吳 成， 程平言， 謝 丹， 黃 魏， 李嶺卓， 張 健， 尤小龍， 胡 峰， 鐘方達(dá)

（貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州 習(xí)水 564622）

中國白酒種類豐富、風(fēng)味獨(dú)特。 醬香型白酒以貴州茅臺(tái)、貴州習(xí)酒、四川郎酒為代表，具有醬香突出、幽雅細(xì)膩的特征，該特點(diǎn)的形成與高溫大曲密切相關(guān)[1]。 高溫大曲是以小麥為原料，加入水和母曲，在發(fā)酵過程中品溫最高可達(dá)60~70 ℃的一種糖化劑和發(fā)酵劑，具有提供菌源、糖化發(fā)酵、產(chǎn)酒生香的作用[2]。 其中富含功能豐富的真菌微生物，如酵母菌Saccharomyces 和Pichia 可以產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)；絲狀真菌如Aspergillus、Rhizomucor 和Rhizopus可以代謝多種酶類包括α-淀粉酶、葡糖淀粉酶等[3-6]，因此，解析高溫大曲中真菌群落組成對(duì)挖掘功能微生物具有重要意義。

傳統(tǒng)的醬香型白酒高溫大曲制作主要是通過人工踩制，存在勞動(dòng)強(qiáng)度大、生產(chǎn)效率低、人工成本高的缺點(diǎn)[7-8]。 目前，現(xiàn)代生物技術(shù)、自動(dòng)化和電子信息技術(shù)已應(yīng)用于白酒生產(chǎn)中，以改進(jìn)傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)工藝、提高白酒質(zhì)量和風(fēng)味，進(jìn)而推進(jìn)機(jī)械化在高溫大曲制作中的應(yīng)用[9-10]。高溫大曲機(jī)械化壓制過程與人工踩制過程類似，其采用獨(dú)創(chuàng)氣缸模擬人工腳掌踩曲，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度、提高了生產(chǎn)效率[8]。 近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)由于具有測(cè)序方法簡單、通量高、速度快和準(zhǔn)確性較高的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于釀造微生物多樣性研究中[11]。 相關(guān)研究者將高通量測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法結(jié)合解析了高溫大曲中真菌群落組成，結(jié)果表明在高溫大曲中優(yōu)勢(shì)真菌主要包括Candida、Trichoderma、Aspergillus 和Thermomyces， 但在不同產(chǎn)區(qū)、不同發(fā)酵時(shí)期以及小類真菌群落組成上表現(xiàn)出差異性[12-18]，并且其中還存在一定數(shù)量的未知菌屬有待于進(jìn)一步分析鑒定。 隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以PacBio（Pacific BioSciences）公司的單分子實(shí) 時(shí) 測(cè) 序 技 術(shù) （single molecule real -time sequencing，SMRT）為代表的三代高通量測(cè)序技術(shù)已開始應(yīng)用于釀酒微生物多樣性的研究中[19]。 與二代高通量測(cè)序技術(shù)相比，SMRT 具有讀取序列長度長、精確度高的優(yōu)點(diǎn)，可以將更多的微生物注釋到種水平[11,20-21]。 但由于SMRT 成本相對(duì)較高，目前較少見到其在高溫大曲微生物多樣性中應(yīng)用的研究報(bào)道。

因此，為解析醬香型白酒仿生機(jī)制曲及傳統(tǒng)人工曲發(fā)酵過程真菌多樣性及特征， 以及比較SMRT與二代高通量測(cè)序技術(shù)分析結(jié)果異同，作者采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法及SMRT 對(duì)醬香型白酒高溫大曲發(fā)酵過程，包括曲坯成型入倉（發(fā)酵0 d）、一次翻曲（發(fā)酵8 d）、二次翻曲（發(fā)酵15 d）、曲坯出倉（發(fā)酵35 d）中真菌多樣性及特征進(jìn)行研究，旨在解析醬香型白酒高溫大曲制作過程中真菌群落組成及其特征， 為挖掘高溫大曲中功能微生物及進(jìn)一步闡明高溫大曲發(fā)酵和調(diào)控機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫大曲：采集于貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司；Power DNA Isolation Kit 試劑盒： 美國Mibio 公司；孟加拉紅培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；WL 培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司；YPD 培養(yǎng)基：2 g/dL 葡萄糖、2 g/dL 蛋白胨、1 g/dL 酵母浸粉， 固體YPD 培養(yǎng)基中加入2 g/dL 瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F 無菌操作臺(tái)： 蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZQPW-70 全溫振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；YXQ-LS-100SII 立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；DM500 光學(xué)顯微鏡：德國LEICA 公司；PCR 儀：美國ThermoFisher 公司；PacBio Sequel 測(cè)序平臺(tái)：美國PacBio 公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品處理 曲坯成型入倉（AQ）、 一次翻曲（YF）、二次翻曲（EF）和發(fā)酵結(jié)束出倉（CQ）各工藝環(huán)節(jié)按曲倉的門、中、窗不同位置各隨機(jī)取3 塊高溫大曲，于4 ℃下立即帶回實(shí)驗(yàn)室粉碎，按質(zhì)量比1∶1∶1 混合為一個(gè)綜合樣品，共8 個(gè)樣品，其中仿生機(jī)制曲4 個(gè)、 傳統(tǒng)人工曲4 個(gè)； 樣品編號(hào)分別為AQ1、YF1、EF1、CQ1、AQ2、YF2、EF2 和CQ2（1 表示仿生機(jī)制曲，2 表示傳統(tǒng)人工曲）。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

1）真菌的分離及初鑒定 稱取10 g 大曲綜合樣品于90 mL 無菌水中，30 ℃、180 r/min 恒溫振蕩30 min，采用稀釋涂布平板法（稀釋度為10-1、10-2、10-3） 于孟加拉紅培養(yǎng)基上分離篩選絲狀真菌、WL培養(yǎng)基上分離篩選酵母菌， 放置于30 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2~3 d 及5 d 后，記錄菌落總數(shù)。根據(jù)菌落形態(tài)隨機(jī)挑取絲狀真菌菌落3~5 株、 酵母菌30~50株，再次純化于孟加拉紅培養(yǎng)基和WL 培養(yǎng)基上進(jìn)一步觀察菌落形態(tài)特征，同時(shí)結(jié)合光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)對(duì)分離菌株進(jìn)行初步鑒定[22]；絲狀真菌純化于PDA 培養(yǎng)基， 于4 ℃斜面保藏、 酵母菌純化于YPD 液體培養(yǎng)基中，－80 ℃甘油保藏 （體積分?jǐn)?shù)40%的甘油與菌液體積比為1∶1）。

2）菌株的分子鑒定 選取代表性菌株1~3 株采用Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒提取DNA， 采用通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTG CGG）和ITS2（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行ITS 鑒定。 PCR 反應(yīng)體系包括： 引物各1 μL；DNA 模板2 μL；去離子水7 μL；PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，30 次循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，降至4 ℃。將PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，采用BLAST 軟件與標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行比對(duì)分析， 將相似度在97%以上的認(rèn)定為同一菌種。

3）單分子實(shí)時(shí)測(cè)序 樣品總DNA 采用PowerSoil DNA Isolation Kit 試劑盒進(jìn)行提取， 具體操作步驟參照試劑盒說明書， 選擇ITS 全長序列由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行單分子實(shí)時(shí)測(cè)序。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 單分子實(shí)時(shí)測(cè)序中，由于測(cè)序片段的大小遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于測(cè)序長度，因此目標(biāo)片段會(huì)重復(fù)測(cè)多次（passes），通常當(dāng)passes 數(shù)目大于4 時(shí)，環(huán)形一致性序列（circular consensus sequencing，CCS）的準(zhǔn)確性就可達(dá)99%以上。 因此，測(cè)序完成后，通過SMRT Link 軟件將原始下機(jī)數(shù)據(jù)校正得到CCS 序列數(shù)據(jù)，按照最小passes≥5、最低預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率≥0.9識(shí)別CCS 序列。 然后對(duì)CCS 序列進(jìn)行Barcode 識(shí)別、過濾、去除嵌合體后，得到有效CCS 序列，使用Usearch 軟件對(duì)有效CCS 序列在97.0%相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得OTU。 以UNITE 為參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，使用QIIME2 軟件計(jì)算Chao1、Shannon和Simpson 指數(shù)分析樣品Alpha 多樣性； 基于物種相對(duì)豐度使用SPSS 軟件進(jìn)行主成分分析； 使用CYTOSCAPE 軟件對(duì)真菌物種間相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法

采用稀釋平板涂布法，共分離保藏528 株酵母菌、44 株絲狀真菌，結(jié)合其菌落及細(xì)胞形態(tài)特征，可將528 株酵母菌劃分為11 種類型（I~XI）、絲狀真菌4 種類型（XII~XV），見圖1。對(duì)代表性菌株進(jìn)行ITS區(qū)域序列分析后，將其鑒定為Saccharomyces cerevisiae、Wickerhamomyces anomalus、Pichia kudriavzevii、Millerozyma farinose、Candida tropicalis、Trichomo -nascus ciferrii，Kazachstania humilis、Clavispora lusitaniae、Torulaspora delbrueckii、Kodamaea ohmeri、Kluveromyces marxianus 11 種 酵 母 菌， 以 及Aspergillus fumigatus，Aspergillus nidulans，Asper -gillus chevalieri，Rhizomucor pusillus 4 種絲狀真菌。由表1 可知，在AQ 環(huán)節(jié)，仿生機(jī)制曲中酵母菌群落較傳統(tǒng)人工曲豐富；YF 至CQ 環(huán)節(jié)， 酵母菌數(shù)量逐漸降低；EF 和CQ 環(huán)節(jié)絕大部分已檢測(cè)不出， 這可能與發(fā)酵溫度逐漸升高（YF 環(huán)節(jié)溫度達(dá)65 ℃左右）大部分酵母菌不耐高溫有關(guān)。 但也有少部分酵母菌如M. farinosa 和C. lusitaniae 表現(xiàn)出耐高溫的特性。 Jung 等從韓國傳統(tǒng)發(fā)酵劑Nuruk 中篩選到了一株產(chǎn)木糖醇的耐熱M. farinose[23]，F(xiàn)an 等從大曲中分離篩選到一株高產(chǎn)己酸乙酯的C. lusitaniae[24]，表明在高溫大曲發(fā)酵過程中，耐高溫酵母菌可能對(duì)大曲風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)作用；而絲狀真菌在高溫大曲發(fā)酵整個(gè)過程都有檢出，方程等研究表明，大曲中富含種類豐富的絲狀真菌， 除了具有分泌多種功能酶類、降解原料中淀粉和蛋白質(zhì)、產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)作用外，還具有強(qiáng)大的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成潛力，是挖掘新天然產(chǎn)物的重要來源[25]。

表1 依賴于可培養(yǎng)方法高溫大曲中真菌群落變化情況Table 1 Change of fungal community in high temperature Daqu revealed by cultured-dependent approaches

圖1 醬香型白酒高溫大曲中真菌菌落及顯微特征Fig. 1 Colonies and microscopic characteristics of fungal in high-temperature Daqu of sauce-flavor baijiu

2.2 單分子實(shí)時(shí)測(cè)序

2.2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量及Alpha 多樣性指數(shù)分析 各樣品采用PacBio Sequel 測(cè)序后， 對(duì)序列進(jìn)行識(shí)別、過濾、 去除嵌合體后共獲得58 410 條有效CCS 序列，每個(gè)樣品至少有7 046 條有效序列，樣品平均序列長度為554~596 bp，見表2。 使用QIIME2 軟件分析各樣品Alpha 多樣性指數(shù)，Chao1 指數(shù)可以反映樣品中物種數(shù)量，Shannon 和Simpson 指數(shù)可以反映樣品中物種多樣性。 從AQ 到CQ 環(huán)節(jié)，仿生機(jī)制曲和傳統(tǒng)人工曲的真菌多樣性呈逐漸降低趨勢(shì)。 對(duì)于仿生機(jī)制曲而言，Chao1 指數(shù)逐漸下降，Shannon和Simpson 指數(shù)在AQ 和EF 環(huán)節(jié)較高， 在YF 和CQ 較低； 而在傳統(tǒng)人工曲中，Chao1、Shannon 和Simpson 指數(shù)在YF 和CQ 環(huán)節(jié)較高， 在AQ 和EF環(huán)節(jié)較低，表明真菌群落組成在2 種高溫大曲中存在較大差異。 同時(shí)，各樣品中的覆蓋率（coverage）在96.99%~99.97%，表明測(cè)序深度足夠、各樣品測(cè)序量充分，測(cè)序結(jié)果能夠真實(shí)反映各樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性。

表2 樣品測(cè)序及Alpha 多樣性指數(shù)結(jié)果Table 2 Results of sample sequencing and Alpha-diversity indexes

2.2.2 真菌多樣性分析 使用Usearch 軟件對(duì)有效CCS 序列在97.0%相似度水平下進(jìn)行聚類， 共得到178 個(gè)操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU），進(jìn)一步采用UNITE 數(shù)據(jù)庫對(duì)每個(gè)OTU 進(jìn)行注釋比對(duì)，最終檢測(cè)到6 個(gè)門、17 個(gè)綱、32 個(gè)目、64個(gè)科、114 個(gè)屬和162 個(gè)種。

在種水平上，將相對(duì)豐度在1%以上的真菌認(rèn)定為優(yōu)勢(shì)菌種， 共檢出包括Thermoascus aurantiacus、Thermoascus crustaceus、Byssochlamys spectabilis、Thermomyces lanuginosus、P. kudriavzevii、K. humilis、W. anomalus、Geotrichum silvicola、C. tropicalis 和A. subflavus 等24 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌種， 總的相對(duì)豐度在88.74%以上，部分菌種與傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法鑒定結(jié)果一致，見圖2。 在AQ 環(huán)節(jié)，酵母菌P.kudriavzevii（10.34%/49.10%）、K. humilis（33.64%/21.64% ）、W. anomalus（20.61%/9.81%）和C.tropicalis（7.09%/1.59%）為主要優(yōu)勢(shì)菌種；隨著發(fā)酵溫度升高，酵母菌數(shù)量及種類逐漸下降， 至YF 環(huán)節(jié)，T. auarntiacus（65.48%/39.53%）成為主要優(yōu)勢(shì)菌種；到EF 環(huán)節(jié)，仿生機(jī)制曲中真菌群落組成較傳統(tǒng)人工曲豐富，EF1 與EF2 相比，除T. aurantiaus 和B. spectabilis外， 還檢出了一定量的T. crustaceus、W. anomalus和A. subflavus，各相對(duì)豐度在10.00%以上，同時(shí)還檢 出 了 少 量 的 Hyphopichia burtonii、Wallemia canadensis 和A. versicolor 等； 在CQ 環(huán) 節(jié)，以T.aurantiacus（27.64%/6.31%）、T. crustaceus（55.77%/61.03%）、B. spectabilis（1.15%/2.11%）、T.lanuginosus（1.50%/30.12%） 為主的耐高溫絲狀真菌成為優(yōu)勢(shì)菌種。

圖2 種水平上高溫大曲中真菌群落組成Fig. 2 Composition of fungal community in high-temperature Daqu at species level

在醬香高溫大曲發(fā)酵過程中， 在AQ 環(huán)節(jié)2 種高溫大曲中以酵母菌為主要優(yōu)勢(shì)菌種，其可能是來源于母曲和周圍環(huán)境[26]；隨著發(fā)酵溫度的升高（YF至EF 環(huán)節(jié)）， 由于大多數(shù)真菌不能在高溫下存活，耐熱絲狀真菌及少部分耐熱酵母菌成為主要優(yōu)勢(shì)菌種。 有研究表明，在醬香型白酒高溫大曲發(fā)酵過程中，大多真菌類微生物易受高溫環(huán)境的調(diào)控[14]；到CQ 環(huán)節(jié)，2 種大曲中真菌群落組成類似但在相對(duì)豐度上存在差異，可能與曲坯發(fā)酵結(jié)束后仿生機(jī)制曲和傳統(tǒng)人工曲水分和酸度存在差異有關(guān)[27]。同時(shí)，與二代高通量測(cè)序結(jié)果相比，貴州茅臺(tái)高溫大曲中主要 優(yōu) 勢(shì) 菌 屬 包 括 Aspergillus，Mucor，Rhizopus，Candida，Pichia 和Sacccharomyces 等[28-29]；沈毅等從四川郎酒高溫大曲中發(fā)現(xiàn)T. languginosus、A.cibarius 和Thermoascus sp.為主要優(yōu)勢(shì)菌種，且還存在一定數(shù)量的未知菌屬[30]。 可知在種水平上SMRT 測(cè)序技術(shù)更有利于揭示真菌群落組成情況，特別是小類菌種的組成（相對(duì)豐度＜1%）。

2.2.3 主成分及物種相關(guān)性分析 基于優(yōu)勢(shì)菌種的相對(duì)豐度對(duì)樣品進(jìn)行主成分分析，見圖3。結(jié)果表明，AQ1 和AQ2 樣品真菌群落結(jié)構(gòu)組成相似。到Y(jié)F環(huán)節(jié)后，仿生機(jī)制曲與傳統(tǒng)人工曲中真菌群落組成差異明顯，YF 與EF 環(huán)節(jié)可能是由于B、C、D 類別中真菌含量上的差異導(dǎo)致2 種大曲真菌群落組成差異明顯；CQ 環(huán)節(jié)可能是由于A 類別中真菌含量存在差異導(dǎo)致2 種大曲真菌群落組成差異明顯，即2 種大曲中優(yōu)勢(shì)菌種由于含量的差異從而造成仿生機(jī)制曲與傳統(tǒng)人工曲在YF 至CQ 環(huán)節(jié)呈現(xiàn)出差異性。

圖3 基于優(yōu)勢(shì)菌種相對(duì)豐度的主成分分析Fig. 3 PCA analysis based on relative abundance of the dominant species

為進(jìn)一步研究上述主要微生物之間的相互關(guān)系，選取屬水平相對(duì)豐度大于1%的物種，計(jì)算其物種之間的斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)，并篩選相關(guān)性大于0.1 且P<0.05 的數(shù)據(jù)構(gòu)建物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖4。多數(shù)真菌屬之間呈顯著正相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制，其中包括55 個(gè)真菌屬呈顯著正相關(guān)，6 個(gè)真菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)。 這些復(fù)雜的生物學(xué)關(guān)系構(gòu)成了高溫大曲發(fā)酵過程的基本生物學(xué)調(diào)控機(jī)制，也是高溫大曲發(fā)酵過程發(fā)酵動(dòng)力、風(fēng)味動(dòng)力形成和調(diào)控機(jī)制的基本組 成。 由 圖 4 可 知，Thermoascus 與 Pichia、Filobasidium、Eremothecium 和Fusarium 等4 種真菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)，這4 種菌屬不管是仿生機(jī)制曲還是傳統(tǒng)人工曲的含量都呈下降趨勢(shì)，至曲坯發(fā)酵結(jié)束出倉已基本檢測(cè)不出。 Bassochlamys 與Kazachstania、Geotrichum 呈 顯 著 負(fù) 相 關(guān)，Pichia、Kazachstania、Candida、Wickerhamomyces 等4 種 酵母呈顯著正相關(guān)，它們?cè)谇鞒尚腿雮}環(huán)節(jié)含量最多，隨著發(fā)酵的進(jìn)行含量逐漸降低，這可能主要是受發(fā)酵溫度的影響。

圖4 高溫大曲制作過程真菌群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖（屬水平）Fig. 4 Correlation network diagram of fungal communities in the process of high-temperature Daqu making at genus level

2.3 傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法與SMRT 測(cè)序結(jié)果比較

采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和SMRT 測(cè)序技術(shù)在醬香型白酒高溫制曲過程中都檢出了W. anomalus、P. kudriavzevii、C. tropicalis、K. ohmeri、K. humilis、K. marxianus 以及Aspergillus 屬絲狀真菌，但2 種方法鑒定結(jié)果存在差異。 在SMRT 測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了大 量 的Thermoascus、Byssochlamys 及Thermomyces屬絲狀真菌和其他小類菌屬，而傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法沒有檢出， 卻發(fā)現(xiàn)了一定量的S. cerevisiae、M. farinosa、T. ciferrii、C. lusitaniae、T. delbruecki 和R. pusillus。 2 種方法鑒定分析結(jié)果存在差異性的原因主要是：1）傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法中使用的培養(yǎng)基類別太少，有待于進(jìn)一步優(yōu)化；2）在傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法中無法僅通過ITS 區(qū)域測(cè)序分析實(shí)現(xiàn)對(duì)絲狀真菌在種水平上準(zhǔn)確的鑒定，如Aspergillus 屬絲狀真菌。

作者選擇WL 培養(yǎng)基對(duì)高溫大曲中酵母菌進(jìn)行篩選分離，并結(jié)合菌落及顯微形態(tài)對(duì)其進(jìn)行初步分類，但同一種酵母菌由于菌株代謝差異，可能在WL培養(yǎng)基上呈現(xiàn)不同的菌落形態(tài)導(dǎo)致分類結(jié)果有偏差，但選擇代表性菌落并結(jié)合ITS 區(qū)域測(cè)序分析，可以較好地實(shí)現(xiàn)對(duì)酵母菌鑒定至種水平；而對(duì)絲狀真菌進(jìn)行分析鑒定時(shí)， 作者發(fā)現(xiàn)ITS 區(qū)域測(cè)序分析可能不適用于Aspergillus 屬絲狀真菌種水平上的鑒定，這可能是導(dǎo)致在傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和SMRT 測(cè)序結(jié)果中出現(xiàn)的Aspergillus 屬不同種的原因，這在李營等的研究結(jié)果中也得到證實(shí)[31]，他們發(fā)現(xiàn)該屬的A. lentulus 和A. udagawae 無法通過ITS 測(cè)序進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分鑒定。 SMRT 測(cè)序技術(shù)與二代高通量測(cè)序技術(shù)相比，雖然具有讀取序列長度長，精確度較高的優(yōu)點(diǎn)，但其通量較低。 同時(shí)，SMRT 測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性有賴于參考序列的長短及數(shù)據(jù)庫的完整性。 唐勇等研究發(fā)現(xiàn)， 在16S rRNA 基因的SMRT 測(cè)序中，RDP 數(shù)據(jù)庫在屬及以上水平注釋準(zhǔn)確性較高，而greengene 數(shù)據(jù)庫具有種水平的注釋優(yōu)勢(shì)，其建議在進(jìn)行SMRT 測(cè)序時(shí)，參考序列應(yīng)該選擇更長的基因序列或者綜合多個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋[20-21]。 基于此，我們也同時(shí)采用UNITE 和Genbank 數(shù)據(jù)庫對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋比對(duì)，結(jié)果表明UNITE 較Genbank 數(shù)據(jù)庫更適用于ITS 區(qū)域全長序列的注釋比對(duì)。 但相關(guān)研究表明， 在二代高通量測(cè)序技術(shù)中，Genbank 與RDP、SILVA 數(shù)據(jù)庫相比，更適用于真核微生物鑒定尤其是酵母菌的鑒定[32]，這可能與測(cè)序時(shí)選擇的參考序列長短有關(guān)。 因此，在后續(xù)的研究中，本課題組將進(jìn)一步比較不同的真菌數(shù)據(jù)庫結(jié)果。

3 結(jié) 語

作者采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法與SMRT 測(cè)序技術(shù)對(duì)醬香型白酒仿生機(jī)制曲及傳統(tǒng)人工曲發(fā)酵過程中真菌多樣性及其特征進(jìn)行了研究。 結(jié)果表明，W. anomalus、P. kudriavzevii、C. tropicalis、K. ohmeri、K. humilis、K. marxianus 以及Aspergillus 屬絲狀真菌，可同時(shí)通過傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法與SMRT 測(cè)序技術(shù)檢出，但在小類菌屬鑒定分析上SMRT 測(cè)序技術(shù)更顯優(yōu)勢(shì)。通過SMRT 測(cè)序共檢出6 個(gè)門、17 個(gè)綱、32個(gè)目、64 個(gè)科、114 個(gè)屬和162 個(gè)種，且從曲坯成型入倉到發(fā)酵結(jié)束出倉，真菌多樣性呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，與傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法結(jié)果一致。 主成分分析表明，仿生機(jī)制曲和傳統(tǒng)人工曲僅在曲坯入房環(huán)節(jié)真菌群落組成相似。 但從一次翻曲到曲坯發(fā)酵結(jié)束出倉，2 種大曲中真菌群落組成差異較大。主要表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)菌種豐度及小類菌種組成上存在差異，這可能與曲坯中水分、酸度和發(fā)酵溫度有關(guān)。 物種相關(guān)性分析結(jié)果表明，多數(shù)真菌屬之間呈顯著正相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制， 其中包括55 個(gè)真菌屬呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，6 個(gè)真菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)，真菌群落微生物之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，在后續(xù)研究中我們將進(jìn)一步闡明微生物演替代謝與大曲中風(fēng)味物質(zhì)之間的聯(lián)系。

雖然傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法具有耗時(shí)較長、工作量大的缺點(diǎn)，但是采用WL 培養(yǎng)基可對(duì)高溫大曲中酵母菌進(jìn)行了快速初步分類，因此，WL 培養(yǎng)基可作為快速分類鑒定酵母菌的有效手段，我們將在后續(xù)的研究工作中構(gòu)建酵母菌在WL 培養(yǎng)基上菌落形態(tài)的數(shù)據(jù)庫，以期更好地對(duì)酵母菌進(jìn)行快速分類鑒定。 對(duì)絲狀真菌鑒定后僅發(fā)現(xiàn)了種類較少的絲狀真菌，同時(shí)發(fā)現(xiàn)僅通過ITS 區(qū)域測(cè)序分析無法實(shí)現(xiàn)對(duì)部分絲狀真菌種水平上的準(zhǔn)確鑒定。 我們將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步對(duì)選擇培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合絲狀真菌的生長代謝特點(diǎn)，以期在后續(xù)的研究中分離篩選到種類更加豐富的絲狀真菌，為構(gòu)建醬香型高溫大曲分類標(biāo)準(zhǔn)提供參考。 此外，傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法鑒定結(jié)果表明， 部分酵母菌呈現(xiàn)出耐高溫的特性， 如M.farinosa 和C. lusitaniae， 它們?cè)卺u香型白酒中的作用相關(guān)研究報(bào)道較少，有待于進(jìn)一步闡明。

SMRT 測(cè)序技術(shù)作為第三代高通量測(cè)序技術(shù)的代表，同時(shí)具有測(cè)序序列長且測(cè)序錯(cuò)誤率較低的優(yōu)點(diǎn)[20-21]。 本研究結(jié)果表明，與第二代高通量測(cè)序技術(shù)相比，SMRT 測(cè)序技術(shù)更適合于在種水平上對(duì)真菌多樣性進(jìn)行分析。目前以Roche454 和Illumina 測(cè)序平臺(tái)為主的第二代高通量測(cè)序技術(shù)在微生物多樣性研究中仍是主力[11]，因?yàn)楸M管SMRT 測(cè)序錯(cuò)誤率較低，且可以通過提高循環(huán)測(cè)序深度（passes）降低錯(cuò)誤率，但是目前SMRT 存在的系統(tǒng)錯(cuò)誤及無法完全排除嵌合體序列干擾等問題仍是SMRT 測(cè)序技術(shù)在微生物多樣性研究中的挑戰(zhàn)[33]。

綜上所述，醬香型白酒高溫大曲發(fā)酵過程真菌群落組成豐富，仿生機(jī)制曲和傳統(tǒng)人工曲在優(yōu)勢(shì)菌種豐度和小類菌種群落組成上存在較大差異，從而導(dǎo)致2 種大曲從一次翻曲到發(fā)酵結(jié)束出倉呈現(xiàn)較大的差異性。 本研究為挖掘高溫大曲中功能酵母菌和絲狀真菌以及進(jìn)一步闡明高溫大曲發(fā)酵機(jī)理提供了理論依據(jù)。