江永青,胡 穎,吳義翔,周小娟△

1.九江學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西九江 332000;2.九江學(xué)院,江西九江 332000

濕疹是一種慢性復(fù)發(fā)炎癥性皮膚病,合并強(qiáng)烈瘙癢,是最常見的皮膚病之一,成年人患病率為 2%～10%,兒童患病率高達(dá)20%[1]。濕疹是一種嗜酸性海綿狀皮膚炎癥,具有年齡依賴性分布特征[2]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)顆粒蛋白前體(PGRN)是多種系統(tǒng)功能(如先天免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及組織再生)的關(guān)鍵參與者和調(diào)節(jié)劑[3]。中醫(yī)認(rèn)為濕疹多因稟賦不耐,飲食失節(jié),脾胃受損,濕熱內(nèi)生,又兼外受風(fēng)邪,內(nèi)外兩邪相搏,充于腠理,浸淫肌膚,發(fā)為本病。濕疹病位在表,外治藥物不僅可以直達(dá)病所,透達(dá)腠理發(fā)揮局部的治療作用,還能通過肌腠毛竅,深入臟腑起到內(nèi)外合治的作用。黃柏是治療濕疹的常用藥物,但作用機(jī)制尚不明了[4]。PGRN與濕疹之間存在何種聯(lián)系,中藥黃柏對(duì)濕疹小鼠PGNR有何種影響,仍待研究。本研究擬檢測濕疹小鼠PGNR的表達(dá)情況,探討中藥黃柏對(duì)濕疹小鼠的作用,為中醫(yī)藥治療濕疹提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種雄性小鼠30只,體質(zhì)量(20±2)g,由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)條件:自然光照,溫度 25 ℃,相對(duì)濕度50%,保持動(dòng)物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。小鼠自由進(jìn)食、飲水。

1.2儀器與試劑 2,4-二硝基氯苯(DNCB)購于山東西亞化學(xué)股份有限公司。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;總RNA抽提試劑TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測用 SYBR Green mix 熒光染料均購自TaKaRa 公司。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組及建立急性濕疹模型 采用隨機(jī)數(shù)字表法將 30只小鼠分為空白對(duì)照組、濕疹模型組、黃柏治療組,每組各10只。除空白對(duì)照組外,濕疹模型組和黃柏治療組均建立急性濕疹模型。造模前所有小鼠在飼養(yǎng)條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)第1天起,在小鼠耳內(nèi)側(cè)涂抹50 μL 5% DNCB溶液,每日1次,持續(xù)5 d,第6天起,在小鼠耳部涂抹50 μL 1% DNCB溶液,每日1次,持續(xù)5 d。涂抹后24 h見耳部皮膚出現(xiàn)紅腫、丘疹、滲出、結(jié)痂等典型急性濕疹表現(xiàn),證明造模成功。

黃柏治療組采用黃柏洗劑(藥物濃度為1 000 mg/mL)涂抹于小鼠皮膚損傷處,每天3次,每次2 mL,連續(xù)10 d,于停藥后24 h、末次治療結(jié)束24 h后,留取濕疹皮膚損傷處皮膚組織。

1.3.2皮膚損傷評(píng)分 由2位研究者分別進(jìn)行皮膚損傷評(píng)分,并在評(píng)分前隱去組別信息。參照濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)評(píng)分法肉眼觀察小鼠皮膚損傷情況,根據(jù)紅斑、水腫/丘疹、滲出/結(jié)痂、抓痕/表皮剝脫4種臨床表現(xiàn),按照0 分(無)、1 分(輕度)、2 分(中度)、3 分(重度)對(duì)皮膚損傷評(píng)分,分值可記半分(0.5 分)。每組小鼠皮膚損傷評(píng)分的平均分為該組的分?jǐn)?shù),取2位研究者的平均分納入統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3提取組織標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用頸椎脫臼法處死小鼠后,沿耳基線剪下患耳耳廓,采用8 mm打孔器取得耳廓組織,將其置于液氮中磨成粉末,并提取RNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(美國,A&B7500 Real Time PCR System)檢測 PGRN mRNA及β-actin表達(dá)水平。β-actin F:GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG;R:ATGCCACAGGATTCCATACC。PGRN F :CAACAGGGCAGTGTCTT TGC;R:AGATGGCATTGGGCATTGGA。PGRN基因相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測PGRN蛋白和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平 PGRN半衰期為40 h[5],早晨8:00-9:00眼眶采血。取小鼠外周血50 μL,采用ELISA檢測PGRN蛋白表達(dá)水平。小鼠PGRN ELISA 試劑盒購自R&D公司。取小鼠外周血50 μL,采用ELISA檢測TNF-α水平,TNF-α ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2 結(jié) 果

2.13組小鼠耳部濕疹皮膚損傷程度及評(píng)分比較 空白對(duì)照組、濕疹模型組和黃柏治療組皮膚損傷評(píng)分分別為0、(2.40±0.52)、(1.80±0.54)分。與空白對(duì)照組比較,濕疹模型組有明顯紅腫、角化結(jié)痂、滲出等皮膚損傷,皮膚損傷程度評(píng)分明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與濕疹模型組比較,黃柏治療組耳部皮膚紅腫、角化結(jié)痂、滲出等損傷減輕,皮膚損傷評(píng)分明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.23組小鼠PGRN基因相對(duì)表達(dá)水平比較 空白對(duì)照組、濕疹模型組和黃柏治療組PGRN基因相對(duì)表達(dá)水平分別為(0.43±0.16)、(2.09±0.31)、(1.44±0.17)。與空白對(duì)照組比較,濕疹模型組PGRN相對(duì)表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與濕疹模型組比較,黃柏治療組PGRN 相對(duì)表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.33組小鼠外周血PGRN蛋白表達(dá)水平比較 空白對(duì)照組、濕疹模型組和黃柏治療組外周血PGRN蛋白表達(dá)水平分別為(865.90±60.37)、(1 556.31±68.16)、(1 202.20±90.06)ng/mL。與空白對(duì)照組比較,濕疹模型組外周血PGRN蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與濕疹模型組比較,黃柏治療組外周血PGRN蛋白表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.43組小鼠外周血TNF-α水平比較 空白對(duì)照組、濕疹模型組和黃柏治療組TNF-α水平分別為(155.97±16.43)、(374.01±24.04)、(226.83±20.02)ng/mL。與空白對(duì)照組比較,濕疹模型組外周血TNF-α水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與濕疹模型組比較,黃柏治療組TNF-α水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

濕疹是最常見的炎癥性皮膚病,導(dǎo)致皮膚干燥、開裂和發(fā)癢。輕度濕疹患者的皮膚有小塊干燥,而中度濕疹患者的皮膚損傷區(qū)域更大、更紅或腫脹?；加袊?yán)重濕疹的人會(huì)出現(xiàn)全身發(fā)紅的皮痂和破損的皮膚(可能會(huì)滲出液體)。反復(fù)抓撓會(huì)觸發(fā)自我持續(xù)的瘙癢-抓撓循環(huán),這會(huì)對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生重大影響。濕疹的病因復(fù)雜,但皮膚屏障異常和免疫失調(diào)是主要因素,包括輔助性T細(xì)胞(TH細(xì)胞)活性增加等。BIEDERMANN等[6]的研究表明,免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)濕疹的發(fā)展,其中CD4 TH細(xì)胞亞群的異常表達(dá)是該疾病的主要原因之一。TH1、TH2、TH17和TH22的增加,以及炎癥細(xì)胞因子的過度積累不可避免地導(dǎo)致濕疹發(fā)生。2型免疫反應(yīng)和增強(qiáng)的IgE反應(yīng)是誘發(fā)濕疹的主要因素[7]?？乖l(fā)的TH2細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-5 和IL-13 會(huì)誘導(dǎo)免疫功能障礙,隨后破壞皮膚組織的完整性,導(dǎo)致濕疹發(fā)生[8]。

PGRN是一種多效性生長因子,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長周期,在免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著核心作用[9]。PGRN可誘導(dǎo)多種炎癥細(xì)胞因子的分泌,如IL-8、IL-6、IL-10、TNF-α。在對(duì)硬皮病的研究中發(fā)現(xiàn),PGRN的過表達(dá)將抑制真皮成纖維細(xì)胞對(duì)TNF-α的抗纖維化作用[10]。在對(duì)糖尿病小鼠的研究中發(fā)現(xiàn),PGRN缺乏會(huì)增加腎損傷,PGRN可防止高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[11]。PGRN可通過抑制高遷移率族蛋白1負(fù)調(diào)節(jié)自噬來防止哮喘氣道重塑。同時(shí)PGRN還可抑制氣道上皮細(xì)胞中自噬標(biāo)志物和自噬體水平,從而控制體內(nèi)和體外的纖維化過程[12]。PGRN在多種免疫介導(dǎo)的疾病發(fā)展中具有保護(hù)作用,在包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、1 型糖尿病和多發(fā)性硬化癥等多種疾病中參與調(diào)節(jié)重要的免疫信號(hào)通路,特別是TNF-α/TNF受體信號(hào)通路。然而,PGRN在銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥中的作用仍存在爭議。

目前,關(guān)于濕疹發(fā)病機(jī)制的研究取得了重大進(jìn)展,但缺乏持久且耐受性良好的治療方法。免疫抑制藥物,如類固醇,最常用于治療濕疹,但不良反應(yīng)嚴(yán)重,可導(dǎo)致免疫抑制、機(jī)會(huì)性感染和骨質(zhì)疏松癥[13]。因此,迫切需要長期有效且耐受性良好的新型療法。中醫(yī)藥對(duì)免疫炎癥疾病具有理想的治療效果。黃柏是治療濕疹的高頻中藥,味苦,性寒,歸腎、膀胱經(jīng),具有清熱燥濕, 瀉火解毒,消腫祛腐等作用,其臨床作用還包括調(diào)節(jié)免疫功能、抗菌、抗氧化、抗癌等。研究表明,黃柏治療可明顯抑制濕疹小鼠瘙癢和皮膚損傷,減少炎癥細(xì)胞的浸潤,黃柏可減少炎癥細(xì)胞因子的表達(dá),包括IL-1β、IL-4、干擾素(IFN)-γ、IL-13 和 IL-17,并增加炎癥細(xì)胞因子IL-10的表達(dá),減輕了皮膚炎癥,同時(shí)促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá),降低 CD4+T細(xì)胞的表達(dá)[14]。黃柏外用治療糖尿病足潰瘍可促進(jìn)潰瘍愈合,提高生長因子水平,促進(jìn)血清表皮生長因子水平升高[15]。在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸中 IL-6、TNF-α、核因子(NF)-κB和環(huán)氧化酶-2(COX-2)表達(dá)水平升高,而給予復(fù)方黃柏液灌腸后,IL-6、TNF-α、NF-κB 和 COX-2的表達(dá)水平明顯降低,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方黃柏液可能通過抑制 NF-κB /COX-2 信號(hào)通路的激活,進(jìn)一步降低炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-6 的表達(dá)水平,對(duì)濕疹起到治療作用[16]。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)PGRN與濕疹密切相關(guān)。濕疹模型小鼠PGRN基因相對(duì)表達(dá)水平、外周血PGRN蛋白表達(dá)水平及TNF-α水平均明顯升高。黃柏對(duì)濕疹有顯著治療效果,其作用機(jī)制可能與PGRN有關(guān)。黃柏治療濕疹小鼠,濕疹小鼠皮膚紅腫、角化結(jié)痂、滲出等損傷減輕,小鼠皮膚PGRN基因相對(duì)表達(dá)水平、外周血PGRN蛋白表達(dá)水平及TNF-α水平均明顯降低。