向維 韋小蘭 曹科鑫 李良波 黃榮韶

摘 要：? 三七是我國的名貴藥材，但由于連作障礙發(fā)生嚴重，因此土壤中自毒物質(zhì)的積累成為導(dǎo)致三七連作障礙發(fā)生的主要原因之一。生物降解土壤中的自毒物質(zhì)是緩解連作障礙的有效措施，為篩選并利用降解菌使土壤中皂苷類自毒物質(zhì)快速消減，該研究以皂苷類自毒物質(zhì)為篩選靶標，采用富集和馴化策略，從連作三七根際土壤中分離、篩選三七皂苷類自毒物質(zhì)降解細菌，結(jié)合16S rRNA基因測序?qū)Ω呋钚跃赀M行分類鑒定，并對篩選得到的高活性菌株SC3的降解特性進行了研究。結(jié)果表明：（1）從三七根際土壤中成功分離出8株潛在自毒物質(zhì)降解細菌，初篩評價結(jié)果顯示SC3菌株對三七總皂苷的降解率最高，達87.42%。（2）通過16S rRNA基因序列分析，編號SC3的高活性菌株被鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）細菌。（3）在相同培養(yǎng)條件下，菌株SC3對單體皂苷Rb1的降解效果強于對Rg1的降解。（4）在液體培養(yǎng)條件下，底物濃度、接種量和培養(yǎng)溫度均會顯著影響SC3菌株對單體皂苷Rb1的降解效果。綜上表明，采用富集和馴化策略可以有效篩選自毒物質(zhì)降解細菌，SC3菌株具有消除連作土壤中皂苷類自毒物質(zhì)的潛力。該研究結(jié)果為連作土壤修復(fù)提供了生物資源，并為今后深入研究皂苷降解機制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 三七， 自毒作用， 自毒物質(zhì)， 皂苷， 生物降解

中圖分類號：? Q948

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2023）07-1173-09

收稿日期：? 2023-02-28

基金項目：? 國家自然科學(xué)基金（81860669）；? 湖南省教育廳科學(xué)研究項目（21C0127）。

第一作者： 向維（1990-），博士，講師，主要從事中藥資源及開發(fā)研究，（E-mail）weixiang@hunau.edu.cn。

通信作者：? 黃榮韶，博士，教授，主要從事藥用植物繁育與栽培技術(shù)研究，（E-mail）hrshao802@163.com。

Isolation and characterization of autotoxic saponins-degrading

bacterial strains from Panax notoginseng

XIANG Wei1，3， WEI Xiaolan3， CAO Kexin3， LI Liangbo2， HUANG Rongshao2*

（ 1. College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China; 2. College of Pharmacy， Guangxi University

of Chinese Medicine， Nanning 530200， China; 3.? College of Agricultural， Guangxi University， Nanning 530004， China ）

Abstract：? Panax notoginseng? is a valuable Chinese herb in China， and the root should be harvested between three and seven years after planting it. However， the growth of P. notoginseng is frequently hindered due to replanting failure. There have been numerous studies proving that the accumulation of allelochemicals in the soil is considered to be one of the reasons for the replanting failure of P. notoginseng. Biodegradation of allelochemical in soil has been shown to be an effective measure to alleviate continuous cropping obstacles， so screening allelochemical-degrading bacteria could provide biological resources for soil remediation. Based on this， this study adopted a research strategy of enrichment and domestication to isolate and screen saponin-degrading bacteria from the rhizosphere soil of P. notoginseng， which had been grown continuously for three years and more. Also， the highly active strains were identified by 16S rRNA gene analysis. In addition， the effect of highly active strain SC3 on degrading allelochemicals under different conditions was studied by HPLC. The results were as follows： （1） Eight strains of potentially degrading bacteria were successfully isolated from the rhizosphere soil of P. notoginseng. The results of the initial screening evaluation showed that strain SC3 had the best biodegradation effect on total saponins with 87.42% degradation rate. （2） Strain SC3 was identified as Stenotrophomonas sp. based on 16S rRNA gene analysis coupled with physiological and biochemical analyses. （3） The biodegradation of ginsenoside Rb1 by strain SC3 was stronger than its biodegradation of ginsenoside Rg1 under the same culture conditions. （4） The degradation of ginsenoside Rb1 by SC3 strain under liquid culture conditions was significantly affected by different factors， such as substrate concentration， inoculum amount and culture temperature. All the results indicate that the enrichment and domestication strategy can effectively screen allelochemical-degrading bacteria， and a possible application of strain SC3 in the bioremediation of saponin contamination in agricultural environments. The results provide biological resources for replanting soil remediation and theoretical basis for further study of saponin degradation mechanism.

Key words： Panax notoginseng， autotoxicity， allelochemical， saponins， biodegradation

三七（Panax notoginseng）為五加科（Araliaceae）人參屬（Panax L.）植物，是治療和預(yù)防心腦血管疾病的中藥原料藥材。三七分布范圍狹窄，主要分布于云南文山和廣西百色一帶（黃榮韶等，2007）。由于市場上的三七主要依靠人工栽培，加之有限的土地資源，因此導(dǎo)致同一地塊連續(xù)復(fù)種，并且面積不斷增加。而三七等人參屬植物是一種忌連作植物，連作往往引起爛根、病害頻發(fā)等諸多問題，進而導(dǎo)致產(chǎn)量下降甚至絕收（孫雪婷等，2015）。因此，連作障礙嚴重已成為制約三七產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大問題。導(dǎo)致三七連作障礙的主要因素包括由生物、非生物因素引起的土壤理化性狀惡化、土傳病害加重、自毒物質(zhì)產(chǎn)生的自毒作用和環(huán)境壓力等（Liu et al.， 2019）。其中，自毒作用是導(dǎo)致三七連作障礙的主要原因之一（譚勇等，2017；Ren et al.， 2017；Zhang et al.， 2018）。

自毒作用是化感作用的一種表現(xiàn)形式，是植物通過淋溶、揮發(fā)、根系分泌和植物殘體降解等途徑釋放某些生物活性物質(zhì)到環(huán)境中，并對自身的生長發(fā)育產(chǎn)生抑制作用。引起三七自毒作用的物質(zhì)主要有糖類、氨基酸、有機酸、皂苷類和黃酮類物質(zhì)（游佩進，2009；向維，2016）。這些物質(zhì)可由植株通過淋溶、根系分泌等途徑釋放，并在土壤中累積，直接或間接抑制三七的生長（林娟等，2007）。越來越多的研究表明，皂苷類物質(zhì)對三七生長具有較強的自毒活性。Yang等（2015）在三七連續(xù)耕作的土壤和根系分泌物中鑒定出多種皂苷，并隨著種植年限的增加部分皂苷會在土壤中積累。Qiao等（2019）的研究表明，三七連作土壤中分離出的多種三萜類皂苷成分，對三七生長會產(chǎn)生自毒作用。Yang等（2018）研究表明，單體皂苷Rg1可以通過抑制三七根系抗壞血酸過氧化物酶和參與谷胱甘肽酶活性增加活性氧的積累，從而破壞根細胞膜和細胞壁。由此可見，皂苷類物質(zhì)可以通過根系分泌等途徑釋放到土壤中并積累，從而加重連作障礙的發(fā)生。

目前，緩解三七連作障礙問題大多采用輪作、土壤高溫消毒和化學(xué)防治等措施（Liu et al.， 2019）。這些措施，一方面耗時耗力，另一方面過多的化學(xué)試劑影響藥材的品質(zhì)，更造成生態(tài)的破壞。因此，開發(fā)綠色防控技術(shù)是當(dāng)務(wù)之急。通常情況下，土壤中微生物降解或轉(zhuǎn)化自毒物質(zhì)決定其自毒作用的存在方式與表達。因此，找到自毒物質(zhì)高效降解菌將為緩解連作障礙提供一種新的途徑。土壤微生物是土壤微生態(tài)中最重要的功能組分，其在物質(zhì)與能量循環(huán)、土壤結(jié)構(gòu)、自毒物質(zhì)降解、病原微生物調(diào)控及土壤微生態(tài)平衡保持等方面發(fā)揮重要作用（Berendsen et al.， 2018；Lundberg & Teixeira， 2018）。已有大量研究證明，微生物對降解土壤中積累的自毒物質(zhì)有較好的效果（李茹和陳鵬，2011；李敏等，2019；Liu et al.， 2019）。目前，研究人員已經(jīng)篩選到了一些能降解自毒物質(zhì)的細菌，主要是針對酚酸類物質(zhì)，這些微生物主要來源于土壤等外界環(huán)境，如假單胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobia）、芽孢桿菌（Bacillus）、鏈霉菌（Streptomyces）等（李敏等，2019）。但是，目前對于總皂苷類物質(zhì)降解菌株的報道卻較少。因此，篩選并利用降解菌使土壤中皂苷類自毒物質(zhì)快速消減，對后續(xù)開展連作土壤生物修復(fù)的研究具有重要意義。

本研究以皂苷類自毒物質(zhì)為篩選靶標，采用富集和馴化策略從三七根際土壤中分離降解細菌，同時結(jié)合16S rRNA基因測序分析對活性菌株進行分類鑒定，并綜合利用化學(xué)法、色譜法評價分離菌株的降解能力。擬探討：（1）從連作三七根際土壤篩選皂苷類自毒物質(zhì)降解細菌的可行性；（2）菌株對三醇型和二醇型皂苷降解能力的差異；（3）液體培養(yǎng)條件下，不同因素對降解菌降解能力的影響。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

在廣西百色市那坡縣三七人工種植基地（A，105°55′56″ E、23°34′11″ N）、廣西百色市田林縣三七人工種植基地（B，106°3′1″ E、24°11′28″ N）、那坡縣某農(nóng)戶家半野生三七地（C，105°54′29″ E、23°21′51″ N）、云南文山市三七人工種植基地（D，103°50′33″ E、23°57′38″ N）采集樣品。從每個采樣地隨機選取5個點，選擇3年生及以上的健康三七，用鐵鏟小心地將植株連根挖出，抖落根周圍土壤，用刷子輕刷根系收集根際土壤。

1.2 儀器和試劑

Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，Biolog GenIII鑒定微孔板購自美國BIOLOG公司。紫外分光光度計（UV1800，日本島津公司）、菌種鑒定儀（GEN III，美國BIOLOG公司）、PCR儀（impliAmp，賽默飛世爾科技有限公司）。

Luria-Bertani培養(yǎng)基（LB，pH 7.0）： 含胰蛋白胨10.0 g·L-1、酵母提取物5.0 g·L-1和NaCl 10.0 g·L-1。無機鹽離子培養(yǎng)基（MSM，pH 7.0）： 含（NH4）2SO4 1.0 g·L-1、KH2PO4 0.5 g·L-1、K2HPO4 1.5 g·L-1、NaCl 1.0 g·L-1和MgSO4·7H2O 0.1 g·L-1。 TSA培養(yǎng)基（pH 7.0）： 胰蛋白胨15 g·L-1、大豆蛋白胨5 g·L-1、氯化鈉5 g·L-1。

1.3 降解菌的富集和馴化

將土壤樣品中的雜物清理干凈，取不同采樣點的土壤樣品5 g，分別添加到100 mL含有50 mg·mL-1總皂苷的MSM液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃、180 r·min-1的恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)7 d。此后，每7 d取上一次培養(yǎng)液10 mL轉(zhuǎn)接到新的MSM培養(yǎng)液中，并提高總皂苷的底物濃度至100 mg·mL-1，于相同條件下培養(yǎng)。重復(fù)此操作，并提高底物濃度（2倍法）直至總皂苷最高濃度達到400 mg·mL-1為止。每個處理均設(shè)3次重復(fù)，以加入無菌水為空白對照（刁碩等，2017）。

1.4 降解菌的分離及純化

取最后一次富集菌液，將菌液10倍比稀釋，吸取一定量的稀釋液分別涂布至LB固體培養(yǎng)基上，以無菌水為對照，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄菌落形狀、大小、透明度及顏色等。將同一平板上不同形態(tài)的菌落分別接種至含400 mg·mL-1三七總皂苷的MSM固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，直至長出單菌落。繼續(xù)挑選單菌落劃線培養(yǎng)，重復(fù)此步驟，至平板上所有菌落的外部形態(tài)一致。將分離純化后的菌株分別用甘油超低溫和真空凍干2種保存方法保存，備用。

1.5 降解能力初篩

將純化后的菌種接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，用無菌水重懸菌液；取5 mL菌液接種到含有200 mg·mL-1總皂苷的100 mL MSM液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)，所有處理重復(fù)3次，以接種無菌水為對照。96 h后，對培養(yǎng)物離心且收集上清液，用氯仿萃取上清液，保留氯仿層、揮干，用乙醇定量溶解后基于香草醛法測定培養(yǎng)液中總皂苷含量（丁永麗等，2013）。精密配制分別含50、100、150、200、250 mg·mL-1濃度的總皂苷供試溶液，以MSM培養(yǎng)基為校正空白，測量總皂苷含量。以總皂苷濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，計算校正方程和R2值。

1.6 降解菌16S rRNA基因序列分析

使用基因組DNA抽提試劑盒提取細菌基因組，使用通用引物27F和1492R從基因組擴增16S rRNA基因（Xiang et al.， 2020）。PCR產(chǎn)物委托給上海生工進行測序。所得的16S rRNA基因序列提交給EzBioCloud在線鑒定，并將序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，通過MEGA X軟件使用鄰位算法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Bootstrap=1 000檢驗各分支的置信度（Sudhir et al.， 2018）。

1.7 菌株SC3的降解特性

1.7.1 菌株SC3對單體皂苷的降解 配制含人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、400 mg·mL-1的MSM液體培養(yǎng)基，pH 7.0，含人參皂苷Rg1的MSM培養(yǎng)基配置濃度同上。在無菌條件下，將SC3供試菌液以5%（V/V）接種量接入培養(yǎng)基中，以不接種菌株為對照，培養(yǎng)基置于30 ℃、180 r·min-1條件下的搖床中培養(yǎng)，所有試驗重復(fù)3次。96 h后，每瓶培養(yǎng)基取3 mL菌液在9 500 r·min-1條件下離心2 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜，參考Zhou等（2008）的方法通過HPLC檢測樣品含量。

1.7.2 接種量對降解效果的影響 以含400 mg·mL-1人參皂苷Rb1的液體MSM培養(yǎng)基（pH 7.0）為基礎(chǔ)，控制SC3供試菌液以5%、10%、15%、20%（V/V）的接種量接入培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，以不接種降解菌的培養(yǎng)基為對照。3次重復(fù)，在培養(yǎng)120 h后，通過HPLC分析樣品。

1.7.3 培養(yǎng)溫度對降解效果的影響 以含400 mg·mL-1人參皂苷Rb1的液體MSM培養(yǎng)基（pH 7.0）為基礎(chǔ)，控制SC3供試菌液以5%、10%、15%、20%（V/V）的接種量接入培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，以不接種降解菌的培養(yǎng)基為對照。3次重復(fù)，在培養(yǎng)120 h后，通過HPLC分析樣品。

1.7.4 pH對降解效果的影響 將SC3供試菌液以5%（V/V）的接種量接種到含400 mg·mL-1人參皂苷Rb1的液體MSM培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)基pH為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，于30 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，以不接種降解菌的培養(yǎng)基為對照。3次重復(fù)，在培養(yǎng)120 h后，通過HPLC分析樣品。

1.7.5 人參皂苷Rb1降解過程跟蹤 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，在優(yōu)化條件下測量SC3菌株對人參皂苷Rb1的降解曲線。以400 mg·mL-1人參皂苷Rb1的液體MSM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，調(diào)pH至7.0左右，將SC3供試菌液以5%（V/V）的接種量接入培養(yǎng)基中，以未接種菌株為對照組，于30 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)期間每隔12 h取樣10 mL，通過HPLC分析Rb1殘留量。

1.8 數(shù)據(jù)處理分析

數(shù)據(jù)處理分析均使用SPSS v24.0軟件進行，統(tǒng)計學(xué)差異顯著性通過Duncan和LSD檢驗進行評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七皂苷類自毒物質(zhì)降解菌的分離及篩選

基于光學(xué)顯微鏡形態(tài)鑒定，從LB培養(yǎng)基上挑選顏色或形態(tài)特征具有差異的微生物，經(jīng)劃線純化后獲得細菌分離物8株，編號分別為SAZ3、PSCZ2、SCZ1、SC2、SC3、SBZ1、PSBZ1和SDZ1?；谙悴萑┓ǔ醪綔y定了潛在三七皂苷降解菌的降解能力，結(jié)果如表1所示。通過檢測方法線性考察的結(jié)果顯示，在三七總皂苷濃度為50～250 mg·mL-1時吸光度與濃度線性關(guān)系良好，可用于目標范圍內(nèi)含量的計算。在以三七總皂苷為唯一碳源的MSM液體培養(yǎng)基中，其自然降解率約為15%。這些菌株對三總皂苷的相對降解率范圍在3.31%～87.42%之間，其中菌株SC3對三七總皂苷的降解率最大。

2.2 降解菌的16S rRNA基因鑒定

提取降解菌的基因組DNA，并完成16S rRNA基因測序，將得到的序列與數(shù)據(jù)庫已知序列進行BLAST比對，結(jié)果見表2；圖1為高效降解菌株SC3與相似度較高對照菌的系統(tǒng)進化樹。菌株SC3與Stenotrophomonas nitritireducens同源性最近，序列相似度達98.07%。通過上述的綜合分析，將這株菌鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）細菌，菌株序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為MW 045205。

2.3 菌株SC3對單體皂苷的降解特性

2.3.1 菌株SC3對單體皂苷Rg1和Rb1的降解 標準曲線結(jié)果顯示，當(dāng)人參皂苷Rg1檢測濃度為3.125～400 mg·mL-1、Rb1檢測濃度為25～400 mg·mL-1時，濃度與峰面積線性關(guān)系良好。將SC3菌株分別接種至以這兩種單體皂苷為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基中，結(jié)果如表3所示。在接種96 h后，菌株SC3對不同濃度Rb1降解量均高于對Rg1的降解，對400 mg·mL-1的Rb1降解率接近90%。因此，接下來研究菌株SC3對Rb1的降解，并優(yōu)化培養(yǎng)條件。

2.3.2 不同因素對菌株SC3降解人參皂苷Rb1的影響 在以400 mg·mL-1人參皂苷Rb1為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基中，不同接種量、培養(yǎng)溫度和pH對菌株SC3降解人參皂苷Rb1的影響。圖2、圖3、圖4結(jié)果均表明，不同因素對降解率影響存在顯著差異。不同菌液接種量條件下，人參皂苷Rb1的降解率均較高，當(dāng)接種量為10%時降解效果最好，并顯著高于另外3組（P<0.05），即使是最低降解組（20%接種量）其降解率均值也達到86%（圖2）。菌株SC3對培養(yǎng)溫度具有良好的耐受力，在25～40 ℃之間，對人參皂苷Rb1的降解率均大于80%。而在培養(yǎng)溫度為30 ℃和35 ℃時，降解效果顯著好于其他組（P<0.05）（圖3）。菌株SC3對培養(yǎng)基pH較為敏感，在pH為4、5時，降解率低于60%。在pH為7、8時，降解率均超過90%，顯著高于其他pH處理組（圖4）。

2.3.3 菌株SC3降解人參皂苷Rb1的過程跟蹤 選用底物濃度400 mg·mL-1、培養(yǎng)基pH 7.0、培養(yǎng)溫度30 ℃和接種量10%（V/V）的條件，對菌株SC3降解人參皂苷Rb1的過程進行跟蹤監(jiān)測，96 h內(nèi)結(jié)果如圖5、圖6所示。從圖5、圖6可以觀察到，人參皂苷Rb1在前12 h降解較少，第48 h時人參皂苷Rb1降解超過62%，60 h后降解速率明顯放緩，在96 h后接近完全降解。

3 討論與結(jié)論

利用從植物根際篩選的微生物來降解自毒物質(zhì)，是行之有效的方法。王羅濤等（2020）從三七根際土壤篩選出一株對皂苷具有較好降效效果的蒙氏假單胞菌菌株P(guān)M-41，并對毀滅柱孢菌具有明顯拮抗活性。本研究采用類似策略，從三七根際土壤中成功分離出8株潛在降解細菌，它們均能在以皂苷為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中生長，其中菌株SC3菌株對皂苷的降解效果最好。該策略是利用了細菌的趨化性，利用自毒物質(zhì)對目標微生物進行富集。朱曉艷等（2019）研究表明細菌能在化學(xué)物質(zhì)的影響下移動，要么靠近要么遠離異源物質(zhì)，這有助于細菌找到生長和生存的最佳條件。這些化學(xué)物質(zhì)作為微生物吸引劑，既是引起土壤微生物群落動態(tài)變化或組成的主要驅(qū)動因素，又為土壤微生物提供了主要碳和能源（Lundberg & Teixeira， 2018）。例如，糖、氨基酸和糖醇等是普遍的微生物吸引劑，酚類和黃酮類化合物是某些特定微生物的信號分子（李茹等，2011）。三七是多年生植物，其根系分泌物積聚在根際中，并且為微生物生長提供底物，久而久之，不能適應(yīng)環(huán)境變化的菌種被淘汰（Zhang et al.， 2019）。

本研究結(jié)果表明，從根際土壤中篩選的菌株具有高效降解自毒物質(zhì)的能力。但是，這些菌株在連作土壤生態(tài)修復(fù)中的作用還有待進一步研究。

由于三七連作根際土壤中人參皂苷Rb1和Rg1的含量占比最高（Yang et al.， 2015），因此本研究針對這兩種單體皂苷進行了降解研究。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株SC3在以Rg1為唯一碳源時，生長速率明顯緩于以Rb1為唯一碳源時的生長，菌株SC3對人參皂苷Rb1的降解率顯著大于對人參皂苷Rg1的降解。微生物分泌的酶可對皂苷C-3、C-6或C-20位上的糖基進行水解，不同微生物或不同特異性的酶決定了皂苷的降解效果和途徑。人參皂苷Rg1和Rb1分別屬于三醇型和二醇型皂苷，它們在結(jié)構(gòu)上具有明顯的差異。人參皂苷Rb1的C-20位是以β-（1，6）糖苷鍵相連接的二個葡萄糖，Rg1的C-20位是以α-（1，6）糖苷鍵相連接2個不同類型糖（Bi et al.， 2019）。這說明Rb1分解的糖苷降解酶能特異性地作用于某個位點，不同的空間結(jié)構(gòu)會對酶的作用產(chǎn)生阻礙作用。張慶鋒等（2021）報道菌株分泌的β-葡萄糖苷酶能作用于C-3和C-20位置上的特定糖苷鍵。劉欣茹等（2018）構(gòu)建了β-葡萄糖苷酶基因的表達載體且轉(zhuǎn)化至赤酵母中表達，并利用工程菌成功將人參皂苷Rb1進行轉(zhuǎn)化。據(jù)報道，人參皂苷Rb1在微生物的作用下可通過Rb1→GXVII→F2→C-K、Rb1→Rd→F2→C-K、Rb1→GXVII→GLXXV→C-K（Shen et al.， 2013；趙倩等，2021）等途徑進行轉(zhuǎn)化或降解。這些途徑除了需要水解β-葡萄糖外，還需要可以水解呋喃阿拉伯糖、吡喃阿拉伯糖或木糖的糖苷酶。

此外，非酶促作用還可導(dǎo)致皂苷的降解。本研究發(fā)現(xiàn)，在未加入降解菌的對照組中，特別是培養(yǎng)液pH較低時對照組中皂苷自然降解率更高，這主要是由于存在皂苷酸水解現(xiàn)象。Shen等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，無微生物作用下，在pH為1.2去離子水中人參皂苷Rb1能在1 h內(nèi)水解超過50%。二醇型人參皂苷在酸性條件下會發(fā)生取代糖基的水解、脫水和加成反應(yīng)（趙樂鳳等，2018）。前述研究表明，皂苷在酸性條件下能有效自然降解。但是，種植土壤很難達到這種酸性條件，并且土壤過度酸化不利于植物的生長（Wang et al.， 2020）。

綜上所述，采用富集和馴化策略可有效篩選自毒物質(zhì)降解菌，本研究從三七根際土壤中共分離出8株潛在自毒物降解細菌，但其降解能力存在差異。通過進一步對降解菌的降解特性研究發(fā)現(xiàn)，同一菌株對不同類型的皂苷降解能力存在差異，本研究中的菌株SC3可對二醇型皂苷Rb1高效降解，但對三醇型人參皂苷Rg1降解能力較弱。本研究結(jié)果可為今后深入研究皂苷降解機制提供理論依據(jù)，并為開展三七連作土壤生態(tài)修復(fù)提供技術(shù)參考。

參考文獻：

BERENDSEN RL， VISMANS G， YU K， et al.， 2018. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium ［J］. ISME J， 12（6）： 1496-1507.

BI YF， WANG XZ， JIANG S， et al.， 2019. Enzymatic transformation of ginsenosides Re， Rg1， and Rf to ginsenosides Rg2 and aglycon ppt by using β-glucosidase from Thermotoga neapolitana ［J］. Biotechnol Lett， 41（4）： 613-623.

DIAO S， WANG HQ， XU J， et al.， 2017. Isolation， identification and analysis of degradation ability of a cold-resistant haloduric pyrene-degrading strains ［J］. Chin Environ Sci， 37（2）： 677-685.? ［刁碩， 王紅旗， 許潔， 等， 2017. 低溫耐鹽芘降解菌的篩選鑒定及降解特性研究 ［J］. 中國環(huán)境科學(xué)， 37（2）： 677-685.］

DING YL， WANG YZ， ZHANG J， et al.， 2013. Application of vanillin sulfuric acid colorimetry-ultraviolet spectrometry on quality evaluation of Panax notoginseng ［J］. Spectrosc Spectral Anal， 33（2）： 471-475.? ［丁永麗， 王元忠， 張霽， 等， 2013. 硫酸香草醛顯色-紫外吸收光譜法在三七質(zhì)量評價中的應(yīng)用 ［J］. 光譜學(xué)與光譜分析， 33（2）： 471-475.］

HUANG RS， YANG HJ， HE ZJ， et al.， 2007. Textual research on the origin areas of Panax notoginseng ［J］. Lishizhen Med Mat Med Res， 18（7）： 1610-1611.? ［黃榮韶， 楊海菊， 賀紫荊， 等， 2007. 三七原產(chǎn)地的再考證 ［J］. 時珍國醫(yī)國藥， 18（7）： 1610-1611.］

LI M， ZHANG LY， ZHANG YJ， et al.， 2019. Review on the microbial biodegradation and metabolism of autotoxic phenolic acids ［J］. Asian J Ecotoxicol， 14（3）： 72-78.? ［李敏， 張麗葉， 張艷江， 等， 2019. 酚酸類自毒物質(zhì)微生物降解轉(zhuǎn)化研究進展 ［J］. 生態(tài)毒理學(xué)報， 14（3）： 72-78.］

LI R， CHEN P， 2011.Progress in mechanism of signal transduction and regulation in bacterial chemotaxis ［J］. Biotechnol Bull， （11）： 54-57.? ［李茹， 陳鵬， 2011. 細菌趨化性的信號傳導(dǎo)及調(diào)節(jié)機制研究進展 ［J］. 生物技術(shù)通報， （11）： 54-57.］

LIN J， YIN QY， YANG BZ， et al.， 2007. Review on allelopathy of plants ［J］. Chin Agric Sci Bull， 23（1）： 68-72.? ［林娟， 殷全玉， 楊丙釗， 等， 2007. 植物化感作用研究進展 ［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報， 23（1）： 68-72.］

LIU HJ， YANG M， ZHU SS， 2019. Strategies to solve the problem of soil sickness of Panax notoginseng （Family： Araliaceae）? ［J］. Allelopathy J， 47（1）： 37-56.

LIU XR， LIU CY， XU LQ， et al.， 2018， Construction of Ginsenoside-β-glucosidase gene vector and biotransformation in Pichia pastoris ［J］. Chem J Chin Univ， 39（11）： 2451-2457.? ［劉欣茹， 劉春瑩， 徐龍權(quán)， 等， 2018. 人參皂苷β-葡萄糖苷酶基因的畢赤酵母載體構(gòu)建及生物轉(zhuǎn)化 ［J］. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報， 39（11）： 2451-2457.］

LUNDBERG DS， TEIXEIRA PJ， 2018. Root-exuded coumarin shapes the root microbiome ［J］. Proc Natl Acad Sci， 115（22）： 5629-5631.

QIAO YJ， ZHANG JJ， SHANG JH， et al.， 2019. GC-MS-based identification and statistical analysis of liposoluble components in the rhizosphere soils of Panax notoginseng ［J］. RSC Adv， 9（36）： 20557-20564.

REN X， YAN ZQ， HE XF， et al.， 2017. Allelochemicals from rhizosphere soils of Glycyrrhiza uralensis Fisch： Discovery of the autotoxic compounds of a traditional herbal medicine ［J］. Ind Crops Prod， 97： 302-307.

SHEN H， LEUNG WI， RUAN JQ， et al. 2013. Biotransformation of ginsenoside Rb1 via the gypenoside pathway by human gut bacteria ［J］. Chin Med， 8（1）： 1-11.

SUDHIR K， GLEN S， LI M， et al.， 2018. MEGA X： molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms ［J］. Mol Biol Evol， 35（6）： 1547-1549.

SUN XT， LI L， LONG GQ， et al.， 2015. The progress and prospect on consecutive monoculture problems of Panax notoginseng ［J］. Chin J Ecol， 34（3）： 885-893.? ［孫雪婷， 李磊， 龍光強， 等， 2015. 三七連作障礙研究進展 ［J］. 生態(tài)學(xué)雜志， 34（3）： 885-893.］

TAN Y， CUI YS， JI XL， et al.， 2017. Research progress in microorganism changes of rhizospheric soil and root endogenous and ecology during continuous cropping of Panax notoginseng ［J］. Chin Trad Herb Drugs， 48（2）： 391-399.? ［譚勇， 崔尹贍， 季秀玲， 等， 2017. 三七連作的根際、根內(nèi)微生物變化與生態(tài)學(xué)研究進展 ［J］. 中草藥， 48（2）： 391-399.］

WANG LT， YANG DY， DENG LM， et al.， 2020. Isolation and screening of antagonistic autotoxin-degrading bacteria in Panax notoginseng （Burk.）F. H. Chen rhizosphere soil ［J］ J S Agric， 51（2）： 305-312.? ［王羅濤， 楊冬英， 鄧琳梅， 等， 2020. 三七根際土壤中皂苷類自毒物質(zhì)降解拮抗細菌的分離篩選 ［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報， 51（2）： 305-312.］

WANG WP， WANG ZH， YANG K， et al.， 2020. Biochar application alleviated negative plant-soil feedback by modifying soil microbiome ［J］. Front Microbiol， 11： 799.

XIANG W， 2016. Autotoxicity in Panax notoginseng of root exudates and their allelochemicals ［D］. Nanning： Guangxi University.? ［向維， 2016. 三七根系分泌物的自毒作用及自毒物質(zhì)研究 ［D］. 南寧： 廣西大學(xué).］

XIANG W， WEI XL， TANG H， et al.， 2020. Complete genome sequence and biodegradation characteristics of benzoic acid-degrading bacterium Pseudomonas sp. SCB32 ［J］. Biol Med Res Int， 2020： e6146104.

YANG M， CHUAN YC， GUO CW， et al.， 2018. Panax notoginseng root cell death caused by the autotoxic ginsenoside Rg1 is due to over-accumulation of ROS， as revealed by transcriptomic and cellular approaches ［J］. Front Plant Sci， 9： 264.

YANG M， ZHANG XD， XU YG， et al.， 2015. Autotoxic ginsenosides in the rhizosphere contribute to the replant failure of Panax notoginseng ［J］. PLoS ONE， 10（2）： e0118555.

YOU PJ， 2009. Study on autotoxicants in soil of Panax notoginseng after continuous cropping ［D］. Beijing： Beijing University of Chinese Medicine.? ［游佩進， 2009. 連作三七土壤中自毒物質(zhì)的研究 ［D］. 北京： 北京中醫(yī)藥大學(xué).］

ZHANG QF， L SX， JIANG YX， et al.， 2021. Screening and identification of microorganisms producing β-glucosidase and their application in transformation of ginsenoside Compound-K ［J］. Shandong Agric Sci， 53（11）： 63-69. ［張慶鋒， 呂世鑫， 江雨欣， 等， 2021. 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶微生物的篩選鑒定及其在人參皂苷Compound K轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用 ［J］. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 53（11）： 63-69.］

ZHANG W， LU LY， HU LY， et al.， 2018. Evidence for the involvement of auxin， ethylene and ROS signaling during primary root inhibition of Arabidopsis by the allelochemical benzoic acid ［J］. Plant Cell Physiol， 59（9）： 1889-1904.

ZHANG Y， ZHENG YJ， XIA PG， et al.， 2019. Impact of continuous Panax notoginseng plantation on soil microbial and biochemical properties ［J］. Sci Rep， 9（1）： 13205.

ZHAO J， WANG P， LIU YN， et al.， 2021， Recent advances in biotransformation of ginsenosides ［J］. Chem Ind Eng Prog， 40（3）： 1238-1247.? ［趙婧， 王盼， 劉彥楠， 等， 2021. 人參皂苷的定向生物轉(zhuǎn)化研究進展 ［J］. 化工進展， 40（3）： 1238-1247.］

ZHAO LF， JIAO CX， LI H， et al.， 2018. Chemical transformation of protopanaxadiol type ginsenoside Rb1， Rb2 and Rc analyzed by RRLC-Q-TOF-MS? ［J］. Chem J Chin Univ， 39（4）： 667-673.? ［趙樂鳳， 焦傳新， 李慧， 等， 2018. RRLC-Q-TOF-MS研究人參二醇型皂苷Rb1， Rb2和Rc的化學(xué)轉(zhuǎn)化 ［J］. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報， 39（4）： 667-673.］

ZHOU W， LI JY， LI XW， et al.， 2008. Development and validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative determination of ginsenosides Rb1， Rd， F2， and compound K during the process of biotransformation of ginsenoside Rb1 ［J］. J Sep Sci， 31（6/7）： 921-925.

ZHU XY， SHEN CY， CHEN GW， et al.， 2019. Advancement in research on bacterial chemotaxis in soil? ［J］. Acta Pedol Sin， 56（2）： 259-275.? ［朱曉艷， 沈重陽， 陳國煒， 等， 2019. 土壤細菌趨化性研究進展 ［J］. 土壤學(xué)報， 56（2）： 259-275.］

（責(zé)任編輯 蔣巧媛）