韓霜 徐浩 余靜雅 韓赟 張發(fā)起

摘 要：? 皺邊喉毛花為藏藥藏茵陳基源植物之一，其包含豐富的藥用成分。為進(jìn)一步了解皺邊喉毛花轉(zhuǎn)錄組，豐富其基因注釋、代謝通路等遺傳信息，該研究利用PacBio測(cè)序平臺(tái)對(duì)皺邊喉毛花葉片進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果表明：（1）全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得17 Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，對(duì)795 698 個(gè)環(huán)形一致性序列（CCS）序列進(jìn)行聚類(lèi)和去冗余，最終獲得87 814 條高質(zhì)量的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。（2）與7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，共有277 451 條轉(zhuǎn)錄本注釋成功，其中注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)的轉(zhuǎn)錄本最多，有39 214 條。26 396 條轉(zhuǎn)錄本成功注釋到KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中，共有26 個(gè)子類(lèi)。39 104 條轉(zhuǎn)錄本注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，涉及6 個(gè)主要通路和40 個(gè)子通路。39 102 條轉(zhuǎn)錄本注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中，按分子功能、生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞成分3大類(lèi)對(duì)注釋成功的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分類(lèi)。（3）SSR分析共鑒定到22 861 個(gè)SSR，其中單堿基重復(fù)最為豐富；共檢測(cè)到1 874 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和15 166 個(gè)長(zhǎng)非編碼RNA（LncRNA），而注釋到轉(zhuǎn)錄本最多的轉(zhuǎn)錄因子家族是C3H。（4）篩選出55 條與單萜類(lèi)及黃酮類(lèi)化合物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。該研究結(jié)果豐富了皺邊喉毛花的轉(zhuǎn)錄組信息，為進(jìn)一步篩選皺邊喉毛花藥用成分合成相關(guān)的關(guān)鍵基因提供了重要的遺傳資源。

關(guān)鍵詞： 皺邊喉毛花， 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組， 代謝通路， 轉(zhuǎn)錄因子， 長(zhǎng)非編碼RNA

中圖分類(lèi)號(hào)：? Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2023）07-1335-12

收稿日期：? 2022-11-21

基金項(xiàng)目：? 第二次青藏高原科學(xué)考察研究項(xiàng)目（2019QZKK05020102）； 青海省科技國(guó)際合作專(zhuān)項(xiàng)（2021-HZ-807）。

第一作者： 韓霜（1998- ），碩士研究生，主要從事高山植物多樣性研究，（E-mail）hanshuang@nwipb.cas.cn。

通信作者：? 張發(fā)起，博士，研究員，研究方向?yàn)楦呱街参锒鄻有裕‥-mail）fqzhang@nwipb.cas.cn。

Full-length transcriptome information for Tibetan medicine

“Zangyinchen” of original plant Comastoma polycladum

HAN Shuang1，2， XU Hao1，2， YU Jingya1，2，? HAN Yun1，2， ZHANG Faqi1*

（ 1. Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota， Northwest Institute of Plateau Biology， Chinese Academy of Sciences，

Xining 810001， China; 2. College of Life Sciences， University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100039， China ）

Abstract：? Comastoma polycladum is one of the original plant of Tibetan medicine “Zangyinchen”， which contains abundant medical components. To further know the transcriptome of C. polycladum and enrich its genetic information of gene annotation and metabolic pathway， the Pacbio sequencing platform was used to perform full-length transcriptome sequencing? of C. polycladum leaves. The results were as follows： （1） A total of 17 Gb of sequencing data was collected， and 87 814 high-quality full-length transcripts were obtained by clustering and de-redundancy of 795 698 circular consistency sequences （CCSs） sequences. （2） Comparing with seven databases， 277 451 transcripts were annotated successfully， and in NR database with 39 214 transcripts annotated the most transcripts. A total of? 26 396 transcripts were annotated to the KOG database，? with 26 subcategories， and a total of 39 104 transcripts with six major pathways and 40 secondary pathways to the KEGG database. A total of 39 102 transcripts were annotated to the GO database， which were divided into three major categories： molecular function， biological process and cellular component. （3） SSR analysis yielded 22 861 SSRs， with single-base repeats being the most abundant. A total of? 1 874 transcription factors and 15 166 long non-coding RNAs （LncRNAs） were identified， and the C3H transcription factor family had the most annotated transcripts. （4） A total of? 55 transcripts involved in the synthesis of monoterpenes and flavonoids were screened out. These results enrich the transcriptome information of C. polycladum， and? provide significant genetic resources for further screening of candidate genes related to the synthesis of medicinal components of C. polycladum.

Key words：? Comastoma polycladum， full-length transcriptome， metabolic pathway， transcription factor， LncRNA

藏茵陳是青藏高原藏藥八珍之一，龍膽科植物是藏茵陳入藥源植物中的主要植物，多以川西獐牙菜、濕生扁蕾、橢圓葉花錨和喉毛花屬植物入藥，常用于熱癥、肝膽病及血液病等疾病的治療（唐麗等，2007）。近年來(lái)的研究表明，這些基源植物包含豐富的藥用成分，主要為環(huán)烯醚萜、黃酮類(lèi)化合物，在保肝、抗氧化、抗病毒等方面具有顯著效果（延璽等，2008；董天驕等，2011；楊青松等，2013）。龍膽科（Gentianaceae）喉毛花屬（Comastoma）植物是藏茵陳基源植物之一（鐘國(guó)躍等，2010），對(duì)喉毛花屬植物的研究目前主要集中在細(xì)胞學(xué)、胚胎學(xué)、生態(tài)學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育研究及天然產(chǎn)物學(xué)上（劉建全和何廷農(nóng)，1996；張嬋等，2014；劉小翠等，2016；Zhang et al.，2021；劉真等，2021）。劉真等（2021）在長(zhǎng)梗喉毛花的化學(xué)成分研究中發(fā)現(xiàn)25個(gè)化合物，其抗炎活性較高并對(duì)人體癌細(xì)胞株具有抑制作用。喬涌起等（2012）在長(zhǎng)梗喉毛花植物中分離得到正丁醇化學(xué)成分，為進(jìn)一步深入研究其化學(xué)成分奠定基礎(chǔ)。然而，有關(guān)喉毛花屬植物的基因注釋信息尚未見(jiàn)報(bào)道，限制了對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)代謝通路及功能基因的研究。因此，需要利用測(cè)序技術(shù)豐富喉毛花植物的轉(zhuǎn)錄組遺傳信息。

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的學(xué)者將高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到植物轉(zhuǎn)錄組研究（Wang et al.，2016；Zhu et al.，2017；朱興正等，2018）。二代測(cè)序讀長(zhǎng)的限制導(dǎo)致所拼接得到的轉(zhuǎn)錄本不夠完整，而三代測(cè)序技術(shù)正好彌補(bǔ)了這一缺點(diǎn)，其能夠完成長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序，測(cè)序過(guò)程無(wú)需打斷，嚴(yán)格執(zhí)行RNA樣品提取與檢測(cè)、建庫(kù)及測(cè)序等環(huán)節(jié)的工作，最終得到高質(zhì)量的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本信息（王瑞嫻和李川，2019；張子敬等，2020）。對(duì)沒(méi)有參考基因組的植物而言，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組（full-length transcriptome）測(cè)序?yàn)槠溲芯刻峁┝丝赡?，解決了轉(zhuǎn)錄本拼接較短、信息不完整的難題（趙陸滟等，2019）。因此，三代測(cè)序技術(shù)成為深入挖掘基因組數(shù)據(jù)的有效手段之一（趙陸滟等，2019）。近年來(lái)，有許多學(xué)者研究了青藏高原地區(qū)藥用植物的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組。在這些研究案例中，對(duì)老芒麥（Elymus sibiricus）的轉(zhuǎn)錄組解析成功并挖掘到其落粒相關(guān)候選基因，為篩選低落粒老芒麥新品種提供了參考（張俊超，2020）。丹參（Salvia miltiorrhiza）的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組揭示了丹參酮二萜類(lèi)化合物的生物合成的相關(guān)基因（Xu et al.，2015）。蒙古黃芪（Astragalus membranaceus var. mongholicus）全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組解析了次生代謝產(chǎn)物生物合成的相關(guān)基因（Li et al.，2017）。這些研究案例說(shuō)明全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組對(duì)藥用植物關(guān)鍵基因的挖掘具有顯著優(yōu)勢(shì)，為進(jìn)一步研究藥用植物的功能基因提供了新的思路和參考。

喉毛花屬的皺邊喉毛花（Comastoma polycladum）為青藏高原特有植物（Ho & Liu，2001，2015）。目前對(duì)皺邊喉毛花的研究主要集中在系統(tǒng)發(fā)育研究上。為進(jìn)一步了解喉毛花屬下物種植物體內(nèi)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，應(yīng)對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深入研究，本研究以皺邊喉毛花為對(duì)象，基于PacBio測(cè)序平臺(tái)對(duì)其全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，獲取的數(shù)據(jù)用于功能注釋、可變剪切分析、SSR分析、轉(zhuǎn)錄因子分析及長(zhǎng)非編碼RNA等分析。通過(guò)與公共數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，篩選藥用相關(guān)成分合成相關(guān)的代謝通路和轉(zhuǎn)錄本。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組能夠?yàn)榘欉吅砻ㄋ幱贸煞趾铣上嚓P(guān)的關(guān)鍵基因的篩選提供重要的遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮幼葉采集于海南藏族自治州共和縣（地理坐標(biāo)為100°53′58.44″ E、36°22′19.00″ N，海拔為3 518 m），采集后迅速置于液氮罐中保存，后將其轉(zhuǎn)移至-80 ℃的超低溫冰箱中，用于后續(xù)RNA提取。憑證標(biāo)本（Zhang2018026）存放于中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館（HNWP）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和文庫(kù)構(gòu)建

采用Total RNA Extractor（Trizol）試劑法（Connolly et al.，2006）提取皺邊喉毛花的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA降解程度及污染情況，并評(píng)估其質(zhì)量和完整性。檢測(cè)合格的RNA樣品用于構(gòu)建皺邊喉毛花全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)。具體操作如下：在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以O(shè)ligo DT為引物、目標(biāo)mRNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過(guò)低循環(huán)PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA，利用NEBNext End repair/dA-tailing Module末端修讀及加poly（A）尾，ONT SQKLSK109試劑盒及NEBNext Quick Ligationg Module用于測(cè)序接頭的連接。建好的文庫(kù)采用PromethION（Oxford Nanopore Technologies公司，英國(guó)）測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 測(cè)序完成后對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去除接頭以及低質(zhì)量的reads。采用軟件SMRTlink v8.0（https：//www.pacb.com/support/software-downloads）進(jìn)行過(guò)濾和處理。參數(shù)設(shè)置：-minLength 50（最小長(zhǎng)度為50 bp），-maxLength 15 000（最大長(zhǎng)度為15 000 bp），-minPasses 1（最小的fullpass數(shù)為1）。利用subread.bam文件得到環(huán)形一致性序列（circular consistency sequence，CCS），對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)，搜尋并聚類(lèi)FLNC序列，得到consensus序列。利用Arrow軟件對(duì)得到的consensus序列進(jìn)行校正，獲得高質(zhì)量的全長(zhǎng)優(yōu)化序列（polished consensus）用于后續(xù)分析，最終統(tǒng)計(jì)得到有效數(shù)據(jù)。為提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，利用LoRDEC軟件（Salmela & Rivals，2014）對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行校正，生成校正序列（corrected consensus）。利用CD-HIT 軟件（Fu et al.，2012）對(duì)校正后的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行冗余分析。

1.2.3 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組序列分析 對(duì)去冗余后的序列進(jìn)行基因功能注釋?zhuān)褂玫臄?shù)據(jù)庫(kù)包括非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（Non-Redundant Protein Database，NR， Deng et al.，2006）、蛋白質(zhì)家族域數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Families Database，Pfam， Finn et al.，2014）、蛋白質(zhì)真核同源數(shù)據(jù)庫(kù)（Eukaryotic Orthologous Groups，KOG， Koonin et al.，2004）、蛋白質(zhì)原核同源數(shù)據(jù)庫(kù)（Cluster of Orthologous Groups of Proteins，COG，Tatusov et al.，2003）、東京基因與基金組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，Minoru et al.，2004）、基因本體論數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Ontology，GO，Ashburner et al.，2000）、核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（Nucleotide Sequence Database，NT）和SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)（a manually annotated and reviewed protein sequence database）等，以此獲得更全面的基因功能信息。

1.2.4 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)分析 利用iTAK v 1.7a軟件（參數(shù)設(shè)置：-f 3F）對(duì)皺邊喉毛花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）預(yù)測(cè)（Zheng et al.，2016）。利用MISA（MIcroSAtellite Identification Tool） v 1.0軟件檢測(cè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（simple sequence repeats，SSR），設(shè)置單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸的最少重復(fù)次數(shù)分別為10、 6、 5、 5、 5、 5，其余參數(shù)默認(rèn)（Beier et al.，2017）。利用CNCI v 2（Coding-Non-Coding Index，Sun et al.，2013）、plek v 1.2（Predictor of Long Non-coding RNAs and mRNAs Based on k-mer Scheme，Li et al.，2014）、CPC2 v 0.1（Coding Potential Calculator 2，Kang et al.，2017）軟件以及Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（Finn et al.，2014）對(duì)PacBio測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行編碼潛能預(yù)測(cè)（參數(shù)設(shè)為默認(rèn)），獲得的長(zhǎng)非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）用于后續(xù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及組裝

經(jīng)SMRT （Single-Molecule Real-Time） 測(cè)序共獲得17 Gb的原始數(shù)據(jù)。對(duì)其過(guò)濾后獲得17 315 066 個(gè)subreads?；趕ubread.bam文件獲得795 698 個(gè)CCS序列，N50長(zhǎng)度為2 143 bp，最大長(zhǎng)度為16 860 bp，最小長(zhǎng)度為60 bp，平均長(zhǎng)度為2 337 bp（表1）。經(jīng)分類(lèi)獲得695 698 條FLNC序列，N50長(zhǎng)度為2 055 bp，最大長(zhǎng)度為12 952 bp，最小長(zhǎng)度為52 bp。對(duì)其聚類(lèi)后獲得87 814 條consensus序列，最大長(zhǎng)度為8 269 bp，最小長(zhǎng)度為338 bp，N50長(zhǎng)度為2 219 bp。對(duì)consensus序列進(jìn)行校正后，獲得87 814 條校正序列，N50長(zhǎng)度為2 221 bp。我們對(duì)冗余前后的序列長(zhǎng)度頻數(shù)分布情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)（圖1）。

2.2 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組功能注釋

共有277 451 條轉(zhuǎn)錄本成功注釋到7 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中，其中注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)的轉(zhuǎn)錄本最多，有39 214 條，注釋到KOG數(shù)據(jù)庫(kù)的轉(zhuǎn)錄本最少，有26 396 條（圖2）。26 722、39 102條轉(zhuǎn)錄本分別注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中。39 592 條轉(zhuǎn)錄本注釋到至少一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中，16 273 條轉(zhuǎn)錄本注釋到所有數(shù)據(jù)庫(kù)中。從不同數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇5 個(gè)常用的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行韋恩圖繪制（圖3）。

2.2.1 KOG注釋 與KOG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，共有29 531 條基因被注釋成功。按KOG分類(lèi)可分為26 個(gè)類(lèi)型（圖4）。其中，注釋到只有一般功能預(yù)測(cè)（4 757 條）、翻譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)（3 369 條）和信號(hào)傳遞機(jī)制（2 766 條）的基因最多。然而，細(xì)胞活性（9 條）和未命名蛋白（5 條）注釋到的基因最少。

2.2.2 GO注釋 GO是描述基因功能的一套分類(lèi)系統(tǒng)，可全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性（Blake & Harris， 2008）。共有39 102 條轉(zhuǎn)錄本注釋到了GO數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)注釋結(jié)果對(duì)得到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分類(lèi)（圖5）。注釋到生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能3大類(lèi)，分別有25個(gè)、18個(gè)、11個(gè)子類(lèi)，共54個(gè)子類(lèi)。然而，注釋到細(xì)胞殺死（2 條）和行為（1 條）的基因最少。在細(xì)胞成分中，注釋到細(xì)胞和細(xì)胞部分的基因最多（均為5 252 個(gè)），而突觸（5 條）、突觸部分（5 條）和細(xì)胞連接（4 條）子類(lèi)中涉及的基因最少；在分子功能中，注釋到結(jié)合（16 037 條）和催化活性（12 400 條）的基因最多，而金屬伴活動(dòng)分子功能調(diào)節(jié)器（2 條）子類(lèi)中涉及的基因最少；在生物過(guò)程中，注釋到代謝過(guò)程（12 848 條）和細(xì)胞過(guò)程（11 558 條）的基因最多，而細(xì)胞殺死（2 條）和行為（1 條）子類(lèi)中涉及的基因最少。

2.2.3 KEGG注釋 根據(jù)KO與Pathway的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行KEGG代謝通路分類(lèi)。與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，成功注釋的基因有62 457 條。這些注釋基因被分到6個(gè)主要通路（代謝、遺傳信息處理、細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、組織系統(tǒng)和人類(lèi)疾?。┖?0 個(gè)子通路中（表2）。其中，涉及基因最多的主通路為代謝（128 條），其次為組織系統(tǒng)（77 條）、人類(lèi)疾?。?8 條）和環(huán)境信息處理（36 條），最少為細(xì)胞過(guò)程（25 條）和遺傳信息處理（22 條）。涉及基因最多的子通路為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（3 283 條），其次為碳代謝（2 468 條）和翻譯（2 460 條），最少為信號(hào)分子和互作作用（1 條）。

2.3 藥用相關(guān)的代謝通路

龍膽科植物包含環(huán)烯醚萜、黃酮類(lèi)及三萜類(lèi)化合物等藥效成分（楊青松等，2013）。根據(jù)KEGG轉(zhuǎn)錄本注釋結(jié)果，統(tǒng)計(jì)及分析與藥效成分相關(guān)的次級(jí)代謝通路（表3）。 其中包括單萜類(lèi)生物合成（13 條）、倍半萜類(lèi)和三萜類(lèi)生物合成（27 條）、類(lèi)黃酮生物合成（36 條）、黃酮和黃酮醇生物合成（4 條）。統(tǒng)計(jì)這些代謝通路中可能與環(huán)烯醚萜、黃酮等藥效成分合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。

2.4 SSR分析

對(duì)皺邊喉毛花的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行SSR分析后，共檢測(cè)到22 861 個(gè)SSR信息位點(diǎn)。共獲得6種SSR重復(fù)類(lèi)型，其中單堿基重復(fù)類(lèi)型（Mono-nucleotide，Mono-，13 750 個(gè)）最豐富，其次為三堿基重復(fù)類(lèi)型（Tri-nucleotide，Tri-，5 811 個(gè)）、二堿基重復(fù)類(lèi)型（Di-nucleotide，Di-，2 807 個(gè)）、四堿基重復(fù)類(lèi)型（Tetra-nucleotide，Tetra-，573 個(gè)）和六堿基重復(fù)類(lèi)型（Hexa-nucleotide，Hexa-，199 個(gè)），而五堿基重復(fù)類(lèi)型（Penta-nucleotide，Penta-，178個(gè)）最少。統(tǒng)計(jì)6個(gè)重復(fù)類(lèi)型中不同長(zhǎng)度范圍重復(fù)序列的分布情況，結(jié)果顯示9～12 bp長(zhǎng)度的重復(fù)序列最豐富，其次是5～8 bp、13～16 bp、17～20 bp長(zhǎng)度的重復(fù)序列，而21～24 bp長(zhǎng)度的重復(fù)序列最少（圖6）。

2.5 轉(zhuǎn)錄因子分析

轉(zhuǎn)錄因子是一些表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，能與基因順式作用元件專(zhuān)一性結(jié)合，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控（劉強(qiáng)等，2000）。本研究預(yù)測(cè)結(jié)果顯示共獲得1 874個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（圖7）。其中注釋到轉(zhuǎn)錄本最多的轉(zhuǎn)錄因子家族是C3H（120 個(gè)），其次為bZIP（Basic Leucine Zipper，112 個(gè)）、bHLH（Basic/Helix-Loop-Helix，110 個(gè)）和MYB-related（109 個(gè)），而TUB（31 個(gè)）、C2C2-GATA（30 個(gè)）轉(zhuǎn)錄因子家族數(shù)量最少。

2.6 長(zhǎng)非編碼RNA分析

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）不編碼蛋白質(zhì)，利用CNCI、CPC2、plek和Pfam方法對(duì)其進(jìn)行編碼潛能預(yù)測(cè)。共檢測(cè)到15 166 個(gè)LncRNA，其中CNCI、CPC2、plek和Pfam分別檢測(cè)到2 276個(gè)、5 295個(gè)、6 655個(gè)、10 480個(gè)LncRNA，4種軟件檢測(cè)到的共有

LncRNA有1 110 個(gè)。統(tǒng)計(jì)4種方法預(yù)測(cè)的LncRNA數(shù)目繪制韋恩圖（圖8）。

3 討論與結(jié)論

皺邊喉毛花是藏茵陳基源植物之一，植物體內(nèi)含有大量的藥用成分，但對(duì)其轉(zhuǎn)錄組的認(rèn)識(shí)較淺， 基因功能相關(guān)研究的報(bào)道較少。為進(jìn)一步了解皺邊喉毛花藥用價(jià)值，我們開(kāi)展次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因功能研究。利用PacBio測(cè)序平臺(tái)解析全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，獲取更完整的轉(zhuǎn)錄本信息。通過(guò)測(cè)序共獲得17 315 066 條Subreads，平均長(zhǎng)度為1 620 bp，N50長(zhǎng)度為1 505 bp，說(shuō)明全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序讀長(zhǎng)較長(zhǎng)且連續(xù)性較高。為獲得更準(zhǔn)確且可靠的數(shù)據(jù)，對(duì)Subread進(jìn)行聚類(lèi)及校正后，得到87 814 條高質(zhì)量的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。N50長(zhǎng)度大于1 000 bp（2 221 bp）說(shuō)明其組裝完整性較好，能夠滿足后續(xù)轉(zhuǎn)錄組信息分析的要求。

通過(guò)與7個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，我們獲得了大量有用的轉(zhuǎn)錄本注釋信息，共有277 451 條轉(zhuǎn)錄本成功注釋到這些數(shù)據(jù)庫(kù)中，其中注釋到NR、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量最多。NR數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果顯示與皺邊喉毛花比對(duì)率排名前十的物種為咖啡（Coffea canephora）、芝麻（Sesamum indicum）、牽牛（Ipomoea nil）等，表明皺邊喉毛花與這些植物具有較高同源性。然而，能與皺邊喉毛花比對(duì)上的同科植物較少，這反映出公共數(shù)據(jù)庫(kù)中龍膽科植物的基因組信息十分匱乏。

藏茵陳基源植物包含豐富的環(huán)烯醚萜、黃酮及三萜類(lèi)等藥用成分（楊青松等，2013），本研究從對(duì)皺邊喉毛花全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組的分析中檢測(cè)到與其藥用合成相關(guān)的55條轉(zhuǎn)錄本，包括生物堿、萜類(lèi)、苯丙素類(lèi)、黃酮類(lèi)、糖苷類(lèi)、醌類(lèi)、聚酮類(lèi)、有機(jī)酸及酚類(lèi)等。黃酮作為具有多種生物活性的多酚類(lèi)化合物，廣泛存在于植物體內(nèi)，在人體疾病治療中起到顯著效果（Hostetler et al.，2017）。萜類(lèi)化合物在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育中發(fā)揮重要作用，常應(yīng)用于食品、制藥和化學(xué)工業(yè)中（Tholl，2015）。本研究分析得到多個(gè)黃酮類(lèi)與萜類(lèi)化合物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本，有助于挖掘黃酮類(lèi)及萜類(lèi)化合物合成相關(guān)的關(guān)鍵基因，這為我們今后開(kāi)展皺邊喉毛花關(guān)鍵基因克隆研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

SSR位點(diǎn)廣泛分布于真核生物基因組（張楠等，2013）。本研究SSR分析結(jié)果顯示，單堿基重復(fù)類(lèi)型最為豐富，類(lèi)似情況在其他藥用植物中也有體現(xiàn)，如山莨菪（Anisodus tanguticus）、鳳丹（Paeonia suffruticosa）、羅布麻（Apocynum venetum）等（謝冬梅等，2017；張雨等，2020；趙雪艷等，2020）。除去對(duì)單堿基重復(fù)的統(tǒng)計(jì)，皺邊喉毛花植物中三堿基重復(fù)類(lèi)型最為豐富，這與藥用植物甘葛藤（Pueraria thomsonii）和全萼秦艽（Gentiana lhassica）結(jié)果一致，而在紅花這個(gè)物種中二堿基重復(fù)最為豐富，這種差異可能與SSR位點(diǎn)進(jìn)化速率不同、設(shè)定的檢索參數(shù)以及樣品來(lái)源有關(guān)（Chen et al.，2018；李延龍等，2020；梅瑜等，2021）。轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)能夠特異結(jié)合DNA且調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)（劉強(qiáng)等，2000）。本研究鑒定出的1 874個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中，C3H、bZIP、bHLH及MYB-related轉(zhuǎn)錄因子家族在皺邊喉毛花中數(shù)量較多，豐富了喉毛花屬的轉(zhuǎn)錄因子信息。MYB-related作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝及逆境脅迫等生物學(xué)過(guò)程（陳清等，2009）。在關(guān)于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的研究中，前人已證實(shí)該基因家族能夠提高植物的耐寒能力，促進(jìn)果實(shí)著色，并在鹽脅迫調(diào)控中發(fā)揮重要作用（Allan et al.，2008；Dubos et al.，2010；Jaakola，2013；陳娜等，2015）。bZIP 轉(zhuǎn)錄因子作為真核生物轉(zhuǎn)錄因子中分布最廣、最保守的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物和非生物脅迫應(yīng)答（楊穎等，2009）。已有研究證實(shí)bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族能夠增強(qiáng)擬南芥抗旱能力，并參與其低溫、高鹽等脅迫的應(yīng)答反應(yīng)（Choi et al.，2000；Kang et al.，2002）。bHLH作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞活性中發(fā)揮著重要作用，并參與植物中次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控，如類(lèi)黃酮、花青素等次級(jí)代謝物（Gonzalez et al.，2008；張全琪等，2011；Zhao et al.，2013）。MYB-related和bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族與植物的非生物脅迫相關(guān)，皺邊喉毛花主要分布在青藏高原地區(qū)，該地區(qū)氣溫低，晝夜溫差大，這些轉(zhuǎn)錄因子家族是否參與皺邊喉毛花的響應(yīng)脅迫應(yīng)答反應(yīng)，還需進(jìn)一步研究。LncRNAs是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200 nt、能夠調(diào)控基因的表達(dá)、參與多個(gè)生物學(xué)過(guò)程和通路的長(zhǎng)非編碼RNA（Wan et al.，2019）。本研究共預(yù)測(cè)到15 166個(gè)LncRNAs，豐富了喉毛花屬植物的長(zhǎng)非編碼RNA信息，為后續(xù)進(jìn)一步探索LncRNA在喉毛花屬植物中的具體生物功能及作用機(jī)制提供了數(shù)據(jù)支持。

本研究利用PacBio測(cè)序平臺(tái)對(duì)皺邊喉毛花進(jìn)行了測(cè)序及拼接。獲得的大量測(cè)序數(shù)據(jù)用于功能注釋、可變剪切分析、SSR分析、轉(zhuǎn)錄因子分析及長(zhǎng)非編碼RNA預(yù)測(cè)等。通過(guò)與KEGG的比對(duì)，篩選出藥用相關(guān)成分合成相關(guān)的代謝通路和轉(zhuǎn)錄本，為皺邊喉毛花藥用成分合成相關(guān)的關(guān)鍵基因的篩選提供重要的遺傳資源。

參考文獻(xiàn)：

ALLAN AC， HELLENSE RP， LAING WA， 2008. MYB transcription factors that colour our fruit ［J］. Trends Plant Sci， 13（3）： 99-102.

ASHBURNER M， BALL CA， BLAKE JA， et al.， 2000. Gene Ontology： tool for the unification of biology ［J］. Nat Genet， 25（1）： 25-29.

BEIER S， THIEL T， MNCH T， et al.， 2017. MISA-web： a web server for microsatellite prediction ［J］. Bioinformatics， 33（16）： 2583-2585.

BLAKE JA， HARRIS MA， 2008. The Gene Ontology （GO） project： structured vocabularies for molecular biology and their application to genome and expression analysis ［J］. Curr Protoc Bioinf， 23（1）： 721-729.

CHEN J， TANG XH， REN CX， et al.， 2018. Full-length transcriptome sequences and the identification of putative genes for flavonoid biosynthesis in safflower ［J］. BMC Genomics， 19（1）： 548.

CHEN N， CHI XY， PAN LJ， et al.， 2015. Advances in MYB transcription factors during salt-stress regulation in plants ［J］. Plant Physiol J， 51（9）： 1395-1399.? ［陳娜，? 遲曉元，? 潘麗娟，? 等，? 2015. MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物鹽脅迫調(diào)控中的研究進(jìn)展 ［J］. 植物生理學(xué)報(bào)，? 51（9）：? 1395-1399.］

CHEN Q， TANG HR， DONG XL， et al.， 2009. Progress in the study of plant MYB transcription factors ［J］. Genomics Appl Biol， 28（2）： 365-372.? ［陳清，? 湯浩茹，? 董曉莉，? 等，?? 2009. 植物Myb轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展 ［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，? 28（2）：? 365-372.］

CHOI H， HONG J， HA J， et al.， 2000. ABFs a family of ABA-responsive element binding factors ［J］. J Biol Chem， 275（3）： 1723-1730.

CONNOLLY MA， CLAUSEN PA， LAZAR JG， 2006. Preparation of RNA from plant tissue using trizol ［J］. Cold Spring Harb Protoc， 2006（1）： pdb.prot4105. DOI： 10.1101/pdb.prot4105.

DENG YY， LI JQ， WU SF， et al.， 2006. Integrated NR database in protein annotation system and its localization ［J］. Comp Eng， 32（5）： 71-74.

DONG TJ， CUI YL， TIAN JS， et al.， 2011. Advances of studies on natural iridoids ［J］. Chin Trad Herb Drugs， 42（1）： 185-194.? ［董天驕，? 崔元璐，? 田俊生，? 等，? 2011. 天然環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物研究進(jìn)展 ［J］. 中草藥，? 42（1）：? 185-194.］

DUBOS C， STRACKE R， GROTEWOLD E， et al.， 2010. MYB transcription factors in Arabidopsis ［J］. Trends Plant Sci， 15（10）： 573-581.

FINN RD， BATEMAN A， CLEMENTS J， et al.， 2014. Pfam： the protein families database ［J］. Nucl Acid Res， 42（D1）： D222-D230.

FU LM， NIU BF， ZHU ZW， et al.， 2012. CD-Hit： Accelerated for clustering the next-generation sequencing data ［J］. Bioinformatics， 28（23）： 3150-3152.

GONZALEZ A， ZHAO MZ， LEAVITT JM， et al.， 2008. Regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway by the TTG1/bHLH/MYB transcriptional complex in Arabidopsis seedlings ［J］. Plant J， 53（5）： 814-827.

HO TN， LIU SW， 2001. A worldwide monograph of Gentiana ［M］. Beijing： Science Press.

HO TN， LIU SW， 2015. A worldwide monograph of Swertia and its allies ［M］. Beijing： Science Press.

HOSTETLER GL， RALSTON RA， SCHWARTZ SJ， 2017. Flavones： food sources， bioavailability， metabolism， and bioactivity ［J］. Adv Nutr， 8（3）： 423-435.

JAAKOLA L， 2013. New insights into the regulation of anthocyanin biosynthesis in fruit ［J］. Trends Plant Sci， 18（9）： 477-483.

KANG JY， CHOI HI， IM MY， et al.， 2002. Arabidopsis basic leucine zipper proteins that mediate stress-responsive abscisic acid signaling ［J］. Plant Cell， 14（2）： 343-357.

KANG YJ， YANG DC， KONG L， et al.， 2017. CPC2： A fast and accurate coding potential calculator based on sequence intrinsic features ［J］. Nucl Acid Res， 45（W1）： W12-W16.

KOONIN EV， FEDOROVA ND， JACKSON JD， et al.， 2004. A comprehensive evolutionary classification of proteins encoded in complete eukaryotic genomes ［J］. Genome Biol， 5（2）： R7.

LI AM， ZHANG JY， ZHOU ZY， 2014. PLEK： a tool for predicting long non-coding RNAs and messenger RNAs based on an improved k-mer scheme ［J］. BMC Bioinf， 15： 311.

LI J， HARATA-LEE Y， DENTON MD， et al.， 2017. Long read reference genome-free reconstruction of a full-length transcriptome from Astragalus membranaceus reveals transcript variants involved in bioactive compound biosynthesis ［J］. Cell Discov， 3： 17031.

LI YL， ZHANG HM， CUI YG， et al.， 2020. Analysis on SSR information in full-length transcriptome and development of molecular markers in Allium tuberosum ［J］. Acta Hortic Sin， 47（4）： 759-768.? ［李延龍，? 張華敏，? 崔蘊(yùn)剛，? 等，? 2020. 韭菜全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組SSR信息分析及分子標(biāo)記開(kāi)發(fā) ［J］. 園藝學(xué)報(bào)，? 47（4）：? 759-768.］

LIU JQ， HE TN， 1996. The embryological studies of Comastoma pulmonarium （Gentianaceae） ［J］. Acta Phytotaxon Sin， 34（6）： 577-585.? ［劉建全，? 何廷農(nóng)，? 1996. 喉毛花的胚胎學(xué)研究 ［J］. 植物分類(lèi)學(xué)報(bào)， 34（6）： 577-585.］

LIU Q， ZHANG GY， CHEN SY， 2000. The structure and regulatory role of plant transcription factors ［J］. Chin Sci Bull， 45（14）： 1465-1474. ［劉強(qiáng)，張貴友，陳受宜，2000. 植物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與調(diào)控作用 ［J］.? 科學(xué)通報(bào)， 45（14）： 1465-1474.］

LIU Z， QI YY， WU HY， et al.， 2021. Chemical constituents of Tibetan medicine Comastoma pedunculatum whole herb ［J］. J Chin Med Mat， 44（6）： 1397-1404.? ［劉真，? 祁艷艷，? 吳海燕，? 等，? 2021. 藏藥長(zhǎng)梗喉毛花的活性成分研究 ［J］. 中藥材，? 44（6）：? 1397-1404.］

LIU XC， ZHAO Y， ZENG QY， et al.， 2016. Determination of five effective components in Comastoma pulmonarium by HPLC ［J］. Chin J Trad Chin Med Pharm， 31（9）： 3760-3762.? ［劉小翠，? 趙英，? 曾擎屹，? 等， 2016. HPLC法測(cè)定喉毛花植物中5種有效成分的含量 ［J］. 中華中醫(yī)藥雜志，? 31（9）：? 3760-3762.］

MEI Y， LI XR， CAI SK， et al.， 2021. Full-length transcriptome analysis of a homology of medicine and food of Pueraria thomsonii ［J］. Acta Agric Boreal-Sin， 36（5）： 10-17.?? ［梅瑜，? 李向榮，? 蔡時(shí)可，? 等，? 2021. 藥食同源植物甘葛藤的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組分析 ［J］. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，? 36（5）：? 10-17.］

MINORU K， SUSUMU G， SHUICHI K， et al.， 2004. The KEGG resource for deciphering the genome ［J］. Nucl Acid Res， 32（Database issue）： D277-D280.

QIAO YQ， CUI BS， TANG L， et al.， 2012. Chemical constituents of n-BuOH extract of Comastoma pedunculatum ［J］. Chin J Chin Mat Med， 37（16）： 2360-2365.? ［喬涌起，? 崔保松，? 唐麗，? 等，? 2012. 長(zhǎng)梗喉毛花正丁醇部位化學(xué)成分研究 ［J］. 中國(guó)中藥雜志，? 37（16）：? 2360-2365.］

SALMELA L， RIVALS E， 2014. LoRDEC： Accurate and efficient long read error correction ［J］. Bioinformatics， 30（24）： 3506-3514.

SUN L， LUO HT， BU DC， et al.， 2013. Utilizing sequence intrinsic composition to classify protein-coding and long non-coding transcripts ［J］. Nucl Acid Res， 41（17）： e166.

TANG L， JIN ZN， MEN MJ， et al.， 2007. Recent progress and utilization of tibetan medicine Zangyinchen ［J］. J CUN （Nat Sci Ed）， 2（16）： 176-178.? ［唐麗，? 金振南，? 門(mén)美佳，? 等，? 2007. 藏藥藏茵陳的研究進(jìn)展及開(kāi)發(fā)利用 ［J］. 中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），? 2（16）：? 176-178.］

TATUSOV RL， FEDOROVA ND， JACKSON JD， et al.， 2003. The COG database： an updated version includes eukaryotes ［J］. BMC Bioinf， 4： 41.

THOLL D， 2015. Biosynthesis and biological functions of terpenoids in plants ［J］. Adv Biochem Eng Biotechnol， 148： 63-106.

WAN HF， JIA XW， ZOU PF， et al.， 2019. The single-molecule long-read sequencing of Scylla paramamosain ［J］. Sci Rep， 9（1）： 1-11.

WANG B， TSENG E， REGULSKI M， et al.， 2016. Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing ［J］. Nat Commun， 7： 11708.

WANG RX， LI C， 2019. Application of full-length transcriptome sequencing in non-model plant transcriptome research ［J］. Mol Plant Breed， 17（2）： 502-508.? ［王瑞嫻，? 李川，? 2019. 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在非模式植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中的應(yīng)用 ［J］. 分子植物育種，? 17（2）：? 502-508.］

XIE DM， YU NJ， HUANG LQ， et al.， 2017. Next generation sequencing and transcriptome analysis of root bark from Paeonia suffruticosa cv. Feng Dan ［J］. Chin J Chin Mat Med， 42（15）： 2954-2961.? ［謝冬梅，? 俞年軍，? 黃璐琦，? 等，? 2017. 基于高通量測(cè)序的藥用植物“鳳丹”根皮的轉(zhuǎn)錄組分析 ［J］. 中國(guó)中藥雜志，? 42（15）：? 2954-2961.］

XU JH， ZENG Q， YE FY， et al.， 2021. Genetic relationship of Populus qiongdaoensis in Populus based on full-length transcriptome sequences， nuclear genes and chloroplast genes ［J］. J Beijing For Univ， 43（10）： 28-37.? ［徐家洪，? 曾晴，? 葉富余，? 等，? 2021. 基于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組序列、核基因與葉綠體基因分析瓊島楊在楊屬的親緣關(guān)系 ［J］. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，? 43（10）：? 28-37.］

XU ZC， PETERS RJ， WEIRATHER J， et al.， 2015. Full-length transcriptome sequences and splice variants obtained by a combination of sequencing platforms applied to different root tissues of Salvia miltiorrhiza and tanshinone biosynthesis ［J］. Plant J， 82（6）： 951-961.

YAN X， LIU HQ， ZOU YQ， et al.， 2008. Physiological activity and research advance in synthesis of flavonoids ［J］. Chin J Org Chem， 28（9）： 1534-1544.? ［延璽，? 劉會(huì)青，? 鄒永青，? 等，? 2008. 黃酮類(lèi)化合物生理活性及合成研究進(jìn)展 ［J］. 有機(jī)化學(xué)，? 28（9）：? 1534-1544.］

YANG QS， ZHAO Y， ZHANG HH， et al.， 2013. Geographic distribution and utilization of the gentianaceae endemic Zangyinchen medicinal plant in northwest Yunnan ［J］. J Yunnan Minzu Univ （Nat Sci Ed）， 22（3）： 176-181.? ［楊青松，? 趙艷，? 張海浩，? 等，? 2013. 龍膽科藏茵陳類(lèi)民族藥原植物在滇西北的地理分布與資源利用 ［J］. 云南民族大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版），? 22（3）：? 176-181.］

YANG Y， GAO SQ， TANG YM， et al.， 2009. Advance of bZIP transcription factors in plants ［J］. J Trit Crop， 29（4）： 730-737.? ［楊穎，? 高世慶，? 唐益苗，? 等，? 2009. 植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展 ［J］. 麥類(lèi)作物學(xué)報(bào)，? 29（4）：? 730-737.］

YU JY， XIA MZ， XU H， et al.， 2022. Comparative transcriptome analysis of three Artemisia species in Qinghai Tibet Plateau ［J］. Bull Bot Res， 42（2）： 200-210.? ［余靜雅，? 夏銘澤，? 徐浩，? 等，? 2022. 青藏高原地區(qū)3種蒿屬植物轉(zhuǎn)錄組比較分析 ［J］. 植物研究，? 42（2）：? 200-210.］

ZHAO L， GAO LP， WANG HX， et al.， 2013. The R2R3-MYB， bHLH， WD40， and related transcription factors in flavonoid biosynthesis ［J］. Funct Integr Genomics， 13（1）： 75-98.

ZHAO LY， CAO SY， LONG YS， et al.， 2019. Applications and research progresses of full-length transcriptome sequencing in plants ［J］. J Plant Genet Resour， 20（6）： 1390-1398.? ［趙陸滟，? 曹紹玉，? 龍?jiān)茦?shù)，? 等，? 2019. 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在植物中的應(yīng)用研究進(jìn)展 ［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，? 20（6）：? 1390-1398.］

ZHAO XY， WANG Q， YANG S， et al.， 2020. The transcriptome sequencing and analysis of the medicinal plant Apocynum venetum ［J］. Mol Plant Breed， 18（8）： 2503-2511.? ［趙雪艷，? 王琪，? 楊莎，? 等，? 2020. 藥用植物羅布麻的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析 ［J］. 分子植物育種，? 18（8）：? 2503-2511.］

ZHANG C， HU LJ， WANG Y， 2014. Reproductive allocation of three sympatric Comastoma （Gentianaceae） species ［J］. Guihaia， 34（1）： 38-45.? ［張嬋，? 胡莉娟，? 王赟，? 2014. 三種同域分布喉毛花的繁殖分配 ［J］. 廣西植物，? 34（1）：? 38-45.］

ZHANG JC， 2020. Identification and functional analysis of candidate genes foe seed shattering in Elymus sibiricus based on transcriptome sequencing ［D］. Lanzhou： Lanzhou University： 1-2.? ［張俊超，? 2020. 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序挖掘老芒麥落粒候選基因及其功能分析 ［D］. 蘭州： 蘭州大學(xué)： 1-2.］

ZHANG N， SUN GL， DAI JG， et al.， 2013. Sequencing and analysis of the transcriptome of Ginkgo biloba L. cells ［J］. Chin Biotechnol， 33（5）： 112-119.? ［張楠，? 孫桂玲，? 戴均貴，? 等，? 2013. 銀杏細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序及分析 ［J］. 中國(guó)生物工程雜志，? 33（5）：? 112-119.］

ZHANG QQ， ZHU JH， NI YM， et al.， 2011. The structure and function of plant bHLH transcription factors ［J］. J Trop Subtrop Bot， 19（1）： 84-90.? ［張全琪，? 朱家紅，? 倪燕妹， ?等，? 2011. 植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其生物學(xué)功能 ［J］. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，? 19（1）：? 84-90.］

ZHANG Y， XIA MZ， ZHANG FQ， 2020. Transcriptome analysis for medicinal plant Anisodus tanguticus ［J］. Bull Bot Res， 40（3）： 458-467.? ［張雨，? 夏銘澤，? 張發(fā)起，? 2020. 藥用資源植物山莨菪的轉(zhuǎn)錄組信息分析 ［J］. 植物研究，? 40（3）：? 458-467.］

ZHANG Y， YU JY， XIA MZ， et al.， 2021. Plastome sequencing reveals phylogenetic relationships among Comastoma and related taxa （Gentianaceae） from the Qinghai-Tibetan Plateau ［J］. Ecol Evol， 11（22）： 16034-16046.

ZHANG ZJ， LIU YR， ZHANG SJ， et al.， 2020. The principle of the third generation sequencing technology and its application in biological field ［J］. Chin J Anim Sci， 56（6）： 11-15.? ［張子敬，? 劉燕蓉，? 張順進(jìn)，? 等，? 2020. 第三代測(cè)序技術(shù)的方法原理及其在生物領(lǐng)域的應(yīng)用 ［J］. 中國(guó)畜牧雜志，? 56（6）：? 11-15.］

ZHENG Y， JIAO C， SUN HH， et al.， 2016. ITAK： A program for genome-wide prediction and classification of plant transcription factors， transcriptional regulators， and protein kinases ［J］. Mol Plant， 9（12）： 1667-1670.

ZHONG GY， WANG CH， LIU X， et al.， 2010. The resources and usage status of the commonly used Tibetan medicinal crop“Dida” ［J］. World Sci Technol-Mod Trad Chin， 12（1）： 122-128.? ［鐘國(guó)躍，? 王昌華，? 劉翔，? 等，? 2010. 常用藏藥“蒂達(dá)（藏茵陳）”的資源與使用現(xiàn)狀調(diào)查 ［J］. 世界科學(xué)技術(shù)：? 中醫(yī)藥現(xiàn)代化，? 12（1）：? 122-128.］

ZHU FY， CHEN MX， YE NH， et al.， 2017. Proteogenomic analysis reveals alternative splicing and translation as part of the abscisic acid response in Arabidopsis seedlings ［J］. Plant J， 91（3）： 518-533.

ZHU XZ， XIA LF， CHEN LB， et al.， 2018. Full-length transcriptome analysis of protected cultivation ‘Yuncha 1 （Camellia sinensis var. assamica） ［J］. J Tea Sci， 38（2）： 193-201.? ［朱興正，? 夏麗飛，? 陳林波，? 等，? 2018. 保護(hù)品種云茶1 號(hào)茶樹(shù)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析 ［J］. 茶葉科學(xué)，? 38（2）： 193-201.］

（責(zé)任編輯 鄧斯麗）