EC 降解菌株的特性，加速ECH 的開發(fā)，從而采取針對性措施降低發(fā)酵酒中EC 含量，對我國發(fā)酵酒的安全性提升具有重要意義。

致謝

本文受到釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室開放課題（NJ2021-01）“氨基甲酸乙酯水解酶的篩選和基因工程生產(chǎn)”的資助。