匡曉琴 郭風(fēng)繁 李卿

(湘南學(xué)院附屬醫(yī)院,湖南 郴州 423000)

萎縮性胃炎主要表現(xiàn)為胃黏膜變薄,上皮和腺體萎縮、腹痛、食欲不振、貧血等。幽門螺桿菌(Hp)是萎縮性胃炎最主要的病因,其他原因還包括膽汁反流、長期服用非甾體類抗炎藥等藥物和酒精攝入,一些少見原因還包括自身免疫機制、遺傳因素等。常見誘發(fā)因素有焦慮、抑郁等情緒障礙,各種負(fù)性社會經(jīng)歷、職業(yè)及勞動強度均會對萎縮性胃炎發(fā)病產(chǎn)生影響。其典型癥狀主要表現(xiàn)為非特異性消化不良癥狀,如上腹痛、腹脹、餐后飽脹及早飽感,進(jìn)食可加重或減輕,伴隨癥狀可能出現(xiàn)面色蒼白、頭暈、乏力等表現(xiàn),這是胃黏膜有明顯糜爛時,胃黏膜長期少量出血引起缺鐵性貧血所致,可能出現(xiàn)疲軟、舌炎、輕微黃疸、肢體麻木等情況,這是自身免疫性胃炎患者由于維生素B12吸收不良,導(dǎo)致的惡性貧血及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀〔1〕。人參主要成分為人參總皂苷,具有抑制炎癥反應(yīng),保護神經(jīng)等作用,但其對萎縮性胃炎相關(guān)文獻(xiàn)較少,具體作用尚不明確〔2〕。免疫功能紊亂會引起體內(nèi)炎癥增加,免疫球蛋白(Ig)A、IgG、IgM是免疫功能指標(biāo),其水平下降表明免疫功能降低〔3〕。當(dāng)胃黏膜組織糜爛,難以修復(fù)時成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)表達(dá)升高〔4〕。本研究探討人參總皂苷對萎縮性胃炎大鼠免疫球蛋白及bFGF蛋白的影響。

1 材料和方法

1.1動物與試劑 選取健康A(chǔ)CL雄性大鼠50只,2～4月齡,體質(zhì)量210～225 g,平均(213.25±12.37)g,購自億鳴復(fù)興(北京)公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)-2019-0001,7 d后開始實驗,大鼠常規(guī)飼養(yǎng),室溫23.3～27.2 ℃,相對濕度51%～62%,保持12 h光照,正常飲食飲水。試劑:人參總皂苷(西安匯林公司),替普瑞酮(中國衛(wèi)林藥業(yè)公司),脫氧膽酸鈉溶液(北京百奧萊博公司),免疫球蛋白試劑盒(上海酶聯(lián)公司),戊巴比妥鈉(湖北鴻運隆公司),bFGF、腫瘤壞死因子(TNF)-α一抗(深圳子科公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(河北翰林公司)。

1.2建模分組及給藥 取38只大鼠參考相關(guān)文獻(xiàn)〔5〕建立萎縮性胃炎模型,首先給予大鼠1.5 ml/d脫氧膽酸鈉灌胃(0.2%),1次/5 h,再50 ℃ 2 ml熱鹽水灌胃,運用48 h足量飼養(yǎng),24 h停飼養(yǎng)的方式,隨機剖殺并檢測大鼠病理形態(tài),確認(rèn)建模成功,持續(xù)造模8 w后,死亡2只,剩余36只建模成功。模型鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(2002)中慢性萎縮性胃炎(CAG)的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)〔6〕。12只健康大鼠為健康組,其余36只隨機分為胃炎組、對照組、人參組,健康組與胃炎組無處理,人參組灌胃10 mg/kg人參總皂苷,對照組給予50 mg/kg替普瑞酮灌胃,共干預(yù)8 w。

1.3蘇木素-伊紅(HE)染色檢測各組胃黏膜組織形態(tài) 取各組大鼠,戊巴比妥鈉麻醉后處死,取胃黏膜組織,置于4%甲醛緩沖液中固定,石蠟切片,脫蠟,乙醇水合處理,洗滌后進(jìn)行染色,光鏡下觀察。

1.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組IgG、IgA、IgM水平 取各組頸部動脈血2 ml,離心5 min,1 250 r/min,取上清,采用ELISA檢測各組血清中IgG、IgA、IgM水平。

1.5免疫組化檢測轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1水平 取各組胃黏膜組織剪切成小塊,脫水、包埋后,采用甲醛固定,水化后,37.5 ℃靜置后0.5 h后,加入1%的乙二胺四乙酸(EDTA)液,山羊血清封閉。加入1抗(1∶500),加入TGF-β1抗體,加入二抗0.5 h后,復(fù)染,封皮。選擇不交叉的10個視野,以淡黃色至棕褐色,為陽性,計算陽性率。

1.6逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測重組人音猬因子(Shh)、重組人Patched蛋白(Ptch)、鋅指蛋白(Gli)-1水平 取各組胃黏膜組織,裂解液裂解,胰酶消化后將細(xì)胞懸液放于試管中。Trizol提取總RNA(嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行),,將RNA沉淀于0.1%焦碳酸二酯(DEPC)處理水中,紫外線分光光度計測定濃度。38 ℃恒溫1 h進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后,將cDNA進(jìn)行熒光反應(yīng)實驗。再將此設(shè)為模板,利用特異性引物合成 PCR產(chǎn)物。引物序列:Shh正向:5′-CTCGTCCTACGCAGTCATCG-3′,反向:5′-CCTCGCTTCCGCTACAGATT-3′;Ptch正向:5′-TCTCACAACTCTCGCAATC-3′,反向:5′-ACCTCCACCTTCGCGTCCCT-3′;Gli-1正向:5′-TTCTTCTGCTGACACTCTGGGATA-3′,反向:5′-CCTCAAGTCGACGACACTGCTTA-3′;GAPDH正向:5′-TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3′,反向:5′-TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3′。以內(nèi)參為GAPDH,反應(yīng)條件:3 min 95 ℃,變性30 s 95 ℃;40 s 62 ℃進(jìn)行40次。5 μl PCR產(chǎn)物作2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,光密度呈現(xiàn)分析結(jié)果。計算方法用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.7Western印跡檢測bFGF、TNF-α水平 取各組細(xì)胞,胰酶消化,離心,取上清液。用上樣緩沖液混合于磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋蛋白樣品中,按照4∶1的比例進(jìn)行,于沸水中煮沸5 min,二喹啉甲酸(BCA)測總蛋白濃度,每孔上樣蛋白量20 μg,電泳。轉(zhuǎn)印緩沖液配制好后于4 ℃冰箱內(nèi)預(yù)冷,后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入脫脂奶粉封閉1 h,TTBS 洗3次,10 min/次;4 ℃過夜,加入1抗(稀釋比例1∶500)后PBS漂洗3次,每次間隔10 min,加入辣根根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(稀釋比例1∶2 500),37 ℃孵育45 min,TTBS漂洗10 min×3次,用博士德生產(chǎn)的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒,在1 ml水中加A、B、C液各一滴,再加于膜上,電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑后凝膠成像系統(tǒng)(JY-Clear)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組胃黏膜組織病理形態(tài)結(jié)果 與健康組相比,胃炎組黏膜產(chǎn)生不同程度萎縮并變薄,固有層腺體減少,排列雜亂無章,有炎性細(xì)胞浸潤。與胃炎組相比,人參組和對照組黏膜腺體數(shù)量減少,排列較為有序,炎性細(xì)胞浸潤減少,以人參組效果最佳。見圖1。

圖1 各組胃黏膜組織病理形態(tài)(HE染色,×400)

2.2各組血清中IgG、IgA、IgM水平檢測 健康組血清中IgG、IgA、IgM表達(dá)顯著較胃炎組高(P<0.05);胃炎組血清中IgG、IgA、IgM表達(dá)顯著較人參組、對照組低(P<0.05);人參組血清中IgG、IgA、IgM表達(dá)顯著較對照組高(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清中IgG、IgA、IgM及Shh、Ptch、Gli-1 mRNA水平和bFGF、TNF-α蛋白表達(dá)對比

2.3各組胃黏膜組織中Shh、Ptch、Gli-1 mRNA水平 健康組胃黏膜組織Shh、Ptch、Gli-1 mRNA水平顯著高于胃炎組(P<0.05);胃炎組胃黏膜組織Shh、Ptch、Gli-1 mRNA水平顯著低于人參組及對照組(P<0.05);人參組與對照組Shh、Ptch、Gli-1 mRNA水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

2.4各組胃黏膜組織中bFGF、TNF-α蛋白水平 健康組胃黏膜組織中bFGF、TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著較胃炎組低(P<0.05);胃炎組胃黏膜組織中bFGF、TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著高于人參組與對照組(P<0.05);人參組bFGF、TNF-α表達(dá)顯著較對照組低(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組胃黏膜組織中bFGF、TNF-α蛋白表達(dá)

2.5各組TGF-β1陽性表達(dá)檢測 健康組胃黏膜組織中TGF-β1陽性率(9.56%)明顯低于胃炎組(82.11%;χ2=106.00,P<0.05)。胃炎組胃黏膜組織中TGF-β1陽性率明顯高于對照組(35.27%;χ2=45.25,P<0.05)。人參組TGF-β1陽性率(30.24%)與對照組無顯著差異(χ2=0.57,P=0.45)。見圖3。

圖3 各組TGF-β 1陽性表達(dá)(免疫組化,×200)

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為萎縮性胃炎屬于“痞滿”,其位于心下即胃脘處時為胃痞。其中痞代表氣隔不通,表現(xiàn)為心下感覺痞滿,胸膈脹滿,按之柔軟且壓之無痛。當(dāng)多種因素?fù)p傷脾胃后,將造成水谷運化失調(diào),周身失于濡養(yǎng),以致病發(fā)〔7,8〕。萎縮性胃炎產(chǎn)生時機體的炎癥增加且免疫功能下降。免疫功能是機體的一種生理保護功能,可識別機體異物,將其排除或消滅,使機體生理保持平衡。機體受抗原刺激后會產(chǎn)生免疫球蛋白,生成復(fù)合體后可組織病原體對機體的損害。免疫球蛋白定位于血液、組織液、分泌液中,是機體的重要防御。人參皂苷是一類固醇類化合物,又稱三萜皂苷,可促進(jìn)免疫細(xì)胞再生,提高免疫細(xì)胞活性,增強免疫能力。喻媛媛等〔9〕對慢性萎縮性胃炎患者的實驗中提出,IgA、IgG、IgM水平在胃炎患者體內(nèi)為低表達(dá),在經(jīng)過藥物治療后水平升高,免疫功能提高。楊逸等〔10〕對肝臟進(jìn)行的實驗中提出,人參皂苷可提高的免疫功能,從而起到肝保護的作用。本研究與上述醫(yī)學(xué)者研究結(jié)果相似。

刺猬基因(Hh)信號通路具有維持胃黏膜正常結(jié)構(gòu)、功能等作用,可調(diào)控胃干細(xì)胞、表面黏液細(xì)胞等細(xì)胞的生物學(xué)活性,該通路由Hh信號肽〔Shh,重組人印度刺猬因子(Ihh),人沙漠刺猬因子(Dhh)〕、跨膜受體〔Ptch,人重組蛋白(Smo)〕和下游轉(zhuǎn)錄因子(Gli)〔11〕構(gòu)成。在萎縮性胃炎中Shh表達(dá)降低,降低程度與疾病程度相關(guān)。其具體機制可能是胃黏膜萎縮使分泌Shh細(xì)胞減少,研究表明〔12〕,在Hp感染中,炎性因子通過減少壁細(xì)胞的酸分泌,使Shh表達(dá)受到抑制。低表達(dá)的Shh進(jìn)一步促進(jìn)壁細(xì)胞萎縮、產(chǎn)酶細(xì)胞減少,胃蛋白酶表達(dá)降低,胃萎縮加重?，F(xiàn)代藥理學(xué)提示〔13〕,人參總皂苷在體內(nèi)可起到促進(jìn)免疫應(yīng)答的作用,具有一定的抗腫瘤活性。趙唯含等〔14〕提出,Shh、Ptch、Gli-1在經(jīng)過黃芪與人參皂苷的干預(yù)后水平升高,免疫能力增加。本研究與上述研究結(jié)果相似。bFGF多存在于內(nèi)皮組織,可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化,在體內(nèi)、外均可促進(jìn)血管新生。既往研究證實bFGF在維護消化道黏膜完整性及修復(fù)黏膜損傷中可調(diào)節(jié)炎癥進(jìn)程、肉芽組織及上皮細(xì)胞的修復(fù)有顯著促進(jìn)作用,但如果刺激因素長期存在,導(dǎo)致黏膜糜爛難以修復(fù)或反復(fù)發(fā)作,這使機體內(nèi)bFGF不斷高表達(dá),不斷誘導(dǎo)黏膜組織增殖分化,過度增殖正是癌癥形成的基礎(chǔ)〔15〕。TGF-β1通過與其受體結(jié)合可調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為,并對機體免疫、血管新生具有一定的作用。腫瘤細(xì)胞分泌的TGF-β1可促進(jìn)初始T細(xì)胞向具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化,通過抑制宿主免疫系統(tǒng),使腫瘤逃避機體的免疫監(jiān)視,從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移。相關(guān)實驗提出,TGF-β1水平在萎縮性胃炎中的水平高于正常胃黏膜組織,同時機體免疫功能降低,炎癥反應(yīng)增加〔16〕。TNF-α可參與免疫細(xì)胞活化炎癥反應(yīng),具有抗感染等作用,大量TNF-α?xí)寡芡ㄍ感栽黾?導(dǎo)致微血管內(nèi)凝血產(chǎn)生,致使炎性介質(zhì)釋放,造成黏膜損傷〔17〕,可能是萎縮性胃炎炎癥形成初始階段重要的細(xì)胞因子。三七中的主要有效成分是人參皂苷Rg1,具有抗炎、提高免疫功能的作用。劉懷智等〔18〕提出,TGF-β1、TNF-α為正相關(guān)關(guān)系,在該病中為高表達(dá),經(jīng)過藥物干預(yù)后水平有所下降。楊靜等〔19〕對在對萎縮性胃炎患者進(jìn)行的實驗研究中提出,bFGF在萎縮性胃炎患者體內(nèi)為高表達(dá),在經(jīng)過藥物干預(yù)后水平下降,胃炎得到一定的治療。聞麗芬等〔20〕提出,人參總皂苷可通過抑制bFGF水平等促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增加。本研究結(jié)果與上述醫(yī)學(xué)者研究結(jié)果相似。

綜上,人參總皂苷通過提高IgG、IgA、IgM水平提高胃炎大鼠的免疫功能,通過降低bFGF表達(dá),抑制了TGF-β1、TNF-α表達(dá)促進(jìn)Hedgehog信號通路水平,減少了炎癥反應(yīng),改善病情嚴(yán)重程度,其作用機制可能與抑制bFGF表達(dá)有關(guān)。