吳會(huì)會(huì) 劉瑞成 江道菊 謝苗苗 鄒英寧

摘 要：? 為揭示叢枝菌根真菌（AMF）和根瘤菌在白三葉氮（N）同化中的作用，該研究對(duì)白三葉進(jìn)行單一或聯(lián)合接種隱類球囊霉（Paraglomus occultum）和三葉草根瘤菌（Rhizobium trifolii），分析其對(duì)白三葉的生長(zhǎng)、光合作用、葉片N和氨基酸含量以及N同化相關(guān)酶活性的影響。結(jié)果表明：（1）單一接種AMF或根瘤菌以及聯(lián)合接種AMF和根瘤菌均顯著增加了白三葉的株高、匍匐莖長(zhǎng)度、葉片數(shù)、地上部生物量、總生物量、葉綠素b和總?cè)~綠素含量、穩(wěn)態(tài)光量子效率和葉片N含量，這種增強(qiáng)效應(yīng)是聯(lián)合接種>單一AMF>單一根瘤菌>未接種處理。（2）聯(lián)合接種AMF和根瘤菌顯著增加了白三葉葉片中丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和組氨酸的含量，顯著提升了葉片N同化相關(guān)酶如硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸脫氫酶、天冬酰胺合成酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活性，顯著促進(jìn)AMF對(duì)白三葉根系的侵染。綜上認(rèn)為，聯(lián)合接種AMF和根瘤菌通過(guò)激活N同化相關(guān)酶活性有效促進(jìn)N同化，產(chǎn)生更多氨基酸，進(jìn)一步促進(jìn)白三葉植株生長(zhǎng)；聯(lián)合接種AMF和根瘤菌具有協(xié)同作用，有效促進(jìn)了白三葉的N同化。

關(guān)鍵詞： 叢枝菌根真菌， 根瘤菌， 白三葉， 氮（N）同化， 氨基酸

中圖分類號(hào)：? Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2023）07-1213-09

收稿日期：? 2023-04-11

基金項(xiàng)目：? 湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新行動(dòng)項(xiàng)目（鄂農(nóng)發(fā)〔2018〕1號(hào)）。

第一作者： 吳會(huì)會(huì)（1984-），博士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事植物菌根生理研究，（E-mail）360148224@qq.com。

通信作者：? 鄒英寧，教授，主要從事植物菌根生物技術(shù)研究，（E-mail）zouyingning@163.com。

Effects of arbuscular mycorrhizal fungi and rhizobia

on nitrogen assimilation of white clover

WU Huihui1， LIU Ruicheng1， JIANG Daoju2， XIE Miaomiao1， ZOU Yingning1*

（ 1. College of Horticulture and Gardening， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China; 2. Shashi Substation，

Jingzhou Municipal Bureau of Natural Resources and Planning， Jingzhou 434000， Hubei ， China ）

Abstract：? Symbiotic microorganisms such as arbuscular mycorrhizal fungi （AMF） and rhizobia （Rh） both promote host plant N acquisition， but whether and how the combination affects host plant nitrogen （N） assimilation remains unclear. To clarify the role of AMF and rhizobia on N assimilation in white clover （Trifolium repens）， the effect of single or combined inoculation with an arbuscular mycorrhizal fungus Paraglomus occultum and a rhizobium Rhizobium trifolii on plant growth， photosynthesis， leaf N and amino acid contents， and the activities of N assimilation-related enzymes were analyzed in white clover? under potted conditions. The results obtained were as follows： （1） The plant height， stolon length， leaf number， shoot biomass， total biomass， chlorophyll b and total chlorophyll contents， steady-state light quantum efficiency， and leaf N contents of white clover were significantly increased by single inoculation with Paraglomus occultum， single Rhizobium trifolii， and combined inoculations of Paraglomus occultum and Rhizobium trifolii， along with the order of combined inoculations of Paraglomus occultum and Rhizobium trifolii > single Paraglomus occultum > single Rhizobium trifolii > non-inoculation control. （2） Combined inoculations of Paraglomus occultum and Rhizobium trifolii significantly increased the contents of various amino acids including alanine， arginine， asparagine， aspartate， glutamine， glutamic acid and histidine in leaves of white clover， and distinctly improved the activities of nitroreductase， nitrite reductase， glutamine synthetase， glutamate synthetase， glutamate dehydrogenase， asparagine synthetase， and aspartate aminotransferase. In addition， the introduction of Rhizobium trifolii significantly promoted the colonization of Paraglomus occultum to roots of white clover， suggesting the partnership between the two. Therefore， it is concluded that combined inoculations of AMF and rhizobia promote N assimilation， generate more amino acids， and further promote the growth of white clover by activating the activities of N assimilation-related enzymes. It is further demonstrated that AMF and rhizobia have synergistic effects on promoting N assimilation of white clover.

Key words： arbuscular mycorrhizal fungi （AMF）， rhizobia， white clover， nitrogen （N） assimilation， amino acids

叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是土壤中廣泛存在的有益真菌，與植物共生后在根系表面形成根外菌絲，促進(jìn)植物對(duì)氮（N）、磷（P）等元素的吸收。AMF幫助宿主植物吸收土壤中不同形態(tài)的N素，銨態(tài)氮（NH4+）是AMF根外菌絲主要的吸收形式（Xie et al.， 2022）。AMF增加宿主植物游離氨基酸等氮源的積累，其菌絲對(duì)植物N的貢獻(xiàn)率達(dá)74%（張良和楊春雪，2018）。因此，AMF對(duì)宿主植物N的吸收至關(guān)重要。根瘤菌（rhizobia）是土壤中常見(jiàn)的革蘭氏陰性細(xì)菌，在豆科作物根毛中定殖形成根瘤，從而建立共生體系，進(jìn)行生物固氮，幫助植物獲取N（Masson-Boivin & Sachs， 2018）。Ren等（2019）研究表明，與單一接種相比，聯(lián)合接種AMF和根瘤菌更能促進(jìn)豆科作物生物固氮，提高N的水平，同時(shí)提高土壤鈾清除率，呈現(xiàn)出更高的植物修復(fù)效率。而AMF和根瘤菌聯(lián)合接種則抑制了豌豆和綠豆對(duì)N的吸收（Saxena et al.， 1997; Blilou et al.， 1999）。上述研究結(jié)果表明AMF和根瘤菌聯(lián)合接種對(duì)宿主N的吸收是非常復(fù)雜的，尚需要進(jìn)一步研究，特別是兩者結(jié)合能否促進(jìn)豆科作物如白三葉（Trifolium repens）的N同化，目前還不清楚。

植株從土壤中獲取的主要是硝態(tài)氮（NO3-）和銨態(tài)氮（NH4+）等無(wú)機(jī)氮，只有將這些無(wú)機(jī)氮同化成如氨基酸、蛋白質(zhì)等有機(jī)氮后才能為植物所利用，而同化過(guò)程需要多種酶的參與。植物吸收的NO3-在硝酸還原酶（NR）作用下首先被還原成亞硝態(tài)氮（NO2-），之后在亞硝酸還原酶（NiR）作用下轉(zhuǎn)化為NH4+（Serralta et al.， 2020）。NH4+在谷氨酰胺合成酶（GS）和ATP的共同作用下，生成谷氨酰胺（Gln），再通過(guò)谷氨酸合成酶（GOGAT）催化成谷氨酸（Glu）。通過(guò)GS/GOGAT途徑同化生成有機(jī)氮，此途徑同化植株內(nèi)NH4+量達(dá)95%（Hirel & Gadal， 1980）。谷氨酸脫氫酶（GDH）是GS/GOGAT途徑的補(bǔ)充途徑，只有當(dāng)植株中NH4+濃度過(guò)高時(shí)GDH才進(jìn)行作用，催化合成Glu（Hodges， 2002）。而天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）是將GS/GOGAT途徑形成的Glu轉(zhuǎn)化成天冬氨酸（Asp）和丙氨酸（Ala）。天冬酰胺（Asn）是植株韌皮部運(yùn)輸?shù)闹饕袡C(jī)N形式之一，其合成受天冬酰胺合成酶（AS）的影響（薛迎斌，2018）。目前，還不清楚AMF和根瘤菌聯(lián)合接種對(duì)宿主N同化產(chǎn)物水平的影響。

白三葉為多年生豆科牧草，對(duì)根瘤菌和AMF有良好親和性，具有匍匐生長(zhǎng)、擴(kuò)張能力強(qiáng)、再生速度快和粗蛋白含量較高等特點(diǎn)，是綠地建設(shè)的主要草種，也是廉價(jià)優(yōu)質(zhì)的牧草（趙桂琴等，2004）。本研究通過(guò)對(duì)白三葉進(jìn)行單一或聯(lián)合接種AMF和根瘤菌，分析其對(duì)白三葉生長(zhǎng)、光合作用、N含量、氨基酸組分及N同化相關(guān)酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白三葉種子購(gòu)自湖北省種子站。根據(jù)Xie等（2020）的前期研究結(jié)果，選用 AMF菌種為隱類球囊霉（Paraglomus occultum），由中國(guó)叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫(kù)（BGC）提供；經(jīng)白三葉盆栽擴(kuò)繁3個(gè)月后，由長(zhǎng)江大學(xué)根系生物學(xué)研究所通過(guò)孢子密度測(cè)定，確定每克AMF菌種內(nèi)含20個(gè)孢子。供試三葉草根瘤菌（Rhizobium trifolii）由中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供，經(jīng)酵母甘露醇液體培養(yǎng)基活化、單菌落培養(yǎng)。挑取單菌落置于40 mL液體培養(yǎng)基中，在220 r·min-1、28 ℃下培養(yǎng)18 h。取1 mL菌液置于20 mL液體培養(yǎng)基中，在220 r·min-1、28 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)3 h，隨后8 000 ×g 離心2 min，棄上清液，用無(wú)菌水制菌懸液至濃度為4.27×108 CFU·mL-1（OD600為0.3）。

栽培基質(zhì)為土和沙，比例為3/1（V/V），經(jīng)過(guò)高溫滅菌（0.11 MPa，121 ℃，2 h）使沙和土中的土著真菌孢子失活。試驗(yàn)用土采自長(zhǎng)江大學(xué)落葉果樹(shù)基地，試驗(yàn)用沙為直徑< 4 mm的河沙。試驗(yàn)用塑料盆的規(guī)格為上口徑15 cm、下口徑10 cm、高12 cm，裝1.3 kg基質(zhì)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

共設(shè)置4個(gè)處理，分別為未接種對(duì)照（control）、接種根瘤菌（inoculation with Rh）、接種AMF（inoculation with AMF）、聯(lián)合接種AMF和根瘤菌（inoculation with AMF and Rh）。每個(gè)處理有8個(gè)重復(fù)，隨機(jī)排列，共32盆。

1.3 植物培養(yǎng)

在將白三葉播種前，用95%乙醇和0.525%次氯酸鈉分別對(duì)種子進(jìn)行表面消毒5 min，用無(wú)菌水清洗5次，之后按照30粒種子/盆，播種在裝有栽培基質(zhì)的塑料盆中，3周后間苗至12棵/盆。播種的時(shí)候進(jìn)行接種處理，其中單接種根瘤菌處理是每盆接種10 mL三葉草根瘤菌菌懸液，并且所播種子預(yù)先在三葉草根瘤菌菌懸液浸泡30 min；單接種AMF處理是將100 g隱類球囊霉菌種混于栽培基質(zhì)中；聯(lián)合接種AMF和根瘤菌處理是將100 g隱類球囊霉菌種混于栽培基質(zhì)，并且所播種子預(yù)先在三葉草根瘤菌菌懸液浸泡30 min，之后將10 mL 三葉草根瘤菌菌懸液接種到栽培基質(zhì)中；未接種對(duì)照是混入等量滅菌的隱類球囊霉菌種和三葉草根瘤菌菌懸液，并且種子同樣浸泡在滅菌后的三葉草根瘤菌菌懸液中30 min。處理后的植物生長(zhǎng)在一個(gè)環(huán)境可控的生長(zhǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為900 lx，溫度為28 ℃/23 ℃（白天/黑夜），空氣相對(duì)濕度為68%。定期更換塑料盆位置以避免環(huán)境差異影響試驗(yàn)結(jié)果。植物培養(yǎng)期間未添加其他養(yǎng)分，每日17：00澆水100 mL，培養(yǎng)12周后結(jié)束試驗(yàn)。

1.4 植株生長(zhǎng)及生理指標(biāo)測(cè)定

收獲時(shí)植株分成地上部與地下部，人工測(cè)定生長(zhǎng)指標(biāo)，即植株株高、葉片數(shù)、匍匐莖長(zhǎng)度和生物量。采用FluorCam葉綠素?zé)晒獬上駜x進(jìn)行活體測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

根系菌根真菌侵染測(cè)定采取Phillips和Hayman（1970）的方法，菌根真菌侵染率為AMF侵染的根段長(zhǎng)度與觀察的總根段長(zhǎng)度的百分比。葉綠素含量測(cè)定采用王學(xué)奎（2016）的方法。葉片N含量測(cè)定，將葉片消化后采用間斷化學(xué)分析儀（Autochem 1200）分析。葉片氨基酸組分經(jīng)過(guò)乙腈水超聲提取、離心和微孔濾膜過(guò)濾（Liyanaarachichi et al.， 2018），之后在高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Shimadzu LC-20ADXR和Applied Biosystems Sciex Q-trap 5500質(zhì)譜儀）上分析。

葉片硝酸還原酶活性測(cè)定采用磺胺比色法（Cervilla et al.， 2009）。亞硝酸還原酶活性測(cè)定參照Ogawa等（1999）的方法。谷氨酸合成酶測(cè)定依據(jù)Singh和Srivastava（1986）的方法。采用劉淑云等（2007）的方法測(cè)定谷氨酸脫氫酶活性。天冬酰胺合成酶活性測(cè)定參照Shifrin等（1974）的方法。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定依據(jù)梁成剛等（2013）的方法。谷氨酰胺合成酶測(cè)定參照Husted等（2002）的方法稍作修改，即稱取0.2 g新鮮樣品，加入3 mL 50 mmol·L-1? Tris-HCl緩沖液（0.1 mol·L-1? Tris、2 mmol·L-1 MgSO4、2 mmol·L-1 二硫蘇糖醇和40 mmol·L-1 蔗糖）研磨成漿，4 ℃下10 000 ×g離心15 min；取0.7 mL上清液，加入1.6 mL反應(yīng)液（80 mmol·L-1 MgSO4、20 mmol·L-1 L-Na-谷氨酸鹽和20 mmol·L-1 L-半胱氨酸）以及0.7 mL ATP溶液，混勻后置于37 ℃下保溫30 min，加入1 mL顯色劑（0.2 mol·L-1三氯乙酸、0.37 mol·L-1 FeCl3和0.6 mol·L-1 HCl），搖勻，顯色10 min后，于5 000 ×g 離心10 min后取其上清液，在540 nm下測(cè)定吸光值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SAS軟件（9.1.3v）（SAS Institute Inc.， Cary， NC， USA）進(jìn)行方差分析，采用鄧肯新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一或聯(lián)合接種AMF和根瘤菌對(duì)AMF侵染白三葉根系的影響

未接種AMF的植株根系未發(fā)現(xiàn)菌根真菌侵染，而接種AMF的植株根系可見(jiàn)菌根結(jié)構(gòu)（圖1），其中單接種AMF的白三葉菌根真菌侵染率為（77.9±7.9）%，聯(lián)合接種AMF和根瘤菌的植株根系菌根真菌侵染率為（92.8±5.8）%，表明接種根瘤菌促進(jìn)了AMF對(duì)白三葉根系的侵染。

2.2 單一或聯(lián)合接種AMF和根瘤菌對(duì)白三葉生長(zhǎng)的影響

接種處理均促進(jìn)了白三葉的生長(zhǎng)（表1）。與不接種對(duì)照相比，單接種根瘤菌顯著提高了株高、匍匐莖長(zhǎng)度、葉片數(shù)、地上部生物量以及總生物量，分別提高了9.3%、49.4%、14.5%、19.9%和18.2%，而對(duì)地下部生物量無(wú)顯著影響；單接種AMF與聯(lián)合接種AMF和根瘤菌均顯著提高了白三葉的株高、匍匐莖長(zhǎng)度、葉片數(shù)、地上部生物量、地下部生物量和總生物量，單接種AMF分別提高了12.1%、48.7%、34.7%、32.9%、22.6%和31.0%，聯(lián)合接種AMF和根瘤菌分別提高了22.5%、202.6%、54.9%、74.1%、30.2%和66.3%?？梢?jiàn)，聯(lián)合接種對(duì)植株生長(zhǎng)的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于單接種，單接種AMF對(duì)植株生長(zhǎng)的促進(jìn)效果在葉片數(shù)和生物量上要優(yōu)于單接種根瘤菌。

2.3 單一或聯(lián)合接種AMF和根瘤菌對(duì)白三葉葉綠素含量的影響

如圖2所示，與不接種處理相比，單接種根瘤菌處理顯著提高了葉綠素b和總?cè)~綠素含量，分別提高了42.5%和20.8%，而對(duì)葉綠素a無(wú)顯著影響。單接種AMF與聯(lián)合接種AMF和根瘤菌均顯著提高了葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量，單接種AMF分別提高了30.4%、72.6%、38.3%，聯(lián)合接種AMF和根瘤菌分別提高了41.6%、102.6%、53.1%?？梢?jiàn)，聯(lián)合接種對(duì)葉綠素含量的促進(jìn)效應(yīng)明顯優(yōu)于單接種根瘤菌或AMF。

2.4 單一或聯(lián)合接種AMF和根瘤菌對(duì)白三葉葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由圖3：A-C可知，與不接種對(duì)照相比，單接種AMF或根瘤菌對(duì)葉片最大光量子效率（QY_max）均無(wú)顯著影響，而聯(lián)合接種AMF和根瘤菌的處理中QY_max顯著提高了31.4%?？梢?jiàn)，單接種根瘤菌、單接種AMF與聯(lián)合接種AMF和根瘤菌均顯著提高了葉片穩(wěn)態(tài)光量子效率（QY_Lss），顯著降低了葉片穩(wěn)態(tài)非光化熒光淬滅（NPQ_Lss）。

2.5 單一或聯(lián)合接種AMF和根瘤菌對(duì)白三葉葉片N含量的影響

與不接種相比，單接種根瘤菌、單接種AMF以及聯(lián)合接種AMF和根瘤菌的白三葉葉片N含量分別顯著提高了9.6%、18.8%和30.3%（圖4）?？梢?jiàn)，聯(lián)合接種對(duì)葉片N含量的增強(qiáng)效果要顯著高于單一接種根瘤菌或AMF。

2.6 單一或聯(lián)合接種AMF和根瘤菌對(duì)白三葉葉片氨基酸含量的影響

與未接種相比，單接種根瘤菌顯著提高了葉片的Ala、Gln含量，分別提高了27.5%、38.8%，顯著降低了Orn含量（降低了48.3%），而對(duì)Arg、Asn、Asp、Glu和His含量無(wú)顯著影響；單接種AMF以及聯(lián)合接種AMF和根瘤菌均顯著提高了白三葉葉片的Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His含量，單接種AMF分別提高了80.8%、104.5%、115.4%、34.1%、99.5%、64.7%、103.1%，聯(lián)合接種AMF和根瘤菌分別提高了98.9%、227.0%、114.4%、56.8%、101.4%、45.5%、154.7%，均顯著降低了Orn含量，分別降低了28.6%、39.5%（表2）。可見(jiàn)，聯(lián)合接種AMF和根瘤菌對(duì)白三葉葉片氨基酸含量的促進(jìn)效果更顯著。

2.7 單一或聯(lián)合接種AMF和根瘤菌對(duì)白三葉葉片N同化相關(guān)酶活性的影響

與未接種處理相比，單接種根瘤菌顯著提高了葉片的GS、GOGAT、GDH、AS、AST活性，分別提高25.0%、13.6%、25.5%、26.9%、36.0%；單接種AMF顯著提高了葉片的NR、NiR、GOGAT、GDH、AS、AST活性，分別提高了29.3%、33.6%、33.7%、26.0%、44.1%、36.8%；聯(lián)合接種AMF和根瘤菌處理顯著提高了葉片的NR、NiR、GS、GOGAT、GDH、AS、AST活性，分別提高了64.3%、85.5%、39.8%、58.1%、51.7%、68.2%、57.1%（表3）。可見(jiàn)，聯(lián)合接種對(duì)N同化相關(guān)酶活性的提升效果要明顯高于單一接種。

3 討論與結(jié)論

本研究中， 根瘤菌的接種顯著促進(jìn)了AMF對(duì)白三葉根系的侵染，表明根瘤菌引入有利于根系叢枝菌根的形成，其原因是根瘤菌通過(guò)固氮滿足AMF對(duì)N的需求，有利于根系A(chǔ)MF的建立（Xavier & Germida， 2003）。此外，根瘤菌提高了豆科植物體內(nèi)的N水平，為了其維持體內(nèi)N和P的平衡，豆科植物的固N(yùn)效率在很大程度上取決于P的供應(yīng)，而AMF有利于促進(jìn)植株對(duì)P的吸收。因此，豆科植物會(huì)提供給AMF足夠多的C供應(yīng)，促進(jìn)根系菌根的形成（Liu et al.， 2020），進(jìn)而有利于P的吸收。

本研究中，聯(lián)合接種AMF和根瘤菌對(duì)白三葉生長(zhǎng)的促進(jìn)效果顯著高于單一接種， 表明AMF和根瘤菌產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)共同促進(jìn)植物生長(zhǎng)，這與Talaat和Abdallah（2008）在蠶豆上的研究結(jié)果一致。根瘤菌和AMF對(duì)白三葉生長(zhǎng)的協(xié)同作用原因是根瘤菌的引入既促進(jìn)了植株固N(yùn)效率和固N(yùn)總量，又促進(jìn)了白三葉根系中AMF的侵染率，促使白三葉植株根系和AMF的生長(zhǎng)更好，進(jìn)一步擴(kuò)大植株根系和根外菌絲對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收面積。

本研究中，單一接種AMF和根瘤菌均顯著增加了葉綠素b及總?cè)~綠素的含量，并且聯(lián)合接種AMF和根瘤菌進(jìn)一步增強(qiáng)了這種效應(yīng)。此外，聯(lián)合接種的白三葉植株的QY_max和QY_Lss參數(shù)顯著高于未接種植株，而NPQ_Lss參數(shù)顯著低于未接種植株。QY_max和QY_Lss是光合性能的敏感指標(biāo)，NPQ_Lss是過(guò)多的激發(fā)能以熱能形式散發(fā)的參數(shù)（黃小輝等，2022）。聯(lián)合接種AMF和根瘤菌，一方面提高植株葉片光能轉(zhuǎn)化的效率以及反應(yīng)中心電子傳遞活性， 另一方面抑制植株光能以熱量散失，保障了白三葉植株光合產(chǎn)物最大效率的積累。因此，聯(lián)合接種AMF和根瘤菌的植株擁有較高的光合能力，而植株積累大量的光合產(chǎn)物為植物根系、AMF和根瘤菌生長(zhǎng)提供了保障。

本研究中，單接種根瘤菌或AMF均顯著增加白三葉葉片N含量，聯(lián)合接種植株葉片N含量顯著高于單接種。事實(shí)上，豆科植物的固N(yùn)效率與P的供應(yīng)密切相關(guān)，P是根瘤菌固N(yùn)反應(yīng)所需ATP酶合成的重要元素， 豆科植物根瘤的形成也需要P，而AMF龐大的根外菌絲結(jié)構(gòu)有利于P的獲取。因此，AMF在根瘤菌與植株建立友好共生過(guò)程中提供根瘤形成所需的P，共同提高植株共生固氮水平（Xie et al.， 2022）。Arg是AMF菌絲中氨基酸運(yùn)輸?shù)闹饕愋?，其含量占菌絲氨基酸總量的90%（金海如，2008）。因此，Arg對(duì)菌根N的轉(zhuǎn)移起到重要作用。本研究證實(shí)接種AMF顯著提高了Arg含量。Arg是生成信使分子如多胺的前體，可以促進(jìn)細(xì)胞分裂（楊洪強(qiáng)和高華軍，2007）。聯(lián)合接種植株中的Arg含量顯著高于單接種和未接種的植株，這與刁亞南等（2014）在綠豆上接種AM真菌和根瘤菌的結(jié)果一致。這表明AMF和根瘤菌的協(xié)同作用顯著增加了Arg含量，共同促進(jìn)植株地上部細(xì)胞分裂，進(jìn)一步促進(jìn)植株生長(zhǎng)。Asn是根瘤向共生植株輸送N化合物的主要形式（薛迎斌，2018）。因此，單接種根瘤菌比單接種AMF更加顯著提高Asn的含量；聯(lián)合接種AMF和根瘤處理具有協(xié)同作用，顯著提高了白三葉葉片氨基酸的含量，說(shuō)明此處理方式有利于促進(jìn)N的同化。

本研究中，接種AMF顯著增加白三葉葉片NR和NiR的活性，而接種根瘤菌對(duì)NR和NiR的活性無(wú)影響，表明AMF接種有利于白三葉由NO3-向NH4+轉(zhuǎn)變，這與田超等（2020）在苜蓿上的研究結(jié)果一致。此外，聯(lián)合接種根瘤菌和AMF的處理進(jìn)一步增強(qiáng)了單一接種AMF對(duì)NR和NiR活性的刺激效果，表明兩種微生物協(xié)同地增強(qiáng)了菌根植物葉片NO3-向NH4+ 轉(zhuǎn)變的速率。單一或聯(lián)合接種根瘤菌和AMF均提高了白三葉葉片的GOGAT、GDH、GS活性，這說(shuō)明單一或聯(lián)合接種根瘤菌和AMF通過(guò)調(diào)控GS/GOGAT和GDH途徑中的酶活性不同程度地促進(jìn)N同化合成氨基酸，其中聯(lián)合接種的作用效果更明顯，而接種根瘤菌在促進(jìn)NH4+轉(zhuǎn)化為Gln上比接種AMF效果顯著。本研究中單一和聯(lián)合接種根瘤菌和AMF均顯著促進(jìn)白三葉葉片的AS和AST活性，從而促進(jìn)Asn和Asp的積累。這表明聯(lián)合接種AMF和根瘤菌有效地激活了N同化相關(guān)酶的活性，提升了生成氨基酸的含量。

聯(lián)合接種AMF和根瘤菌具有協(xié)同效應(yīng)，有效促進(jìn)白三葉的植株生長(zhǎng)、顯著提高植株光合作用水平、葉片N含量，同時(shí)顯著增加了白三葉葉片中丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和組氨酸的含量，顯著提升了葉片N同化相關(guān)酶，如硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸脫氫酶、天冬酰胺合成酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活性，并顯著促進(jìn)AMF對(duì)白三葉根系的侵染。這說(shuō)明AMF和根瘤菌的協(xié)同作用有效地促進(jìn)了白三葉的N同化。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛 王登惠）