殷方榮， 翟李欣， 田喬鵬， 管政兵， 蔡宇杰， 廖祥儒*

（1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 無(wú)錫 214122）

隨著人口的增長(zhǎng)，人們對(duì)食品和飼料行業(yè)中蛋白質(zhì)的需求也在同步增長(zhǎng)。 據(jù)估計(jì)，到2050 年，全球僅對(duì)動(dòng)物源性蛋白質(zhì)的需求就可能翻一番[1]。 而在2019 年，僅雞毛就產(chǎn)生了470 多萬(wàn)t[2]。羽毛被歸為第三類動(dòng)物副產(chǎn)品，是低風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)物材料，所以能作為新的可循環(huán)的蛋白質(zhì)或氨基酸的來(lái)源[3-4]。 然而， 羽毛中蛋白質(zhì)資源的90%左右都為角蛋白，角蛋白由多個(gè)氫鍵和疏水殘基的相互作用[5-6]以及二硫鍵交聯(lián)的肽鏈結(jié)構(gòu)組成[7]，使其難以被降解，所以即便羽毛有著豐富的蛋白質(zhì)資源，每年仍有數(shù)百萬(wàn)公斤的羽毛會(huì)被丟棄到環(huán)境中。

丟棄的羽毛一般會(huì)被填埋或焚燒處理，但是填埋會(huì)侵占寶貴的土地資源，焚化羽毛也會(huì)產(chǎn)生有毒氣體，從而導(dǎo)致環(huán)境的污染[7-8]。 目前一般采用高溫高壓或化學(xué)處理羽毛，直接將羽毛轉(zhuǎn)化為羽毛粉作為動(dòng)物飼料，但是這種做法會(huì)破壞氨基酸，造成資源浪費(fèi)，消化率和利用率很低，并且容易造成環(huán)境污染，成本也較為高昂[9-11]。因此，如何經(jīng)濟(jì)環(huán)保地提高羽毛粉的利用率，是一個(gè)非常有價(jià)值的研究方向。

使用酶和微生物從可再生資源中獲得有價(jià)值的產(chǎn)品已成為一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域[12-14]。 角蛋白很難被降解， 但是角蛋白酶（Keratinase，EC3.4.99.11）可以破壞角蛋白中的二硫鍵，降解角蛋白，這也是它區(qū)別于其他蛋白酶的特質(zhì)[15-16]。 利用角蛋白酶處理羽毛粉，提高羽毛粉利用率也是羽毛資源利用的主要途徑之一。 相比于其他蛋白酶，角蛋白酶具有更廣的利用范圍，所以其應(yīng)用價(jià)值較高[17-18]。

從自然界中直接分離篩選菌種是開(kāi)發(fā)新酶的途徑，然而用野生菌表達(dá)角蛋白酶，其純化分離困難，不利于角蛋白酶的應(yīng)用。 現(xiàn)在微生物基因組信息資源則提供了一種更快捷的方式——基因挖掘[20]。 利用基因工程克隆表達(dá)角蛋白酶有利于酶的分離純化，也便于后續(xù)對(duì)酶的酶活性質(zhì)及應(yīng)用的探究。 目前用分子生物學(xué)手段挖掘潛在的角蛋白酶基因進(jìn)行表達(dá)的研究還不多，因此，篩選降解羽毛粉水平高的菌種，對(duì)其角蛋白酶基因進(jìn)行挖掘并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的探究，可以為表達(dá)優(yōu)良的角蛋白酶提供盡可能多的基因材料，也能為羽毛粉降解提供新的有價(jià)值的角蛋白酶。

芽孢桿菌是角蛋白酶的主要來(lái)源[19]，在芽孢桿菌中發(fā)掘新型角蛋白酶對(duì)食品飼料行業(yè)有潛在的應(yīng)用價(jià)值。 近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了多種微生物來(lái)源的角蛋白酶，在這些微生物中，芽孢桿菌仍然是主要的產(chǎn)酶微生物，說(shuō)明在芽孢桿菌中挖掘潛在的角蛋白酶基因是可行的[21-26]。

先前已有研究人員通過(guò)基因挖掘從Bacillus velezensis SYBC H47 中克隆表達(dá)了優(yōu)良的磷酸酯酶、轉(zhuǎn)氨酶、羧酸酯酶等基因，顯示出菌株B.velezensis SYBC H47 有著極大的基因挖掘價(jià)值和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[27-30]。 根據(jù)角蛋白酶氨基酸序列同源性分析，其編碼基因與枯草桿菌蛋白酶的編碼基因有著較高的序列同源性[31]。 作者通過(guò)對(duì)B. velezensis SYBC H47的全基因組篩選，獲得新的角蛋白酶基因（baker1），對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、克隆表達(dá)、純化和酶學(xué)性質(zhì)研究， 探究了其在羽毛粉降解中的應(yīng)用，并通過(guò)高效液相色譜儀進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件

E. coli DH5a 及BL21（DE3）、質(zhì)粒pColdⅡ：均購(gòu)自大連Takara。 在重組菌株的活化和構(gòu)建過(guò)程中，菌株均在Luria-Bertani 肉湯培養(yǎng)基（10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl）中培養(yǎng)，必要時(shí)將氨芐青霉素（100 mg/mL）加入該培養(yǎng)基中。

1.2 生化材料和分子生物學(xué)工具

氨芐青霉素、偶氮酪蛋白和酪蛋白：購(gòu)自上海Sigma-Aldrich；分子生物學(xué)工具（DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、純化試劑盒、Bradford 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒、DNA 及標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker、DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切核酸酶、T4 DNA 連接酶和IPTG 等）：購(gòu)自Takara；其他化學(xué)藥品：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 角蛋白酶活性的檢測(cè)

參考Yang 等人的方法檢測(cè)角蛋白酶的活性[38]。

1.4 生物信息學(xué)分析

根據(jù)B. velezensis SYBC H47 的全基因組信息注釋（GenBank No：CP017747），共有23 條基因被推定為蛋白酶基因。 對(duì)其開(kāi)放閱讀框、信號(hào)肽預(yù)測(cè)、保守結(jié)構(gòu)域等分析參照Huang 等的方法[34]。

1.5 PCR 擴(kuò)增和重組菌株的構(gòu)建

B. velezensis SYBC H47 的基因組DNA 通過(guò)DNA 提取試劑盒獲得。根據(jù)之前篩選獲得的基因序列，使用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，并按照預(yù)設(shè)方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 核酸凝膠檢測(cè)并純化PCR 產(chǎn)物，之后用設(shè)定的限制性核酸內(nèi)切酶消化，并與相同的內(nèi)切酶消化后的質(zhì)粒pColdⅡ進(jìn)行連接。 將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5a 中，并通過(guò)質(zhì)粒DNA測(cè)序（無(wú)錫天霖）來(lái)驗(yàn)證。 測(cè)序成功后，將正確的重組質(zhì)粒提取出來(lái)，再轉(zhuǎn)化到E. coli BL21（DE3）中進(jìn)行蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)[32]。

1.6 重組角蛋白酶的富集和純化

低溫誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收獲重組菌株，經(jīng)過(guò)超聲波破碎并離心， 使得角蛋白酶釋放到上清液中。由于重組角蛋白酶還有組氨酸標(biāo)簽，可用鎳柱親和層析來(lái)純化重組角蛋白酶[33]。將得到的粗酶液用0.22 μm 纖維素濾膜過(guò)濾，采用AKTA avant 蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。 最后通過(guò)5 mL HitrKeTM 脫鹽柱（上海GE Healthcare）將純化的酶脫鹽，并使用超濾管（10 000 截留值）濃縮。

通過(guò)SDS-PAGE 凝膠電泳分析純化后的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量[34]。 Bradford 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度， 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白（BSA）。

1.7 純化角蛋白酶的生化特性

1.7.1 最佳pH 和pH 穩(wěn)定性的確定 使用偶氮酪蛋白作為底物， 將等量酶液加入5.0~13.0 的不同pH 緩沖液中測(cè)定最佳pH，55 ℃下反應(yīng)20 min。 另外，在55 ℃下將酶在不同pH 的緩沖液中溫育1 h，之后測(cè)酶的殘余活性，用來(lái)研究pH 的穩(wěn)定性。緩沖液的濃度為50 mmol/L， 分別為pH 5.0~7.0 的Na2HPO4-NaH2PO4、pH 7.0~9.0 的Tris-HCl、pH 9.0~12.0 的甘氨酸-NaOH 以及pH 12.0~13.0 的KCl-NaOH。

1.7.2 最佳溫度和熱穩(wěn)定性的確定 在保證最佳pH 時(shí)，以偶氮酪蛋白作為底物，在10~85 ℃的設(shè)定梯度測(cè)定最佳溫度。 另外，為了研究熱穩(wěn)定性，在最佳pH 條件下，將酶在10~80 ℃設(shè)定梯度，分別溫育1 h 后測(cè)酶的殘余活性。

1.7.3 金屬離子對(duì)酶活性的影響 用氯化物鹽測(cè)定金屬離子對(duì)酶活性的影響，包括NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、FeCl2、ZnCl2、NiCl2、MnCl2、CoCl2和CuCl2， 金 屬離子濃度設(shè)為2 種，分別為1 mmol/L 和5 mmol/L。將含有酶的緩沖液（最適pH）與不同濃度的不同金屬離子混合，在最適溫度下反應(yīng)1 h 后，以偶氮酪蛋白為底物測(cè)酶殘余活性，不含金屬離子的酶活性為100%。

1.7.4 抑制劑、表面活性劑和有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響 將含有酶的緩沖液（最適pH）與5 mmol/L 的PMSF、EDTA、DTT 和尿素混合， 體積分?jǐn)?shù)0.5%的DMSO 和吐溫80，甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑配成體積分?jǐn)?shù)5%的溶液再與反應(yīng)體系混合。 以偶氮酪蛋白為底物測(cè)酶殘余活性，不含添加劑的酶活性為100%。

1.7.5 底物特異性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì) 用偶氮酪蛋白和天然蛋白質(zhì)為底物測(cè)定底物特異性，天然蛋白質(zhì)包括酪蛋白、羽毛粉、紅蟲(chóng)粉、血紅蛋白、絲肽和明膠。 采用1.4 中所述方法測(cè)定酶活性。 用偶氮酪蛋白、 酪蛋白和羽毛粉在最佳條件下研究動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 通過(guò)使用Origin Pro 9.0 來(lái)計(jì)算動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax值，并且通過(guò)計(jì)算公式Kcat=Vmax/[E]獲得kcat（t為60 s）。

1.8 蛋白酶水解羽毛粉分析

為了檢測(cè)羽毛粉的降解效果， 將5 mL 酶液分別與0.2 g 羽毛粉混合，在最佳條件下反應(yīng)6 h。 取2 mL 反應(yīng)產(chǎn)物， 加入相同體積的TCA （體積分?jǐn)?shù)10%） 終止反應(yīng)。 室溫下靜置30 min，8 000 g 離心10 min 得上清液，過(guò)0.22 μm 的濾膜。 通過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定水解產(chǎn)物中的各種氨基酸含量。 同時(shí)為了對(duì)比角蛋白酶降解效果， 對(duì)羽毛粉進(jìn)行酸水解。 具體方法為：配置體積分?jǐn)?shù)35%的硫酸在100 ℃水解羽毛粉6 h，用BaCO3中和除酸，靜置，取適量上清液加入等量TCA 終止反應(yīng)， 過(guò)0.22 μm 的濾膜，用高效液相色譜儀測(cè)定產(chǎn)物中的各種氨基酸含量。 羽毛粉的降解效果用酪氨酸的釋放量來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

根據(jù)B. velezensis SYBC H47 的全基因組信息注釋，共有23 條基因被推定為蛋白酶基因。

為了篩選潛在的角蛋白酶基因， 作者選擇了3種典型的角蛋白酶氨基酸序列作為模板，分別來(lái)自地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌。 根據(jù)它們的保守結(jié)構(gòu)域， 分析出它們都屬于肽酶S8A超家族并且均屬于絲氨酸蛋白酶家族中的枯草桿菌蛋白酶類蛋白酶，這與大多數(shù)屬于絲氨酸蛋白酶類的角蛋白酶是一致的。 因此，將屬于肽酶S8A 超家族的基因1、2、3、4 推測(cè)為編碼角蛋白酶的基因，分別命名為baker1、baker2、baker3、baker4。 對(duì)它們的功能注釋以及理化性質(zhì)分析見(jiàn)表1。 同時(shí)，預(yù)測(cè)了4 種角蛋白酶的氨基酸數(shù)目和信號(hào)肽，baker1和baker2 具有信號(hào)肽， 但baker3 和baker4 沒(méi)有信號(hào)肽。

表1 4 種推測(cè)的角蛋白酶的功能注釋和理化性質(zhì)Table 1 Function annotations and physicochemical properties of the four-putative keratinase

將BaKer1 氨基酸序列在NCBI 網(wǎng)站中進(jìn)行BLAST 分 析， 顯 示BaKer1 （GenBank accession number：MZ147000）與屬于S8 家族肽酶的蛋白酶的同源性最高，是一種絲氨酸蛋白酶。 發(fā)現(xiàn)其與來(lái)源于Bacillus subtilis S1-4 基因組中編碼角蛋白酶BsKER71 的 氨 基 酸 序 列 （GenBank 登 錄 號(hào)：MN256128）有85.6%的相似性，說(shuō)明該基因編碼的氨基酸序列與已知的角蛋白酶序列有著較高的同源性，是一種值得探究的角蛋白酶基因，對(duì)此基因的挖掘?qū)?huì)豐富角蛋白酶基因庫(kù)。 對(duì)BaKer1 與部分相似性高于60%的來(lái)源于芽孢桿菌的角蛋白酶進(jìn)行聚類分析， 可發(fā)現(xiàn)BaKer1 與來(lái)源于枯草芽孢桿菌的角蛋白酶遺傳距離最近，見(jiàn)圖1。

圖1 BaKer1 與部分來(lái)源于芽孢桿菌的角蛋白酶進(jìn)行聚類分析Fig. 1 Cluster analysis of BaKer1 with some reported keratinases from Bacillus

2.2 角蛋白酶的表達(dá)與純化

將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中， 得到重組表達(dá)菌株。 只有含有baker1 基因的重組菌株顯示出角蛋白酶活性，能有效降解羽毛粉。 因此，后續(xù)研究集中在這個(gè)酶上，命名為BaKer1。 值得注意的是，在誘導(dǎo)目的蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)加入分子伴侶pGro7 后，目的蛋白質(zhì)才成功進(jìn)行了表達(dá)，推測(cè)分子伴侶能夠幫助重組酶進(jìn)行成功的折疊與組裝，使其能夠發(fā)揮活性。 在大腸桿菌誘導(dǎo)角蛋白酶中嘗試加入分子伴侶是先前沒(méi)有報(bào)道過(guò)的，此前研究以大腸桿菌為表達(dá)宿主時(shí)，有的酶可以成功表達(dá)，多數(shù)酶易形成包涵體，需復(fù)雜的變性才能進(jìn)行活性研究。 推測(cè)形成包涵體的重組酶在表達(dá)時(shí)不能成功折疊與組裝， 若加入分子伴侶，很可能提供幫助。 重組的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶活性在15 ℃和200 r/min 下培養(yǎng)24 h 可以達(dá)到最高。

BaKer1 的純化過(guò)程見(jiàn)表2。 通過(guò)鎳柱親和層析純化Baker1，純化倍數(shù)為5.91 倍，回收率為12.80%?；蚬こ叹l(fā)酵液粗酶活為（34.59±0.23）U/mL，對(duì)于角蛋白酶工程菌而言并不是很高。 與以大腸桿菌作為表達(dá)宿主的其他角蛋白酶重組菌的粗酶液相比差別不大，如來(lái)源于Bacillus licheniformis BBE11-1的角蛋白酶在E. coli BL21（DE3）中克隆表達(dá)后，其發(fā)酵液粗酶活為47.8 U/mL[39]。但是以大腸桿菌為宿主進(jìn)行角蛋白酶的表達(dá)，其發(fā)酵液粗酶活普遍低于以枯草芽孢桿菌或畢赤酵母為宿主進(jìn)行表達(dá)的重組菌的粗酶活， 推測(cè)這與角蛋白酶作用底物廣泛有關(guān)。重組菌產(chǎn)生的角蛋白酶可能會(huì)對(duì)重組菌產(chǎn)生一定的毒害作用，角蛋白酶表達(dá)量的增加伴隨著重組菌的生長(zhǎng)減緩。 因此，不同的角蛋白酶對(duì)于表達(dá)載體及宿主菌的選擇也不同，可根據(jù)前人研究進(jìn)行選擇并嘗試不同表達(dá)宿主及載體。

表2 BaKer1 的分離純化Table 2 Isolation and purifications of BaKer1

SDS-PAGE 顯示均勻的蛋白質(zhì)條帶，相對(duì)分子質(zhì)量約為28 000， 與推測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量大小不一致， 見(jiàn)圖2。 這是由于基因序列中含有信號(hào)肽和前肽，并且在前肽會(huì)自動(dòng)加工和降解，之后才形成成熟的角蛋白酶。

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of expressed products

2.3 序列比對(duì)

選取部分芽孢桿菌角蛋白酶序列與BaKer1 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，屬于絲氨酸蛋白酶的角蛋白酶在多個(gè)區(qū)域高度保守，保守區(qū)域中分布著三聯(lián)催化體Asp-His-Ser，這對(duì)于角蛋白酶發(fā)揮活性十分重要。 通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)BaKer1 保守序列與S8A 亞家族一致，見(jiàn)圖3。

2.4 pH 和溫度對(duì)角蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響

Baker1 的最適pH 和穩(wěn)定性見(jiàn)圖4。 BaKer1 反應(yīng)最適pH 為9.5，且該酶在pH 6.5~10.5 依然能夠保留60%以上的酶活，這與之前有過(guò)的大部分文獻(xiàn)報(bào)道的角蛋白酶的最適pH 是堿性保持一致。然而，當(dāng)pH>10.5 或者pH<6.5 時(shí)，酶活都會(huì)大幅度降低。

圖4 BaKer1 最適反應(yīng)pH 及pH 穩(wěn)定性Fig. 4 Optimal pH and pH stability of BaKer1

BaKer1 的pH 穩(wěn)定性較好， 能在一定的pH 范圍內(nèi)保留著較高的活性。 實(shí)際上，對(duì)于在堿性環(huán)境中的各種應(yīng)用， 角蛋白酶都表現(xiàn)出極好的應(yīng)用潛力，目前，許多研究人員也都在開(kāi)發(fā)在堿性條件下穩(wěn)定性較好的角蛋白酶。

BaKer1 的最適溫度和熱穩(wěn)定性見(jiàn)圖5。BaKer1最適反應(yīng)溫度為55 ℃；溫度在10~50 ℃時(shí)，BaKer1可以保留80%以上的酶活； 在高于65 ℃的高溫環(huán)境下時(shí)，酶活極低甚至直接失活。 推測(cè)是由于高溫致使角蛋白酶變性，從而不能發(fā)揮作用。 以上結(jié)果表明，BaKer1 為中溫蛋白酶。

圖5 BaKer1 的最適溫度和熱穩(wěn)定性Fig. 5 Optimal temperatures and thermal stability of BaKer1

2.5 不同添加劑對(duì)角蛋白酶活性的影響

以標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)組的酶活作為對(duì)照組，金屬離子對(duì)BaKer1 活性的影響見(jiàn)表3。Ca2+對(duì)BaKer1 的酶活有顯著促進(jìn)作用， 能將酶活增加到原來(lái)的1.45 倍，然而之后隨著Ca2+濃度的增高，Ca2+對(duì)BaKer1 的促進(jìn)作用反而減弱。 由于BaKer1 屬于絲氨酸蛋白酶，這一類蛋白酶能夠被Ca2+顯著激活[31]，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。 原因可能是由于Ca2+的存在使酶分子有穩(wěn)定的活性構(gòu)象，酶活性受到影響[35]。而Mg2+也表現(xiàn)出一定的激活效果，并且隨著濃度的升高，激活作用變強(qiáng)。推測(cè)Mg2+和Ca2+的核外電子排列有相似性，從而Mg2+與弱的Ca2+位點(diǎn)可以結(jié)合。 有關(guān)Mg2+的激活作用原理還需要對(duì)角蛋白酶的結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步研究。

表3 金屬離子對(duì)BaKer1 活性的影響Table 3 Effect of metal ions on the activity of BaKer1

另外，1 mmol/L 的Zn2+、Fe2+、Mn2+都對(duì)BaKer1有輕微促進(jìn)作用，除了Mn2+在5 mmol/L 時(shí)有較明顯抑制作用以外，其他離子隨著濃度的升高其促進(jìn)作用更明顯；Na+、K+、NH4+對(duì)BaKer1 影響不大。

另外，EDTA 顯著抑制BaKer1 的酶活性， 表明金屬離子對(duì)酶活性的重要性， 也解釋了Ca2+對(duì)BaKer1 酶活的影響。 PMSF 也有非常強(qiáng)烈的抑制作用， 而PMSF 與絲氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)的絲氨酸殘基能夠共價(jià)結(jié)合[36]，說(shuō)明BaKer1 是典型的絲氨酸蛋白酶。 DTT 對(duì)BaKer1 抑制作用不強(qiáng)，表明結(jié)構(gòu)中不存在二硫鍵。 除了正己烷以外， 其他有機(jī)溶劑對(duì)BaKer1 均有抑制作用。表面活性劑對(duì)其略有促進(jìn)效果，說(shuō)明BaKer1 在洗滌劑行業(yè)有一定的應(yīng)用價(jià)值，見(jiàn)表4。

表4 抑制劑、表面活性劑和有機(jī)溶劑對(duì)重組酶BaKer1 活性的影響Table 4 Effect of inhibitors, surfactants and organic solvents on the activity of recombinant BaKer1

2.6 Baker1 的底物特異性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)

BaKer1 的底物特異性見(jiàn)表5。BaKer1 對(duì)羽毛粉的水解活力很高，說(shuō)明該酶在羽毛粉再加工利用方面有著極大的潛力。 對(duì)于大多數(shù)天然蛋白質(zhì)底物，BaKer1 對(duì)它們的水解活性相似， 沒(méi)有特別的差異，這也符合角蛋白酶底物廣泛的特性， 說(shuō)明BaKer1在許多天然蛋白質(zhì)的水解中也能發(fā)揮一定的作用。另外，BaKer1 不能水解明膠， 而明膠的主要來(lái)源是膠原蛋白， 說(shuō)明在動(dòng)物的脫毛處理中BaKer1 對(duì)皮革中的膠原蛋白不會(huì)造成損失，有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。

表5 BaKer1 的底物特異性Table 5 Substrate specificity of BaKer1

進(jìn)一步研究了BaKer1 的催化能力， 根據(jù)所測(cè)的底物濃度以及反應(yīng)速率的數(shù)據(jù)，計(jì)算得到了Km和Vmax值，由此也計(jì)算出kcat和kcat/Km。其中，Km值表示了BaKer1 與底物的親和力關(guān)系，而kcat/Km可以說(shuō)明BaKer1 對(duì)底物的整體催化能力。 如表6 所示，BaKer1 分別以羽毛粉、偶氮酪蛋白、酪蛋白為底物時(shí)，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下：Km值分別是5.06、1.09、1.39 mmol/L；kcat/Km值分別為1 058.24、2 536.54、3 733.79 s·mmol/L。

表6 BaKer1 的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 6 Kinetic parameters of BaKer1

2.7 羽毛粉降解產(chǎn)物分析

羽毛粉的降解部分產(chǎn)物見(jiàn)表7。 羽毛粉中游離氨基酸質(zhì)量濃度較低，大部分氨基酸質(zhì)量濃度低于40 μg/mL。 經(jīng)BaKer1 處理后釋放大量氨基酸，其中半胱氨酸釋放量最大，其余幾種氨基酸的釋放量也較高， 說(shuō)明BaKer1 對(duì)提高羽毛粉的營(yíng)養(yǎng)利用價(jià)值有著良好的應(yīng)用前景。 在相同條件下，BaKer1 處理羽毛粉可達(dá)到酸水解效果的33.51%。雖然效果不如酸水解，但是，酶更加綠色環(huán)保，并且反應(yīng)條件溫和，成本廉價(jià)，對(duì)后期產(chǎn)物的再利用也更加安全，說(shuō)明酶處理法對(duì)于羽毛粉的二次綠色加工有著比較高的應(yīng)用價(jià)值[37]。

表7 經(jīng)過(guò)發(fā)酵和未經(jīng)過(guò)發(fā)酵的羽毛粉（FM）中幾種氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 7 Mass fraction of several amino acids in fermented and unfermented feather powder(FM) 單位：mg/g

3 結(jié) 語(yǔ)

對(duì)B.velezensis SYBC H47 基因組中的所有蛋白酶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析和分類，為進(jìn)一步研究蛋白酶的功能提供了理論依據(jù)。 篩選得到1 個(gè)角蛋白酶基因，該基因編碼的氨基酸序列含有絲氨酸催化三聯(lián)體Ser-Asp-His， 通過(guò)分析其屬于絲氨酸蛋白酶S8A 家族。 將該基因與pCold II 質(zhì)粒連接，并加入分子伴侶pGro7， 成功構(gòu)建重組表達(dá)載體并導(dǎo)入宿主細(xì)胞得到表達(dá)。 該酶的最適反應(yīng)pH 為9.5，最適反應(yīng)溫度為55 ℃，在中溫及堿性條件下穩(wěn)定性和耐受性較好。 Ca2+對(duì)BaKer1 有顯著促進(jìn)作用。 EDTA 顯著抑制BaKer1 的酶活性，表明酶活性需要金屬離子。 PMSF 顯著抑制BaKer1 的酶活性，表明它是典型的絲氨酸蛋白酶。 DTT 對(duì)BaKer1 抑制作用不強(qiáng)， 這表明它們的結(jié)構(gòu)中不存在二硫鍵。除正己烷以外， 其他有機(jī)溶劑對(duì)BaKer1 有明顯抑制作用。 分別以羽毛粉、偶氮酪蛋白、酪蛋白為底物研究動(dòng)力學(xué)參數(shù)，BaKer1 的Km值分別是5.06、1.09、1.39 mmol/L，kcat/Km值分別為1 058.24、2 536.54、3 733.79 s·mmol/L。 BaKer1 處理羽毛粉，可釋放大量氨基酸，其中半胱氨酸釋放量最大。 BaKer1 處理羽毛粉效果達(dá)到酸水解的33.51%。雖然效果不如酸水解，但更加綠色環(huán)保，并且反應(yīng)條件溫和，成本廉價(jià)， 后期產(chǎn)物安全， 有利于產(chǎn)物的再利用， 說(shuō)明BaKer1 對(duì)于羽毛粉的二次綠色加工提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有良好的應(yīng)用前景。