紀(jì)海濤，趙穎馨，于錫巧，柴強(qiáng)，劉振東，張叢叢

隨著老齡化加重，動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)病率逐年升高，其病變部位主要是血管壁［1］。血管內(nèi)壁是由內(nèi)皮細(xì)胞組成的，而內(nèi)皮細(xì)胞在機(jī)體器官中廣泛分布［2］；此外，其還可以充當(dāng)血管壁的調(diào)劑器，釋放血管活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)血管的舒張與收縮［3］。AS的主要病因是內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)氧化低密度脂蛋白膽固醇（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）的調(diào)控失衡［4］，而ox-LDL是氧化應(yīng)激刺激低密度脂蛋白產(chǎn)生的，所以氧化應(yīng)激是引發(fā)AS的重要因素。研究表明，Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）與AS的發(fā)生有關(guān)［5-6］。TLR4主要分布在內(nèi)皮細(xì)胞表面，其被激活后可與髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）結(jié)合，從而激活MyD88依賴的信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的活化及促炎因子的釋放［7］。

近年來(lái)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long chain non-coding RNA，LncRNA）持續(xù)受到學(xué)者們的關(guān)注，而長(zhǎng)鏈非編碼RNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1（long chain non-coding RNA metastasis-associated lung adenocarcinoma tran 1，LncRNA MALAT1）作為L(zhǎng)ncRNA家族的一員，在細(xì)胞核中表達(dá)，具有高度保守性［8］。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MALAT1在血管疾病中發(fā)揮作用，可以促進(jìn)血管生成［9］，并且可以保護(hù)發(fā)生氧化損傷的內(nèi)皮細(xì)胞［10］。但目前LncRNA MALAT1與TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系尚不清楚。為此，本研究使用過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導(dǎo)氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，然后探究氧化應(yīng)激環(huán)境下LncRNA MALAT1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的影響，以期為研究氧化應(yīng)激導(dǎo)致AS等心血管疾病的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2022年10—12月。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；LncRNA MALAT1的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）購(gòu)自上海吉碼制藥技術(shù)有限公司：TLR4抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；MyD88抗體、NF-κB抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；Actin、LncRNA MALAT1、TLR4、MyD88、NF-κB的引物購(gòu)自鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和q-PCR試劑盒購(gòu)自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；蛋白凝膠購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；CCK-8試劑購(gòu)自MCE公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HUVEC置于含5%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，待細(xì)胞貼壁且在培養(yǎng)皿中的覆蓋率達(dá)80%左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組與處理。

1.3.2 H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的最佳干預(yù)時(shí)間將HUVEC懸液接種在96孔板中（100 μl/孔），將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)6～8 h，將其分為A、B、C、D組，分別使用600 μmol/L的H2O2處理0、6、8、10 h，隨后采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性，具體方法為：用PBS清洗掉殘留的培養(yǎng)液和H2O2，再向每孔加入10 μl CCK-8試劑與90 μl低糖DMEM培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。以細(xì)胞活性為60%時(shí)的時(shí)間作為本實(shí)驗(yàn)的最佳干預(yù)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.3 q-PCR檢測(cè)LncRNA MALAT1表達(dá)水平 將密度為30×104/ml的HUVEC均勻接種至6孔板中，每孔加入2 ml，培養(yǎng)12 h，將其分為對(duì)照組（不做任何處理）、H2O2組（使用600 μmol/L的H2O2處理8 h以構(gòu)建氧化應(yīng)激細(xì)胞模型），采用q-PCR檢測(cè)LncRNA MALAT1表達(dá)水平，具體方法為：棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗1遍，加入500 μl的Trizol以提取細(xì)胞中的總RNA，將總RNA吸出并移至EP管，加入200 μl雙重去離子水（double distilled water，ddH2O），放入常溫離心機(jī)進(jìn)行離心，條件為6 720 r/min、15 min（離心半徑為6 cm）；吸出上層清液（300～500 μl），加入等量異丙醇后再次離心，條件為6 720 r/min、10 min（離心半徑為6 cm）；棄去液體，用75%乙醇溶液清洗，再次離心，條件為4 480 r/min、3 min（離心半徑為6 cm）；棄去乙醇溶液后，加入ddH2O以溶解沉淀的LncRNA MALAT1。按照50 ℃ 15 min，75 ℃ 5 min的條件對(duì)提取出的LncRNA MALAT1進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以Actin為內(nèi)參，使用PCR試劑盒對(duì)Actin、LncRNA MALAT1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，加入0.4 μl上/下游引物、2.0 μl cDNA、10.0 μl PCR試劑，用ddH2O將總反應(yīng)體系補(bǔ)齊到20.0 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 90 s，94 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。Actin的上游引物序列為5'-GAAGAGCTACGAGCTGCCTGA-3'，下游引物序列為5'-CAGACAGCACTGTGTTGGCG-3'；Lnc RNA MALAT1 的上游引物序列為5'-GGATTCCAGGAAGGAGCGAG-3'，下游引物序列為5'-ATTGCCGACCTCACGGATTT-3'。根據(jù)公式（ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）計(jì)算LncRNA MALAT1表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)水平 將密度為30×104/ml的HUVEC均勻接種至6孔板中，每孔加入2 ml，培養(yǎng)12 h，將其分為對(duì)照組（不做任何處理）、H2O2組（使用600 μmol/L的H2O2處理8 h以構(gòu)建氧化應(yīng)激細(xì)胞模型）、H2O2+siRNA組（轉(zhuǎn)染LncRNA MALAT1的siRNA后使用600 μmol/L的H2O2處理8 h以構(gòu)建氧化應(yīng)激細(xì)胞模型），采用Western blot法檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)水平，具體方法為：棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗1遍，加入200～300 μl RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑的混合液（1∶100），于冰上孵育5～10 min，用刮刀將細(xì)胞刮離六孔板并轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，每個(gè)樣本進(jìn)行超聲破碎3次，5 s/次；將其轉(zhuǎn)移到4 ℃的離心機(jī)中，12 000 r/min離心15 min（離心半徑為6 cm）；用移液槍吸取上清液，采用BCA法測(cè)量蛋白濃度，加入5×Buffer（與提取蛋白樣本量的比例為1∶4），置于干式恒溫器煮蛋白（100 ℃ 10 min）；添加10～15 μl的樣品并將其置于蛋白凝膠中電泳1 h，電壓保持在80 V；將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，轉(zhuǎn)模方式為濕轉(zhuǎn)，時(shí)間1 h，電壓保持在100 V；將含有蛋白的PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉90 min；用1×TBST清洗3次，5 min/次；加入TLR4、MyD88、NF-κB抗體（稀釋比例分別為1∶500、1∶1 000、1∶1 000），于4 ℃孵育6～8 h；于室溫下用1×TBST清洗3次，5 min/次；用相應(yīng)種屬二抗孵育1 h（稀釋比例為1∶5 000），用1×TBST清洗3次，5 min/次；進(jìn)行蛋白顯影，分析目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.5 q-PCR檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平 將密度為30×104/ml的HUVEC均勻接種至6孔板中，每孔加入2 ml，培養(yǎng)12 h，將其分為對(duì)照組（不做任何處理）、H2O2組（使用600μmol/L的H2O2處理8 h以構(gòu)建氧化應(yīng)激細(xì)胞模型）、H2O2+siRNA組（轉(zhuǎn)染LncRNA MALAT1的siRNA后使用600 μmol/L的H2O2處理8 h以構(gòu)建氧化應(yīng)激細(xì)胞模型），采用q-PCR檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平，方法同1.3.3。TLR4的上游引物序列為5'-TGGATCAAGGACCAGAGGCA-3'，下游引物序列為5'-GAGGACCGACACACCAATGA-3'；MyD88的上游引物序列為5'-AAGCGACTGATCCCCATCAAG-3'，下游引物序列為5'-TCGCAGACAGTGATGAACCTC-3'；NF-κB 的上游引物序列為5'-TCTTTGACAAT CGTGCCCCC-3'，下游引物序列為5'-CAGCCIGGTC CCGTGAAATA-3'。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的最佳干預(yù)時(shí)間 A、B、C、D組細(xì)胞活性分別為（1.00±0.00）、（0.77±0.05）、（0.61±0.09）、（0.52±0.04）。四組細(xì)胞活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=40.08，P=0.001）；B、C、D組細(xì)胞活性均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C組細(xì)胞活性最接近60%，故H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的最佳干預(yù)時(shí)間為8 h。

2.2 對(duì)照組與H2O2組LncRNA MALAT1表達(dá)水平比較H2O2組LncRNA MALAT1表達(dá)水平為（0.76±0.25），低于對(duì)照組的（1.28±0.38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.776，P=0.020）。

2.3 對(duì)照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)水平比較 對(duì)照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；H2O2+siRNA組MyD88、NF-κB表達(dá)水平高于H2O2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1、圖1。

圖1 Western blot法檢測(cè)對(duì)照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)水平的電泳圖Figure 1 Electropherogram of TLR4，MyD88 and NF-κB expression levels in control group，H2O2 group and H2O2+siRNA group detected by Western blot method

表1 對(duì)照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of expression levels of TLR4，MyD88，NF- κB in control group，H2O2 group，H2O2+siRNA group

表1 對(duì)照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of expression levels of TLR4，MyD88，NF- κB in control group，H2O2 group，H2O2+siRNA group

注：H2O2=過(guò)氧化氫，siRNA=小干擾RNA，TLR4=Toll樣受體4，MyD88=髓樣分化因子88，NF-κB=核因子κB；a表示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b表示與H2O2組比較，P＜0.05

組別TLR4MyD88NF-κB對(duì)照組0.72±0.210.41±0.140.74±0.07 H2O2組0.95±0.390.52±0.141.01±0.23 H2O2+siRNA組1.27±0.44a0.84±0.23ab1.37±0.24ab F值4.8411.5112.66 P值0.0190.0010.001

2.4 對(duì)照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較 對(duì)照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；H2O2組TLR4、MyD88 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組、H2O2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of mRNA expression levels of TLR4，MyD88，NFκB in control group，H2O2 group，H2O2+siRNA group

表2 對(duì)照組、H2O2組、H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of mRNA expression levels of TLR4，MyD88，NFκB in control group，H2O2 group，H2O2+siRNA group

注：a表示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b表示與H2O2組比較，P＜0.05

組別TLR4 mRNAMyD88 mRNA NF-κB mRNA對(duì)照組1.09±0.050.99±0.061.02±0.04 H2O2組2.78±0.17a1.43±0.05a1.36±0.05 H2O2+siRNA組6.10±0.60ab2.52±0.11ab2.23±0.19ab F值49.5332.6426.66 P值＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

AS是目前比較常見(jiàn)的心血管疾病，能夠?qū)е卵軆?nèi)膜結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化，管壁增厚是其主要病理特點(diǎn)［1］。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致AS發(fā)生發(fā)展的主要因素之一，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到氧化應(yīng)激的刺激后，會(huì)引起低密度脂蛋白發(fā)生氧化，刺激黏附因子表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞黏附性增加及細(xì)胞聚集，其還會(huì)促進(jìn)NO的釋放，造成血管功能障礙［11］。同時(shí)，慢性炎癥也是造成AS加重的主要原因，研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路在AS的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，其中MyD88作為TLR4的銜接蛋白，起著關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，其在接收到TLR4信號(hào)后可激活NF-κB［12］。

本研究構(gòu)建氧化應(yīng)激細(xì)胞模型前，首先探索合適的誘導(dǎo)條件。氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的誘導(dǎo)手段有很多，本研究選擇H2O2，因?yàn)槠鋺?yīng)用較廣泛，作用直接，性質(zhì)穩(wěn)定［13］。本研究結(jié)果顯示，B、C、D組細(xì)胞活性均小于A組，且C組細(xì)胞活性最接近60%，故H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的最佳干預(yù)時(shí)間為8 h。

LncRNA MALAT1定位于染色體11q13.1上，首次在非小細(xì)胞肺癌中被發(fā)現(xiàn)，其可以調(diào)控細(xì)胞增殖，影響腫瘤的發(fā)生［14］。研究顯示，抑制LncRNA MALAT1可促進(jìn)乳腺癌模型小鼠癌細(xì)胞遷移［15］。同時(shí)，LncRNA MALAT1在氧化應(yīng)激引發(fā)的心血管疾病中也能發(fā)揮一定作用。LI等［16］研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死患者LncRNA MALAT1表達(dá)水平升高，LncRNA MALAT1可能成為預(yù)測(cè)心肌梗死的標(biāo)志物。有研究者在高脂飲食誘導(dǎo)的AS模型小鼠中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)LncRNA MALAT1可以通過(guò)ox-LDL來(lái)調(diào)控Wnt/β環(huán)，從而促進(jìn)AS的發(fā)生［17］。本研究結(jié)果顯示，H2O2組LncRNA MALAT1表達(dá)水平低于對(duì)照組，與CHEN等［18］研究結(jié)果類似，該研究表明，靶向敲除LncRNA MALAT1后小鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)更加劇烈。但本研究結(jié)果與RADHAKRISHNAN等［19］研究結(jié)果不同，可能是所用細(xì)胞系及干預(yù)方式不同導(dǎo)致的，RADHAKRISHNAN等［19］選擇的細(xì)胞系為視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞，且使用高糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。

有研究者采用脂多糖誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞中TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)水平升高［20］。研究顯示，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4、MyD88、NF-κB的表達(dá)，可以減輕氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制神經(jīng)元凋亡［21］。本研究結(jié)果顯示，H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)水平高于對(duì)照組，MyD88、NF-κB表達(dá)水平高于H2O2組；H2O2組TLR4、MyD88 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，H2O2+siRNA組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組、H2O2組；提示在氧化應(yīng)激環(huán)境下，LncRNA MALAT1表達(dá)水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路被激活，這與既往研究結(jié)果［22］類似。但本研究結(jié)果與JIA等［23］研究結(jié)果存在差異，可能是采用的細(xì)胞和模擬的病理環(huán)境不同導(dǎo)致的，JIA等［23］使用人心肌細(xì)胞模擬心肌炎，結(jié)果顯示，下調(diào)LncRNA MALAT1可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的激活。

綜上所述，氧化應(yīng)激環(huán)境下，LncRNA MALAT1表達(dá)水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路被激活，這為預(yù)防和治療AS提供了新的理論依據(jù)。但本研究為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，且未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，后期尚需要進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)論。此外，LncRNA MALAT1與多種微小RNA有關(guān)，SUN等［24］研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MALAT1與miR-503位點(diǎn)結(jié)合后可抑制下游JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活，本研究組后續(xù)會(huì)對(duì)此展開(kāi)研究。

作者貢獻(xiàn)：紀(jì)海濤進(jìn)行文章的撰寫(xiě)、數(shù)據(jù)分析；趙穎馨、柴強(qiáng)、劉振東進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；于錫巧、張叢叢進(jìn)行文獻(xiàn)的收集與整理；趙穎馨進(jìn)行文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。