張 亮， 于 哲， 賀銀鳳

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

重金屬鉛污染與人類活動有密切的關(guān)系[1]。 環(huán)境中的鉛降解緩慢，且易形成化合物附著在土壤表面和水體中[2-3]，鉛通過生物放大作用影響食品安全進(jìn)而影響人體健康[4]。 進(jìn)入人體的鉛易蓄積且不易排出，會對人體生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等產(chǎn)生損傷[5]?？紤]到鉛對環(huán)境和人體的危害，需要采取措施將環(huán)境和人體中的鉛移除[6]。 過去常采用物理化學(xué)法去除鉛，因其效率低下、價格高昂、操作煩瑣，逐漸被微生物修復(fù)法所替代[7]。 近些年的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌應(yīng)用于吸附重金屬也有良好的效果，其細(xì)胞壁成分在吸附重金屬方面起關(guān)鍵作用[8]。

乳酸菌多分布于人與動物腸道中，它們可以調(diào)節(jié)人與動物腸道的菌群結(jié)構(gòu)和生理功能。 同時，一部分乳酸菌還有治療腹瀉、增強(qiáng)免疫力、降血壓、治療抑郁、抗腫瘤等保健和醫(yī)療作用[9-11]。 乳酸菌有悠久的使用歷史， 一向被認(rèn)為是安全的（generally recognized as safe，GRAS）。但是，也有研究報道從感染性病變和臨床樣本中分離出了乳桿菌屬、片球菌屬和雙歧桿菌屬[12-13]，這就使得新菌種資源應(yīng)用于人體或者動物體前進(jìn)行安全性評價是必要的。

目前對具有吸附重金屬鉛能力的乳酸菌安全性的研究報道十分少見。 為了解該菌株在使用中是否會對人體及動物體產(chǎn)生不良影響，作者測定了戊糖片球菌10-a-1 對小鼠的急性毒性、 遺傳毒性和28 d 毒性，并通過小鼠采樣后分析小鼠血液生化學(xué)指標(biāo)、臟器指數(shù)、生產(chǎn)性能、血生化指標(biāo)和腸組織的厚度變化，評價其對動物的安全性，以期為新資源的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

健康昆明小鼠：內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物研究中心提供，清潔級，體質(zhì)量（20±2） g，用于急性毒性試驗與28 d 毒性試驗；體質(zhì)量（30±2） g，用于遺傳毒性試驗。

1.2 試驗菌株

戊糖片球菌10-a-1 分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市包鋼礦區(qū)的羊糞中，經(jīng)鑒定是戊糖片球菌，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物技術(shù)團(tuán)隊測定， 菌株10-a-1 在其最適生長溫度37 ℃和最適pH 6.5 時對鉛的吸附率達(dá)到（91.77±1.97）%。 隨著菌體濃度升高，吸附率隨之上升；隨著吸附時間的增加，單位菌體吸附量和吸附率也逐漸增加[14]。

1.3 儀器與材料

1.3.1 試驗儀器 5810R 型高速低溫離心機(jī)： 德國Eppendorf；BioTek Epoch 全波長酶標(biāo)儀： 美國BioTek；SX-500 型高壓滅菌鍋： 日本Tomy Digital Biology；OLYMPOS BX50 光 學(xué) 顯 微 鏡： 日 本OLYMPOS；SMART-N 超純水機(jī)： 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3.2 試驗材料 姬姆薩稀釋液：北京酷來博科技有限公司；1 mL 一次性使用無菌注射器： 河南曙光匯知康生物科技股份有限公司；2 mL 一次性真空采血管：石家莊康衛(wèi)仕醫(yī)療器械有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒、 谷丙轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.4 戊糖片球菌10-a-1 供試菌液制備

作者按照GB 15193.3—2014[15]的規(guī)定中的上-下法執(zhí)行，灌胃劑量采用默認(rèn)計量梯度系數(shù)為3.2，高、中、低劑量組分別為2.000、0.555、0.175 mg/g（以體質(zhì)量計）。 取戊糖片球菌10-a-1 在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至第二代，將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液于4 ℃、8 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，菌泥再用0.85 g/dL 的生理鹽水洗滌2 遍， 菌泥水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%左右。 所得濕菌泥的高、中、低劑量為6.667、1.850、0.583 mg/g（以體質(zhì)量計）。 灌胃溶劑采用0.02 mL/g（以體質(zhì)量計）的0.85 g/dL 生理鹽水，將濕菌泥溶于0.85 g/dL 生理鹽水中。

1.5 急性毒性試驗

按照GB 15193.3—2014[15]的規(guī)定執(zhí)行。 將適應(yīng)環(huán)境2 d 的健康昆明小鼠分為2 組， 每組10 只，雌雄各半，分別是對照組和戊糖片球菌10-a-1 組。 對照組用0.85 g/dL 的生理鹽水灌胃，戊糖片球菌10-a-1 試驗組用6.667 mg/g （以體質(zhì)量計） 的菌液灌胃。灌胃前1 d 小鼠采取斷食不斷水飼養(yǎng)方式，灌胃后第1、3、5、7 d 分別記錄小鼠的行為表現(xiàn)及中毒情況。 主要指標(biāo)包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)及軀體運(yùn)動、自主神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)現(xiàn)象的觀察記錄。 細(xì)菌移位試驗是在喂養(yǎng)結(jié)束后將小鼠處死， 摘取心、肝、脾、腎并在無菌環(huán)境下切開，用無菌棉簽擦拭臟器剖面， 涂布于固體MRS 培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀測是否有細(xì)菌生長。 如果有菌落生長時，則根據(jù)菌落外觀、細(xì)胞形態(tài)、液體培養(yǎng)基生長特性、流動性、革蘭氏反應(yīng)等篩選出具有與本研究菌株相似屬性的微生物， 提取DNA 進(jìn)行PCR 技術(shù)擴(kuò)增進(jìn)一步判斷是否試驗菌株發(fā)生細(xì)菌移位。

1.6 遺傳毒性試驗

1.6.1 哺乳動物紅細(xì)胞微核試驗 按照GB 15193.5—2014[16]的規(guī)定執(zhí)行。 選7 周齡小鼠，體質(zhì)量（30±2） g，雌雄性小鼠各25 只，分為高、中、低共3 個戊糖片球菌10-a-1 劑量組和陽性、陰性對照組共10 組，每組5 只。 陽性采用40 mg/kg（以體質(zhì)量計）環(huán)磷酰胺經(jīng)口灌胃，高、中、低劑量組采用1.2.1方法制備菌液灌胃；陰性對照組用0.85 g/dL 生理鹽水灌胃。 采用30 h 受試物給予法，第一次給予受試物后的第24 小時，再次給予受試物6 h 后采集骨髓樣本。 骨髓樣本用生理鹽水沖洗后滴于載玻片上，與小牛血清混勻推片，晾干后用甲醇固定，再使用Giesam 染色沖片晾干后觀察。鏡檢記錄并統(tǒng)計嗜多染紅細(xì)胞中微核與正染紅細(xì)胞數(shù)量，計算得到微核率。 目的菌各劑量組微核率、PCE/NCE 與陰性對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義，則結(jié)果應(yīng)是陰性；有統(tǒng)計學(xué)意義，并有明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，則結(jié)果應(yīng)是陽性。

1.6.2 小鼠精子畸形試驗 按照GB 15193.7—2003[17]的規(guī)定執(zhí)行。 選7 周齡雄性小鼠25 只，體質(zhì)量（30±2） g，分為陽性、高劑量、中劑量、低劑量、生理鹽水對照組共5 組， 每組5 只。 陽性對照采用40 mg/kg（以體質(zhì)量計）環(huán)磷酰胺經(jīng)口灌胃，高、中、低劑量組用制備的菌液灌胃，對照組用0.85 g/dL 生理鹽水灌胃。 在處死前3 h 按40 mg/kg （以體質(zhì)量計）經(jīng)口灌胃環(huán)磷酰胺，將小鼠脫頸處死，小鼠腹部最下端噴少許體積分?jǐn)?shù)75%乙醇并將其剪開。 剝離腹部脂肪可見黃豆粒大小睪丸，將睪丸側(cè)下方附睪取下， 漂洗后放入含有2 mL 的離心管中， 將其剪碎，并用移液槍吹打，使精子與生理鹽水混勻，再將4 層擦鏡紙過濾的濾液滴于載玻片上， 晾干后用甲醇固定，再用體積分?jǐn)?shù)2%伊紅染液染色1 h。 鏡檢記錄并統(tǒng)計目的菌劑量組畸變率與陰性對照組精子畸形的形態(tài)以及數(shù)量情況，計算得到精子畸形率（%）并將其相比，無統(tǒng)計學(xué)意義則結(jié)果是陰性；有統(tǒng)計學(xué)意義并有明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，則結(jié)果是陽性。

1.7 28 d 喂養(yǎng)試驗

按照GB 15193.22—2014 的規(guī)定執(zhí)行[18]。 選擇健康的KM 小鼠，雌雄小鼠各20 只，體質(zhì)量為（26±2） g，隨機(jī)分為4 組，每組10 只。 采用經(jīng)口灌胃法，將0.85 g/dL 生理鹽水按0.02 mL/g（以體質(zhì)量計）作為灌胃溶劑，對照組只使用溶劑灌胃，高、中、低劑量組采用制備的菌液灌胃。 喂養(yǎng)試驗開始后，每天09：00 進(jìn)行灌胃，28 d 連續(xù)灌胃并且觀察記錄小鼠的體質(zhì)量、采食量。在試驗結(jié)束后，進(jìn)行16 h 斷糧不斷水的操作，為下一步試驗做準(zhǔn)備。

1.7.1 小鼠血液生化指標(biāo) 將28 d 喂養(yǎng)試驗小鼠乙醚麻醉后摘眼球取全血于EDTA 抗凝管中，3 500 r/min 離心10 min，取抗凝管上層血清，使用血清生化測定試劑盒測定谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）。

1.7.2 腸黏膜組織學(xué)檢查 參照文獻(xiàn)[19]的方法完成。 將28 d 喂養(yǎng)的對照組與試驗組的小鼠回腸、盲腸、結(jié)腸各取2 cm，用生理鹽水將腸道內(nèi)容物清理后，放入體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定液中，送往愛博試劑公司進(jìn)行蘇木精-伊紅染色和切片， 使用光學(xué)顯微鏡上的目鏡測微計測量形態(tài)學(xué)參數(shù)。 記錄上皮細(xì)胞高度、絨毛高度、黏膜厚度，每個樣本的每個參數(shù)隨機(jī)進(jìn)行10 次測量， 并將這些測量值的平均值用于統(tǒng)計分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗組內(nèi)組間重復(fù)3 次， 采用SPSS23.0 和One-Way（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗

2.1.1 小鼠一般情況 將戊糖片球菌10-a-1 以6.667 mg/g（以體質(zhì)量計）溶解于0.02 mL/g（以體質(zhì)量計）的生理鹽水中，采用灌胃的方式給予1 只小鼠受試物，48 h 內(nèi)小鼠無不良反應(yīng)和死亡。 再取5只小鼠以相同的劑量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行灌胃，在飼養(yǎng)一周后小鼠全部存活， 并且中樞神經(jīng)系統(tǒng)及軀體運(yùn)動、自主神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)等指標(biāo)試驗組與對照組相同且全部正常（見表1），表明該菌株對小鼠半致死量LD50>6.667 mg/g（以體質(zhì)量計）。

表1 急性毒性試驗小鼠表現(xiàn)Table 1 Mice performance in the acute toxicity test

2.1.2 細(xì)菌移位試驗 作為進(jìn)入動物體或人體的微生物， 首先要考慮其對宿主是否有不利的影響，大量攝入活菌制劑的毒性及其易位性等日益成為人們關(guān)注的問題[20]。 細(xì)菌易位是一種活細(xì)菌穿過腸道屏障定植在周圍組織和器官的現(xiàn)象，可引起全身炎癥反應(yīng)、組織損傷、器官衰竭以及機(jī)體死亡。 在腸外組織中轉(zhuǎn)移、存活和增殖的能力是腸道致病菌引起系統(tǒng)性感染可能性的關(guān)鍵決定因素，通常小鼠感染后7 d，致病菌向脾臟的移位達(dá)到峰值水平，此后開始下降。 因此，在喂食益生菌的第7 天進(jìn)行細(xì)菌向脾臟移位試驗的研究[21]。將心、肝、脾、腎表面切開后， 內(nèi)部用無菌棉拭子擦拭后的組織液在MRS 固體培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)48 h。 圖1 所示試驗菌株10-a-1 的MRS 培養(yǎng)基上未見菌落生長，與陰性對照試驗結(jié)果相同， 證明戊糖片球菌10-a-1 未發(fā)生細(xì)菌移位現(xiàn)象。

圖1 細(xì)菌移位結(jié)果Fig. 1 Bacterial translocation results

2.2 遺傳毒性試驗

遺傳毒性是指外部的理化因素直接或間接作用于人體或者動物體， 使其遺傳物質(zhì)在染色體、分子和堿基水平受到損傷，這種損傷被認(rèn)為是可遺傳效應(yīng)的基礎(chǔ)，是致癌性的前體[22]。

2.2.1 小鼠精子畸形試驗 通過小鼠精子畸形試驗可觀察到： 在精子接觸某種物質(zhì)一定時間后，其頭部及尾部形態(tài)改變，就可使供試物生殖細(xì)胞畸形[23]。 由表2 可以看出，在觀察每個劑量組5×1 000個精子后， 陽性對照組總的精子畸形個數(shù)為537個，陽性對照組個體畸形率為11.46%；戊糖片球菌10-a-1 各劑量組和生理鹽水對照組總精子畸形數(shù)126~141 個，個體畸形率2.52%~2.82%，各劑量組與陰性對照組無顯著性差異（P＞0.05）。 說明在試驗劑量范圍內(nèi)，小鼠精子畸形試驗結(jié)果為陰性，戊糖片球菌10-a-1 對小鼠精子不產(chǎn)生畸變作用。

表2 小鼠精子畸形試驗數(shù)據(jù)分析表（n=5）Table 2 Data analysis of mouse sperm deformity test（n=5）

2.2.2 小鼠紅細(xì)胞微核試驗 微核試驗常作為檢測染色體或有絲分裂器損傷的一種重要手段，作為致癌作用的重要信號，是遺傳毒性評價重要構(gòu)成部分[24]。 由表3 可以看出，在觀察每個劑量組5×1 000個PCE 后， 戊糖片球菌10-a-1 各劑量組中PCE 含微核的總數(shù)12~16 個，實驗組和陰性對照組微核率為0.24%~0.32%，試驗菌在雌雄各劑量組與生理鹽水對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），且微核率都在正常范圍內(nèi)。 在PCE/NCE 中和陰性對照組為0.92~0.93， 目的菌株各劑量組與生理鹽水對照組PCE/NCE 比較無顯著性差異（P＞0.05）。 經(jīng)口灌胃環(huán)磷酰胺的陽性對照組微核率極顯著高于陰性對照組以及試驗組（P＜0.01）。 說明在試驗組的劑量范圍內(nèi)戊糖片球菌10-a-1 未引起小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率升高， 戊糖片球菌10-a-1 對小鼠骨髓細(xì)胞未見損傷作用。

表3 小鼠紅細(xì)胞微核試驗數(shù)據(jù)分析表（n=5）Table 3 Data analysis of mouse red blood cell micronucleus test （n=5）

2.3 28 d 毒性試驗

2.3.1 小鼠生產(chǎn)性能分析 連續(xù)28 d 的活菌經(jīng)口灌胃，對小鼠進(jìn)食狀況分析，觀察小鼠能否適應(yīng)大量活菌入侵從而引發(fā)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而影響小鼠的體質(zhì)量增長、攝食量、料體質(zhì)量比。 由表4 可以看出，戊糖片球菌10-a-1 在小鼠生產(chǎn)性能試驗中，雄性小鼠戊糖片球菌10-a-1 各劑量組與對照組初始體質(zhì)量在（30±2） g，雌性小鼠戊糖片球菌10-a-1各劑量組與對照組初始體質(zhì)量在（26±2） g，當(dāng)連續(xù)灌胃喂養(yǎng)28 d 后，終體質(zhì)量無顯著性差異（P>0.05），小鼠總攝食量試驗組與對照組無顯著性差異 （P>0.05），并且各劑量組未見計量依賴關(guān)系。 雌性中劑量組的體質(zhì)量增長與攝食量略低于其余試驗組，這可能是鼠籠擺放位置處于籠架下方，導(dǎo)致小鼠每日的光照時間不足，活動量小于其余試驗組，而非雌性小鼠的抵抗力弱于雄性小鼠所致[25]。 雌性小鼠低劑量組的料體質(zhì)量比大， 可能與小鼠稱質(zhì)量時，雌性低劑量組在最后，因為操作導(dǎo)致小鼠受驚嚇不進(jìn)食，處于饑餓狀態(tài)有關(guān)。 但在雌性中劑量試驗組增質(zhì)量、低劑量組料體質(zhì)量比與對照組的小鼠進(jìn)食狀況中未見統(tǒng)計學(xué)差異，并且雄性試驗組與對照組正常，表明戊糖片球菌10-a-1 菌株具較高安全性。

表4 小鼠生產(chǎn)性能試驗（n=5）Table 4 Production of mouse performance test（n=5）

2.3.2 小鼠臟器指數(shù) 心臟指數(shù)通常是反應(yīng)身體健康狀況的指標(biāo)，腎與肝是排毒解毒器官，脾有產(chǎn)生免疫反應(yīng)的重要功能，血液中抗原在脾中可引起有力的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)[26-27]。 當(dāng)致病菌入侵時可能會導(dǎo)致器官萎縮或者腫大，通過臟器指數(shù)能進(jìn)行有效觀察[28]。 由表5 可知，戊糖片球菌10-a-1灌胃的雄性和雌性小鼠的高、中、低劑量組，心、腎、肝、脾占體質(zhì)量比例與對照組比較，均無顯著性差異（P＞0.05）。 在雌性與雄性腎體比中，有顯著性差異，是因為雄性腎臟所占比例大，不是戊糖片球菌10-a-1 導(dǎo)致。 這些表明戊糖片球菌10-a-1 對小鼠臟體比無明顯影響。

表5 小鼠臟器指數(shù)分析表（n=5）Table 5 Analysis of mouse organ index（n=5）

2.3.3 血清生化指標(biāo)檢測 在毒性試驗中常以γ-GT、ALT 和AST 來反應(yīng)受試物是否對肝腎功能損害。 ALT 和AST 是參與氨基酸代謝的酶，在肝細(xì)胞輕度受損時這2 種酶活性有明顯變化。 γ-GT 是一種轉(zhuǎn)移酶，主要催化谷氨酰基轉(zhuǎn)換反應(yīng)。 γ-GT 主要存在于肝細(xì)胞質(zhì)微粒體、肝細(xì)胞膜的膽汁分泌側(cè)和細(xì)小的膽管上皮中，能夠催化谷胱甘肽或其他含谷氨?；嚯纳系墓劝滨；D(zhuǎn)移到其他合適的受體上去，也是反映肝功能較為敏感的指標(biāo)[29-32]。 表6 血液生化指標(biāo)結(jié)果顯示，經(jīng)不同劑量戊糖片球菌10-a-1活菌灌胃28 d 后，血清生化指標(biāo)ALT、γ-GT 與對照組無顯著性差異（P＞0.05），證明戊糖片球菌10-a-1對小鼠的肝臟細(xì)胞無損傷。 各劑量組AST 對照組無顯著性差異（P＞0.05），證明對小鼠心肌細(xì)胞無損傷。

表6 小鼠血清生化指標(biāo)分析表（n=5）Table 6 Analysis of serum biochemical indexes of mouse（n=5）

2.3.4 腸黏膜組織學(xué)檢查 大多數(shù)乳酸菌被認(rèn)為是安全的，它們存在于人體皮膚表面、口腔和腸道中， 而且它們在食品中有著長期的安全使用歷史，用于預(yù)防或治療腸道疾病。 乳酸菌作為益生菌食品添加劑來增強(qiáng)免疫功能和預(yù)防胃腸道感染有著重要的作用。 但Patricia 等發(fā)現(xiàn)，一些雙歧桿菌具有胃腸道黏蛋白降解活性，同時有afcA 和engBF 基因存在時分解黏蛋白能力會增強(qiáng)[33]。 Salvatore 等人研究發(fā)現(xiàn)SLAB51 益生菌能使豬腸道黏蛋白發(fā)生特異性變化，從而改善了動物的健康狀態(tài)[34]。表7 腸黏膜組織學(xué)檢查結(jié)果顯示， 在灌胃戊糖片球菌10-a-1 的各劑量組中，試驗組回腸絨毛高度與生理鹽水對照組回腸絨毛高度無顯著性差異（P＞0.05），試驗組與生理鹽水對照組回腸、盲腸、結(jié)腸的黏膜厚度與上皮細(xì)胞高度無顯著性差異（P＞0.05），并且黏膜厚度在30~40 μm，說明戊糖片球菌10-a-1 不會對小鼠的腸道組織產(chǎn)生損傷。

表7 乳酸菌對腸道形態(tài)的影響（n=5）Table 7 Effect of Lactobacillus on intestinal morphology （n=5）

3 結(jié) 語

作者對分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市包鋼礦區(qū)羊糞中具有鉛吸附能力的戊糖片球菌10-a-1 進(jìn)行了包括急性毒性試驗、遺傳毒性試驗和亞慢性毒性試驗的小鼠體內(nèi)試驗， 通過小鼠一般情況觀察、細(xì)菌移位、攝食量、小鼠骨髓微核率、小鼠精子畸形率、小鼠臟器指數(shù)、血清生化指標(biāo)檢測、腸黏膜組織學(xué)檢查等較為全面的安全性評價，證明戊糖片球菌10-a-1 對動物機(jī)體不產(chǎn)生毒害作用，具有較高的安全性，有開發(fā)成吸附鉛的微生態(tài)制劑的潛能，為實際生產(chǎn)應(yīng)用提供了良好的理論基礎(chǔ)。