馮 宇, 陳俊峰, 林炳亮

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院感染性疾病科, 廣州 510630

肝臟具有消化、解毒、內(nèi)分泌等多種功能,并且有強(qiáng)大的自我再生能力。終末期肝病(end-stage liver diseases, ESLD)是指各種損傷引起的肝臟結(jié)構(gòu)和功能不可逆改變已經(jīng)到了晚期階段,包括各種類(lèi)型的肝衰竭、失代償期肝硬化,預(yù)后通常很差。肝移植是治愈此階段患者唯一的方法,但肝源短缺、移植后免疫排斥、費(fèi)用昂貴等問(wèn)題極大限制了其在臨床上的應(yīng)用。近年來(lái)興起的細(xì)胞療法得到了廣泛關(guān)注,其中的干細(xì)胞療法更被認(rèn)為是有極大前景的肝移植替代療法[1]。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是肝病治療領(lǐng)域應(yīng)用最廣的干細(xì)胞

干細(xì)胞是一組具有多向分化潛能的細(xì)胞群,在體外適宜條件下可以被誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞(hepatocyte-like cells, HLC),具有完整的肝細(xì)胞功能。此外,它還可以旁分泌很多細(xì)胞因子,改變受損肝臟的局部微環(huán)境,調(diào)節(jié)免疫功能減輕肝臟炎癥損傷,刺激肝細(xì)胞再生。臨床上常用的干細(xì)胞包括:MSC、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESC)和造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell, HSC)等。ESC受限于免疫排斥問(wèn)題,而HSC體外增殖能力有限,故應(yīng)用MSC治療肝病的研究最為廣泛。

MSC主要集中在人的骨髓和臍帶血,從來(lái)源上可將MSC分為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BM-MSC)、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived mesenchymal stem cells, AMSC)等。因其不表達(dá)MHCⅡ類(lèi)抗原,很少表達(dá)MHCⅠ類(lèi)抗原,故免疫原性很低,MSC移植具有較高的安全性。BM-MSC遷移能力最強(qiáng),旁分泌功能強(qiáng)大[2],是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。其分泌的外泌體(Exo)是一種細(xì)胞外囊泡,攜帶了多種生物活性物質(zhì),包括蛋白質(zhì)、miRNA和DNA等[3]。它可以代替“母細(xì)胞”通過(guò)調(diào)節(jié)不同靶細(xì)胞的信號(hào)通路發(fā)揮作用,是很有前景的“無(wú)細(xì)胞”治療方案。

2 干細(xì)胞治療肝病的機(jī)制

2.1 干細(xì)胞可以分化為HLC發(fā)揮功能并向受損肝臟歸巢 20世紀(jì)初,Yan等[4]通過(guò)體外培養(yǎng)從肝硬化失代償期患者外周血中分離BM-MSC,發(fā)現(xiàn)重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可以誘導(dǎo)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為HLC。進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中借助示蹤蛋白發(fā)現(xiàn)移植的BM-MSC首先向肺部累積,之后才向損傷的肝臟歸巢[5]。Yu等[6]將人的UC-MSC移植入肝臟受損的小鼠體內(nèi),小鼠肝臟HE染色顯示壞死肝臟面積縮小,且人白蛋白、細(xì)胞角蛋白-18染色呈陽(yáng)性,說(shuō)明人UC-MSC可以歸巢到受損組織并分化為有功能的肝細(xì)胞。但到目前為止,MSC歸巢的機(jī)制還未完全闡明,干細(xì)胞分化程度不足、效率低下的問(wèn)題仍需更多實(shí)驗(yàn)來(lái)探索解決。

2.2 干細(xì)胞通過(guò)旁分泌機(jī)制調(diào)節(jié)免疫、抑制纖維化修復(fù)受損肝臟 隨著研究的深入,人們認(rèn)識(shí)到MSC通過(guò)旁分泌機(jī)制改變肝臟局部微環(huán)境比向HLC轉(zhuǎn)分化對(duì)于肝臟的修復(fù)更重要[7],這種機(jī)制主要通過(guò)MSC旁分泌細(xì)胞因子的方式調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫,進(jìn)而改善肝臟的纖維化,這些細(xì)胞因子包括吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-beta, TGF-β)等[8]。對(duì)固有免疫來(lái)說(shuō),MSC可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2亞型極化,分泌IL-10并清除壞死的肝細(xì)胞,緩解肝臟炎癥損傷[9]。NK細(xì)胞的功能也不同程度受到MSC影響,表現(xiàn)為功能激活或功能抑制。對(duì)適應(yīng)性免疫來(lái)說(shuō),T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞功能均被抑制。已有研究[10]表明,MSC釋放的TGF-β可以抑制ERK1/2的磷酸化,影響細(xì)胞周期蛋白使之停止在G1期,進(jìn)而減少T淋巴細(xì)胞的增殖。還有臨床研究結(jié)果[11]表明T淋巴細(xì)胞的分化亦受MSC影響,自體BM-MSC移植治療HBV相關(guān)性肝硬化患者的外周血中Th17細(xì)胞向肝臟流入減少,調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)數(shù)量增加。與MSC共培養(yǎng)的B淋巴細(xì)胞的增殖能力和分泌抗體能力也出現(xiàn)大幅下降,其表面CXCR4等趨化因子受體表達(dá)減少[12]。

MSC可以通過(guò)下調(diào)TGF-β1受體和平滑肌α肌動(dòng)蛋白(smooth muscle α-actin, α-SMA)等的表達(dá)間接減輕肝臟纖維化[13]。MSC分泌乳脂小球-EGF因子8(milk fat globule-EGF factor 8, MFGE8)減少星狀細(xì)胞表面的TGF-β1受體表達(dá),還可以通過(guò)激活Notch通路下調(diào)星狀細(xì)胞的α-SMA表達(dá),從而抑制星狀細(xì)胞的活化[14]。除Treg和Th17細(xì)胞比例失調(diào)外,IL-17水平也有顯著下降,兩者共同抑制了星狀細(xì)胞活化并促進(jìn)其凋亡,進(jìn)而影響了Ⅰ型膠原的沉積及胞外基質(zhì)的合成[15],相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這可能和TGF-β/Smad通路、NADPH氧化酶通路被抑制有關(guān)[16]。此外,MSC還可以分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-9、MMP-14等直接降解胞外基質(zhì)[17]。直接和間接兩種途徑協(xié)同減輕了肝臟纖維化的程度。

2.3 Exo通過(guò)多種機(jī)制減少肝臟損傷并助其再生

Exo是一種攜帶多種生物活性物質(zhì)的細(xì)胞外囊泡,從MSC分泌的Exo由于其無(wú)細(xì)胞特性日益受到重視。和細(xì)胞相比,Exo體積更小,結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單,更容易合成和保存,形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)也更小。更重要的是,因其膜蛋白數(shù)量更少故免疫原性也遠(yuǎn)低于MSC,能避免干細(xì)胞直接移植帶來(lái)的很多問(wèn)題。研究[18]發(fā)現(xiàn),MSC-Exo能減輕肝移植中肝的缺血再灌注程度,這可能和Exo激活鞘氨醇激酶和鞘氨醇-1-磷酸通路有關(guān)。在刀豆球蛋白-A(concanavalin A, Con-A)誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型[19]中發(fā)現(xiàn),Exo可以遷移到肝臟,增加肝組織增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表達(dá),使肝細(xì)胞從G0期進(jìn)入G1期。Zhao等[20]發(fā)現(xiàn)Exo通過(guò)自噬途徑減少肝細(xì)胞的凋亡,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增多,促凋亡蛋白cleaved caspase-3表達(dá)減少。Lin等[21]發(fā)現(xiàn)Exo中l(wèi)et-7a-5p通過(guò)MAP4K3通路增加轉(zhuǎn)錄因子EB (transcription factor EB, TFEB)的核轉(zhuǎn)位來(lái)增強(qiáng)肝臟自噬活動(dòng),最終緩解慢加急性肝衰竭(acute on chronic liver failure, ACLF)患者的肝損傷。

Exo還可以通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體通路減輕肝細(xì)胞炎性損傷。有研究[22]發(fā)現(xiàn)增加Exo中miR-223的表達(dá)強(qiáng)度明顯降低了小鼠肝組織中NLRP3的表達(dá);急性肝損傷動(dòng)物模型中也發(fā)現(xiàn)MSC的Exo可以阻斷IL-6介導(dǎo)的信號(hào)通路[23]和下調(diào)NLRP3通路[24]。此外,它還可以降低血管內(nèi)皮黏附分子1的表達(dá)下調(diào)免疫強(qiáng)度發(fā)揮抗炎作用[25]。Exo同樣可以下調(diào)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的肝星狀細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路的信號(hào)強(qiáng)度[26],降低星狀細(xì)胞的活化程度,以此減輕肝纖維化。

3 干細(xì)胞治療ESLD的臨床研究

在治療肝病方面最常用的干細(xì)胞是MSC,其次是預(yù)先用粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)動(dòng)員后獲得的骨髓源性干細(xì)胞(bone marrow derived stem cell, BMSC),前者以BM-MSC和UC-MSC多見(jiàn),供體干細(xì)胞來(lái)源多為自體或同種異體。

3.1 干細(xì)胞治療肝衰竭 自體MSC移植對(duì)治療ACLF患者是安全的,在短期內(nèi)可以改善肝衰竭患者的肝功能。Salama等[27]對(duì)HCV相關(guān)肝衰竭患者的BM-MSC進(jìn)行G-CSF動(dòng)員后由外周靜脈自體輸注,隨訪26周后發(fā)現(xiàn),移植組54%的患者轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白、膽紅素等水平得到改善。該團(tuán)隊(duì)[28]還應(yīng)用自體BM-MSC經(jīng)肝動(dòng)脈或門(mén)靜脈移植入48例肝衰竭患者,半年后患者的凝血功能?chē)?guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio, INR )恢復(fù)正常水平,肝功能和腹水有所好轉(zhuǎn)。Garg等[29]亦發(fā)現(xiàn)BM-MSC可以明顯降低ACLF患者的肝功能評(píng)分(包括Child-Pugh、MELD和SOFA評(píng)分)。有研究[30]將自體BM-MSC在體外誘導(dǎo)分化為HLC后回輸入體內(nèi),隨訪6個(gè)月后發(fā)現(xiàn)移植組患者的下肢水腫和腹水明顯改善。Peng等[31]將自體BM-MSC從肝動(dòng)脈輸入HBV相關(guān)肝衰竭患者體內(nèi),48周后觀察到血清總膽紅素下降,白蛋白升高,MELD評(píng)分降低。

一項(xiàng)非盲隨機(jī)對(duì)照研究[32]旨在探究BM-MSC治療肝衰竭的有效性,共有56例HBV相關(guān)ACLF患者接受注射同種異體的BM-MSC[(1～10)×105個(gè)/kg],每周1次,連續(xù)4周,隨訪24周后發(fā)現(xiàn)患者血清總膽紅素水平、MELD評(píng)分改善,移植組的嚴(yán)重感染發(fā)生率較對(duì)照組顯著下降(16.1% vs 33.3%,P=0.04),24周累積生存率移植組顯著高于對(duì)照組(73.2% vs 55.6%,P=0.03)。這至少表明同種異體BM-MSC在短期內(nèi)可以改善肝衰竭患者的肝功能,且安全性較好。

還有研究者[33]將UC-MSC由肝動(dòng)脈注入11例HBV相關(guān)ACLF患者體內(nèi)(1×108個(gè)/次),4周后發(fā)現(xiàn)血清中白蛋白、轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素、INR水平和MELD評(píng)分較前改善,繼續(xù)隨訪24個(gè)月,未觀察到和輸注相關(guān)的嚴(yán)重不良事件的發(fā)生。

3.2 干細(xì)胞治療病毒性肝炎引起的失代償期肝硬化

BM-MSC治療病毒引起的失代償肝硬化患者具有不錯(cuò)的安全性和效果。Xu等[11]將乙型肝炎肝硬化失代償期患者的自體BM-MSC經(jīng)肝動(dòng)脈輸入體內(nèi),隨訪24周,移植組20例完成隨訪,對(duì)照組19例完成隨訪。結(jié)果顯示移植組的肝功能、MELD評(píng)分顯著優(yōu)于對(duì)照組。除乙型肝炎引起的失代償肝硬化外,有研究[34]提示MSC治療由HCV引起的肝硬化同樣可以降低患者的Child-Pugh評(píng)分和MELD評(píng)分,同時(shí)發(fā)現(xiàn)MSC的注射途徑和是否分化為HLC并不影響整體治療效果。但并非所有BM-MSC移植后都呈現(xiàn)滿意的療效。Mohamadnejad等[35]的研究納入了27例肝硬化失代償期患者,15例從外周血注射自體BM-MSC,剩余對(duì)象注射生理鹽水作為對(duì)照。1年后兩組間肝功能評(píng)分和INR無(wú)明顯差異,該結(jié)果不排除和注射途徑、BM-MSC的質(zhì)量有關(guān)。

G-CSF動(dòng)員后的干細(xì)胞同樣可以改善失代償肝硬化患者的病情。Guo等[36]利用G-CSF先將失代償期肝硬化患者的CD34+BMSC動(dòng)員至外周血,之后富集外周血中的干細(xì)胞并由肝動(dòng)脈回輸至肝臟,發(fā)現(xiàn)富集后回輸組的治療效果優(yōu)于單純G-CSF動(dòng)員組。之后約10年的隨訪結(jié)果顯示,患者血清白蛋白、膽堿酯酶水平提高,凝血功能改善,MELD評(píng)分下降,平均生存期由71個(gè)月延長(zhǎng)至94個(gè)月,5年生存率由52.1%升高至71.2%。 Khan等[37]針對(duì)HBV和HCV引起的肝硬化患者,從肝動(dòng)脈注入G-CSF動(dòng)員后的BM-MSC,6個(gè)月后結(jié)果提示白蛋白升高,轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素下降,Child-Pugh評(píng)分改善。國(guó)外其他類(lèi)似的研究[38-39]也發(fā)現(xiàn)患者移植經(jīng)過(guò)或未經(jīng)過(guò)動(dòng)員的BMSC后未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng),肝功能血清學(xué)指標(biāo)好轉(zhuǎn),肝功能評(píng)分明顯下降,患者的臨床癥狀和相關(guān)并發(fā)癥得到緩解。G-SCF動(dòng)員后,不管被移植入的是BM-MSC還是BMSC,患者都表現(xiàn)出了不錯(cuò)的耐受性,肝功能明顯好轉(zhuǎn),肝臟再生活動(dòng)基因表達(dá)上調(diào)[40]。在由肝動(dòng)脈注射BM-MSC的研究中,HBV相關(guān)的肝硬化患者6個(gè)月的Child-Pugh評(píng)分遠(yuǎn)低于對(duì)照組[41]。

Zhang等[42]的研究將UC-MSC從外周靜脈注入乙型肝炎相關(guān)失代償期肝硬化患者體內(nèi),48周后發(fā)現(xiàn)患者腹水減少,肝功能和MELD評(píng)分均改善。同樣的治療方法在乙型肝炎相關(guān)ACLF患者中得到相同的結(jié)論[43]。Lin等[44]的研究探討了UC-MSC治療在肝硬化患者中的安全性,在移植干細(xì)胞后不同時(shí)段監(jiān)測(cè)血清中血糖、總膽固醇、尿素氮、甲胎蛋白、白細(xì)胞數(shù)和凝血酶原活動(dòng)度,結(jié)果表明很少有患者發(fā)生致瘤或其他嚴(yán)重不良反應(yīng),且UC-MSC治療對(duì)上述血清學(xué)指標(biāo)影響微乎其微,表明UC-MSC可以提高患者的生存質(zhì)量,安全性值得肯定。該團(tuán)隊(duì)還對(duì)HBV相關(guān)的肝硬化失代償患者作了長(zhǎng)達(dá)7年的預(yù)后隨訪研究,219例患者分為UC-MSC處理組108例和對(duì)照組111例,處理組共接受了3次MSC注射,每次間隔4周。結(jié)果顯示,在13～75個(gè)月的總體生存率處理組高于對(duì)照組,但肝細(xì)胞癌患病率兩組之間并無(wú)顯著差異;48周內(nèi)處理組的白蛋白、總膽紅素、膽堿酯酶和凝血酶原活動(dòng)度明顯改善,且未出現(xiàn)治療相關(guān)的并發(fā)癥,結(jié)果表明UC-MSC在改善HBV相關(guān)肝硬化患者的長(zhǎng)期生存率方面也有積極的作用[45]。

3.3 干細(xì)胞治療其他原因引起的失代償期肝硬化 BM-MSC可以減輕酒精性肝硬化患者的肝纖維化程度。有研究應(yīng)用自體BM-MSC治療酒精性肝硬化失代償期患者,結(jié)果顯示除肝功能和評(píng)分改善外,肝纖維化相關(guān)蛋白,如Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1等表達(dá)減少,肝臟病理也提示肝臟結(jié)構(gòu)有所恢復(fù),輸注2次后肝臟組織膠原含量減少了37%[46],Jang等[47]的類(lèi)似研究結(jié)果也提示患者肝組織學(xué)改善。Pai等[48]在酒精性肝硬化人群中應(yīng)用BM-MSC治療后觀察到膽紅素、轉(zhuǎn)氨酶水平降低,Child-Pugh評(píng)分下降,以及腹水減少。這充分說(shuō)明了自體干細(xì)胞治療失代償期肝硬化患者的有效性。

隨著對(duì)干細(xì)胞治療機(jī)制的認(rèn)識(shí)加深,其免疫調(diào)節(jié)功能被越來(lái)越多應(yīng)用于治療某些自身免疫性疾病。在自身免疫性肝病患者中應(yīng)用G-CSF動(dòng)員后的CD34+BMSC治療,患者肝功能指標(biāo)可以恢復(fù)正常[28];某些自身免疫性疾病(如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性干燥綜合征等)引起的肝硬化患者移植UC-MSC后表現(xiàn)出了良好的耐受性,隨訪2年間肝功能逐步恢復(fù)[49]。針對(duì)原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)患者的兩項(xiàng)干細(xì)胞治療的臨床研究[50]結(jié)果顯示,移植BM-MSC和UC-MSC后,患者肝功能的血清學(xué)指標(biāo)顯著改善,包括轉(zhuǎn)氨酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶等,同時(shí)IL-10、CD4+/CD25+T淋巴細(xì)胞水平都有所上升。但對(duì)于免疫性疾病導(dǎo)致的失代償期肝硬化,個(gè)別利用干細(xì)胞治療案例出現(xiàn)了很?chē)?yán)重的后果。有研究[51]利用BM-MSC治療PBC和自身免疫性肝炎(AIH)導(dǎo)致的肝硬化患者各1例,結(jié)果雖然顯示肝功能得到了好轉(zhuǎn),但患者出現(xiàn)了腎衰竭及其他并發(fā)癥。該團(tuán)隊(duì)之后用骨髓干細(xì)胞由外周靜脈輸入2例PBC和4例AIH患者體內(nèi)治療,患者的肝功能并未好轉(zhuǎn)甚至出現(xiàn)了2例死亡[36]。以上結(jié)果提示利用干細(xì)胞治療免疫相關(guān)ESLD還需謹(jǐn)慎。

最后,針對(duì)其他原因(如藥物性肝炎、遺傳性肝病、特發(fā)性肝病等)導(dǎo)致的ESLD,干細(xì)胞療法亦有可喜的成效。通過(guò)將自體BM-MSC或G-CSF動(dòng)員后的干細(xì)胞直接經(jīng)肝臟注射治療后,患者未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng),肝功能和相關(guān)評(píng)分均得到改善[52]。對(duì)于非病毒性肝炎引起的肝硬化失代償期患者而言,自體BM-MSC移植后血清白蛋白水平和MELD評(píng)分改善顯著[53]。而對(duì)BM-MSC-Exo的治療作用仍處在基礎(chǔ)研究階段,暫時(shí)沒(méi)有相關(guān)臨床研究報(bào)道。

4 干細(xì)胞治療ESLD的問(wèn)題

盡管干細(xì)胞治療ESLD取得了不錯(cuò)的成果,細(xì)胞治療肝病是一條新的極有前景的道路,但仍有太多問(wèn)題亟待解決。

4.1 干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為HLC及肝臟歸巢機(jī)制不明 干細(xì)胞治療機(jī)制不明一定程度上是由于缺乏對(duì)移植細(xì)胞的有效定位手段,無(wú)法得知干細(xì)胞肝臟歸巢及向HLC詳細(xì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程。此外,長(zhǎng)期培養(yǎng)MSC會(huì)降低其分化能力[54]。由于BM-MSC在肝臟受損時(shí)會(huì)自發(fā)向肝臟歸巢,如果清楚其歸巢的條件及促進(jìn)肝臟內(nèi)源性再生的機(jī)制就能避免BM-MSC移植的弊端,這是今后極具挑戰(zhàn)和富有意義的研究方向。

4.2 干細(xì)胞移植的安全性無(wú)法完全保證 2019年的一項(xiàng)評(píng)估MSC致瘤性的研究[55]并未發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和BM-MSC輸注組腫瘤發(fā)病率存在差異,但之前有研究[56]觀察到BM-MSC在體外培養(yǎng)時(shí)會(huì)發(fā)生染色體畸變。除致瘤可能導(dǎo)致移植風(fēng)險(xiǎn)外,由于干細(xì)胞移植是有創(chuàng)操作,在此過(guò)程中就存在傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn),如巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒和細(xì)小病毒B19等。

4.3 不同來(lái)源干細(xì)胞質(zhì)量無(wú)法保證 每種來(lái)源的干細(xì)胞都有各自的優(yōu)勢(shì)和不足,如何選擇哪種干細(xì)胞適合用作移植?首先要建立一套統(tǒng)一的干細(xì)胞質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。其次,如何通過(guò)對(duì)干細(xì)胞預(yù)處理來(lái)優(yōu)化待移植干細(xì)胞的總體質(zhì)量?有必要對(duì)干細(xì)胞的分離鈍化流程進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,并借用相關(guān)技術(shù)來(lái)提升干細(xì)胞活性,如基因編輯、G-CSF動(dòng)員或選用相關(guān)細(xì)胞因子誘導(dǎo),這些都有賴于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的突破來(lái)為臨床提供正確的指導(dǎo)。

4.4 干細(xì)胞使用缺乏標(biāo)準(zhǔn)化導(dǎo)致臨床研究質(zhì)量參差不齊 干細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中的使用未經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化,包括適應(yīng)證和禁忌證、最佳注射途徑、注射劑量、注射次數(shù)等。從現(xiàn)有的臨床研究中總結(jié)來(lái)看:納入對(duì)象包括各種病因引起的ESLD,缺乏同質(zhì)性;單次注射干細(xì)胞數(shù)量跨度太大,范圍在105～109,部分研究按體質(zhì)量計(jì)算單次注射量;隨訪時(shí)間多為2～12個(gè)月;輸注途徑主要有外周靜脈和肝臟注射(肝動(dòng)脈或門(mén)靜脈),部分研究通過(guò)脾臟注射。相關(guān)動(dòng)物研究[57]提示由外周靜脈輸注的MSC相當(dāng)一部分都滯留在肺部,遠(yuǎn)不如由門(mén)靜脈注射的療效好。而通過(guò)門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈輸注干細(xì)胞的歸巢效率分別為小于5%和20%～30%,所以可能肝動(dòng)脈是最佳的輸注途徑[58],但也有研究[29]顯示不同注射方式之間的療效沒(méi)有顯著差異。以上現(xiàn)象導(dǎo)致大多數(shù)的臨床實(shí)驗(yàn)質(zhì)量參差不齊,難以獲得足夠的高質(zhì)量研究得出可靠的結(jié)論。同時(shí),缺乏橫向?qū)Ρ?如探究不同注射方式、注射劑量的療效有無(wú)差別,且其長(zhǎng)期療效缺乏足夠的臨床事實(shí)肯定。

5 展望

當(dāng)前,肝移植是治愈ELSD的唯一手段,但由于肝源缺乏等問(wèn)題導(dǎo)致等待肝移植患者的死亡率逐年升高。在此形勢(shì)下,眾多的臨床研究結(jié)果表明,干細(xì)胞治療已經(jīng)展現(xiàn)出了極大的潛力。其中,關(guān)于MSC的研究最多,大多數(shù)結(jié)果均肯定了其短期改善肝功能的療效,表現(xiàn)為肝臟血清學(xué)指標(biāo)的改善、臨床癥狀的緩解、肝臟相關(guān)評(píng)分的好轉(zhuǎn)、肝臟病理表現(xiàn)有所恢復(fù),且很少發(fā)現(xiàn)和其相關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)。UC-MSC在HBV相關(guān)肝硬化人群中的長(zhǎng)期療效已經(jīng)得到證實(shí),但其他種類(lèi)的干細(xì)胞在各類(lèi)ELSD患者中的長(zhǎng)期療效還未有充足的臨床證據(jù);對(duì)于少數(shù)由于注射干細(xì)胞出現(xiàn)的不良事件,提示未來(lái)需要更加謹(jǐn)慎地評(píng)估相關(guān)人群的干細(xì)胞治療條件。這不僅依賴于臨床研究中對(duì)MSC使用過(guò)程進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)增加研究結(jié)論的可靠性,還需基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域?qū)SC治療肝病的作用機(jī)制研究有進(jìn)一步的突破,包括體內(nèi)歸巢、實(shí)現(xiàn)抗纖維化和免疫調(diào)節(jié)的具體通路和調(diào)控方式。

目前關(guān)于BM-MSC的研究主要集中在如何提高其治療ESLD的效果,可以增加MSC本身的數(shù)量或功能,包括用細(xì)胞因子對(duì)MSC預(yù)處理,或進(jìn)行基因編輯、富集分選等。值得一提的是,有學(xué)者[59]發(fā)現(xiàn)某些中藥可以增強(qiáng)BM-MSC的分化能力,相比于其他處理手段更加安全和廉價(jià),有望成為MSC移植的潛在輔助手段。相比之下,Exo由于體積更小,更易獲取,膜蛋白數(shù)量更少所以免疫排斥性要小于BM-MSC;且其本身為膜結(jié)構(gòu),致瘤可能性比MSC更小,安全性更高;還可以直接跨膜傳遞信息,調(diào)控?fù)p傷肝細(xì)胞的修復(fù)和再生過(guò)程,是非常好的藥物治療載體,所以通過(guò)提高M(jìn)SC-Exo的分泌數(shù)量達(dá)到可觀的治療效果是今后針對(duì)ELSD極有前景的治療方法之一。目前已有一些方法可以提高Exo的分泌數(shù)量,如正切流動(dòng)過(guò)濾法(tangential flow filtration, TFF)可以比單純的超速離心大大增加Exo的數(shù)量,超聲降解更是可以將其產(chǎn)量提高到20倍[60],還有3D培養(yǎng)、利用特殊介質(zhì)如海藻酸水凝膠對(duì)MSC進(jìn)行培養(yǎng)等[61]。早在2015年我國(guó)就頒布了《干細(xì)胞臨床研究管理辦法(試行)》[62],在制度的規(guī)范下,還需開(kāi)展大規(guī)模的多中心臨床隨訪研究保證其用于人體的安全性和有效性,相信不遠(yuǎn)的未來(lái)干細(xì)胞治療會(huì)給更多的ESLD患者帶來(lái)福音。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：林炳亮提出研究選題,設(shè)計(jì)研究方案;馮宇負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn)、撰寫(xiě)論文;陳俊峰、林炳亮提供指導(dǎo)性支持及修訂、終審論文。