魯俊,林芃宏,寧燕,徐永健

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院, 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室, 浙江 寧波 315832)

隨著人類活動加劇,重金屬、持久性有機污染物(Persistent organic pollutants, POPs)和塑料制品等對水環(huán)境造成的問題日益突出[1]。有害物質(zhì)在水生生物體中的積累不僅會對生物本身和水生環(huán)境造成潛在的負面影響,而且會通過食物鏈對人類的健康構(gòu)成威脅[2]。

重金屬作為常見的環(huán)境污染物,可以直接或間接損害水域生態(tài)系統(tǒng),還容易通過食物鏈富集[3-4]。苯并芘(B[a]P)具有高毒性,是持久性有機污染物的典型代表[5]。其可以通過鰓、皮膚和消化道等進入魚體,對魚類造成傷害[5]。隨后,這些污染物積聚在水產(chǎn)品中,通過食物鏈進入人體,對人類健康造成威脅。目前,水產(chǎn)品的食用安全問題已引起廣泛關(guān)注[6-8]。研究表明,重金屬和有機污染物主要附著在塑料顆粒表面,經(jīng)水生生物同化后進入食物鏈[9-11]。此外,微塑料也可以通過食物鏈進行轉(zhuǎn)移[10],其本身也會對水生生物造成物理和化學(xué)危害[11]。因此,隨著微塑料顆粒在水環(huán)境中的積累量日益增加,水產(chǎn)品的食用風險也在不斷升高[12]。

海馬(Hippocampus)是一種小型硬骨魚類,在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中有很重要的地位,在中國有上千年的使用歷史,經(jīng)泡酒、藥膳和配伍等食用海馬[13]。當代醫(yī)藥技術(shù)發(fā)展后,海馬的藥用價值被充分開發(fā),全球海馬年消費量在5 000萬尾以上,產(chǎn)值近300億[14]。市場要求對海馬的來源及其質(zhì)量有明確的保證[15-16]?！吨腥A人民共和國藥典》共載錄了5種海馬[17],目前在中國沿海常見的有3種。其中,日本海馬(Hippocampusjaponicus)主要分布于中國渤海和黃海;三斑海馬(H.trimaculatus)主要分布于中國東海和南海;大海馬(H.kuda)主要分布于中國黃海南部、東海和南海。海馬生活的淺海區(qū)域,是人類活動頻繁且易造成污染物積聚的場所。因此,分析野生海馬中環(huán)境污染物的積累和殘留,不僅可促進海馬資源的有效開發(fā)與利用,還能開展海馬野生資源的保護。本研究同時還調(diào)查了野生海馬中微塑料的積蓄情況,并分析了微塑料與海馬中的環(huán)境污染物積累之間的關(guān)系,綜合反映了中國海馬產(chǎn)品的食用安全性。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

2017—2019年在中國沿海各地采集了上述3種海馬。其中,日本海馬采自山東東營和威海及河北秦皇島沿海,各抽取8～10尾作為測試樣本;三斑海馬采自海南陵水、廣西北海及福建東山,各采集6～8尾樣本;大海馬采自海南陵水、廣東南澳和浙江象山,各采集10尾樣本。所有海馬樣本先用純凈水清洗干凈體表后裝入聚乙烯密封袋中,加干冰,迅速運回實驗室。記錄每尾海馬的體長和體重后,儲存在-80 ℃冰箱中備用。各組海馬樣本的形態(tài)參數(shù)見表1。

表1 不同地區(qū)海馬樣本的體重與體長參數(shù)Tab.1 Body weights and body lengths of 3 wild seahorses from different sampling areas

1.2 儀器與試劑

MQP40超微粉碎機(山東埃爾派集團),FD-1A-50冷凍干燥機(北京博醫(yī)康集團),PE NexION 300X ICP電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國PerkinElmer公司),Lab750超聲波提取儀(法國SinapTec公司),KH19A高速離心機(湖南凱達科儀),Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司),Hei-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司),HH-M6恒溫水浴鍋(江蘇春蘭科儀),BX-53M光學(xué)顯微鏡(德國Olympus公司)。正己烷(色譜純,上海國藥),乙腈(色譜純,上海國藥),混合纖維素脂微孔濾膜(0.22 μm水系膜,上海興亞純化材料廠),纖維濾膜過濾(1 μm有機膜,上海興亞凈化材料廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 重金屬的測定

根據(jù)GB 5009.268—2016《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》[18]中的預(yù)處理和測定方法,海馬樣本中銅(Cu)、鎘(Cd)、鉛(Pb)、汞(Hg)和鉻(Cr)的含量采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測定。每個樣本重復(fù)測定3次。

1.3.2 苯并芘的測定

海馬中的苯并芘含量根據(jù)GB 5009.27—2016《食品安全國家標準 食品中苯并(a)芘的測定》[19],采用高效液相色譜法(HPLC)測定。將各海馬樣本冷凍干燥并超微粉碎,取2.0 g海馬粉,加入10 mL正己烷。渦旋混合0.5 min后,于40 ℃下超聲提取10 min?；鞈乙航?jīng)7 000 r/min離心5 min,吸取上清液,剩余部分再加入10 mL正己烷進行第2次萃取。合并2次上清液,40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。然后加入1 mL乙腈,渦旋混合0.5 min將濃縮物復(fù)溶。溶液經(jīng)0.22 μm混合纖維素脂微孔濾膜過濾后,上Agilent 1260高效液相色譜儀測定,進樣量為5 μL。每個樣本重復(fù)測定3次。

1.3.3 腸道微塑料含量分析

參照Lusher等[20]方法,將完整的海馬腸道放入干燥潔凈試管中,加入10% KOH溶液(約10倍腸體積),放在40 ℃水浴中消化72 h。將消化后的溶液轉(zhuǎn)移到離心管中,添加飽和NaCl溶液至離心管3/4體積處,充分混合?；旌先芤航?jīng)7 000 r/min離心10 min。重復(fù)提取3次。將所有收集的溶液混合后通過1 μm纖維濾膜過濾,微塑料顆粒滯留在濾膜上。將濾膜置于光學(xué)顯微鏡下,以×100放大倍率,觀察并計數(shù)濾膜上微塑料顆粒的形狀和數(shù)量。

1.4 污染物標準限值

根據(jù)GB 2762—2022《食品安全國家標準 食品中污染物限量》[21]和ISO 18664:2015《中醫(yī)藥—中草藥重金屬限量》[22],野生海馬中重金屬和苯并芘的標準限量值見表2。

表2 食品和中藥材中重金屬和苯并芘的標準限量值Tab.2 Standard limit values for heavy metals and benzopyrene in food and traditional Chinese medicines

1.5 評價方法

1.5.1 質(zhì)量評價方法

本研究分別采用單項污染指數(shù)(Single pollution index,Pi)法和綜合污染指數(shù)(Comprehensive pollution index,Ps)法評價野生海馬中的苯并芘與幾種重金屬的積累和污染狀況,用于比較各樣本中重金屬污染水平的差異[23-25]。

單項污染指數(shù)計算公式為:

Pi=Ci/Si

式(1)

式中:Pi為污染物i的污染指數(shù),Ci為污染物i的實測值,Si為污染物i的標準限值。Pi≤1表示沒有受到污染物i的污染;Pi>1表示被污染物i污染。

綜合污染指數(shù)計算公式為:

式(2)

式中:Ps為綜合污染指數(shù),Pave為所有Pi的平均值,Pmax為所有Pi的最大值。Ps<0.7表示重金屬污染處于安全水平,0.73.0處于嚴重污染狀態(tài)。

1.5.2 風險評價方法

采用美國環(huán)境保護署(USEPA)提出的健康風險評估模型中的目標危害指數(shù)(Target hazard quotient, THQ)來評估通過食用野生海馬攝入重金屬的安全風險[26-28]。THQ的公式為:

式(3)

其中,EF為人群暴露頻率(d/年),根據(jù)USPEA的標準限值,EF取值為365 d/年;ED為暴露年數(shù)(年),根據(jù)USPEA的標準限值,ED設(shè)定為70年;IR為平均每日消費量,根據(jù)《中國人群暴露參數(shù)手冊》(2014版)推薦數(shù)值為5×10-3kg[29];C為野生海馬體中實測的重金屬殘留物濃度(mg/kg);RfD為口服參考劑量[mg/(kg·d)],根據(jù)USPEA的標準限值,Cu、Cd、Pb、Cr和Hg分別為0.04、0.001、0.004、0.003和0.000 5 [mg/(kg·d)];BW為人均體重(kg),根據(jù)USPEA的標準限值,以65 kg計;AT為非致癌性暴露平均時間(d),取ED×365 d/年。當THQ<1時,無攝入安全隱患;THQ≥1,有攝入安全的健康風險。THQ值越大,安全風險越高[30-32]。

此外,重金屬對人體健康的影響通常是多種元素的共同結(jié)果。本研究同時還計算了總目標風險系數(shù)(Total target hazard quotients,TTHQ),以表征多種重金屬的共同影響水平。公式為:

TTHQ=THQ1+THQ2+...+THQn

式(4)

式中,TTHQ等于每種重金屬的THQ之和。

根據(jù)USPEA中的SV值(Screening value),分析了苯并芘在野生海馬中的食用安全風險。SV值表征為可食用生物組織內(nèi)污染物的上限值[33],計算公式為:

SV=[(RL/SF)×BW]/CR

式(5)

其中,SV是可接受攝入量的上限(μg/g);RL是可接受的最大風險水平,為10-5;SF是斜率因子,苯并芘的SF為7.3 μg/(g·d)[33];BW是成年男子的體重,根據(jù)USPEA的標準限值,以70 kg計,CR是平均每日消費量,根據(jù)USPEA的標準限值,為5 g/d。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 野生海馬中的污染物含量

2.1.1 重金屬含量

分布于中國近海的3種不同的野生海馬中均檢測到了5種重金屬,結(jié)果見表3。從結(jié)果看,3種海馬中的5種重金屬的積累存在明顯的種間差異和產(chǎn)地差異。

表3 3種野生海馬中的重金屬含量Tab.3 Heavy metal contents in the 3 wild seahorses (mg·kg-1)

如表3所示,同種海馬隨著采樣地點不同,其重金屬含量也存在顯著差異(P<0.05)。來自河北秦皇島的日本海馬中的Cu、Pb和Cd濃度較低,但Hg含量卻高于來自山東東營和威海的日本海馬;而來自威海的日本海馬中的Cu、Pb、Cd和Cr含量數(shù)倍至數(shù)百倍高于其他2個來源的日本海馬。3個不同來源的三斑海馬中的Hg含量相近,但來自福建東山的三斑海馬中的Cu含量最高,而來自廣西北海的三斑海馬中的Cd含量較高,Cr含量卻低。來自浙江象山的大海馬中的Cu、Pb、Cd、Cr和Hg含量均是最高的,反應(yīng)了該產(chǎn)地是3個來源中受污程度最高的。海南陵水的大海馬中的Cu、Cd和Cr含量最低,而廣東南澳的大海馬中的Pb、Hg含量最低。

與表2中重金屬的標準限量值相比,表3中所有野生海馬樣本中的Cu和Hg含量均未超過限量值;Pb超標比例較高,除了威海的日本海馬中的Pb含量嚴重超過限量值(約38.5倍)外,還有東營的日本海馬、陵水的三斑海馬以及陵水和象山的大海馬中的Pb也略微超標。野生海馬中Cd和Cr的超標現(xiàn)象也較為嚴重,Cd超標的有:東營和威海的日本海馬及北海的三斑海馬都超標了十幾至數(shù)十倍,而大海馬中完全沒有Cd超標的現(xiàn)象;Cr超標的有:秦皇島和威海的日本海馬、陵水和東山的三斑海馬以及象山的大海馬,尤其是威海的日本海馬中Cr含量超標接近31倍。

2.1.2 苯并芘含量

在所有海馬樣本中也都檢測到了苯并芘的存在,各樣本中的含量見圖1。從圖中看,所有野生海馬體內(nèi)苯并芘的積蓄量隨著海馬品種和采樣地點的不同而變化很大,積蓄值為1.478～8.170 μg/kg,平均值為4.271 μg/kg。

圖1 各野生海馬中苯并芘含量的比較注:1、2、3分別為東營、秦皇島和威海的日本海馬;4、5、6分別為東山、北海和陵水的三斑海馬;7、8、9分別為陵水、南澳和象山的大海馬。Fig.1 Comparison of benzopyrene content in the wild seahorses Note: Samples No. 1, 2 and 3 were H. japonicus sampled from Dongying, Qinhuangdao and Weihai, respectively; No. 4, 5, and 6 were H. trimaculatus from Dongshan, Beihai, and Lingshui, respectively;No. 7, 8 and 9 were H. kuda from Lingshui, Nan’ao, and Xiangshan, respectively.

其中,三斑海馬中的平均苯并芘含量最高,高于日本海馬(P<0.05),遠高于大海馬(P<0.05)。這與產(chǎn)地無關(guān)。來自海南陵水的三斑海馬體內(nèi)的苯并芘含量要遠高于該地大海馬中的積蓄量(P<0.05)。然而,同一品種海馬中的苯并芘積蓄量卻與產(chǎn)地有關(guān),因不同來源而有所不同,來自威海的日本海馬中的苯并芘積蓄量要高于秦皇島和東營的日本海馬中的積蓄量,且存在顯著性差異(P<0.05);來自陵水的三斑海馬中也存在類似的結(jié)果,其體內(nèi)苯并芘的積蓄量明顯高于北海和東山的三斑海馬(P<0.05)。

與表2中苯并芘的標準限量值相比較,在所有分析的野生海馬樣本中,僅3個樣本中的苯并芘含量超過標準限量值,分別為威海的日本海馬以及北海和陵水的三斑海馬,苯并芘含量分別為5.543、5.546和8.170 μg/kg。超限率為野生海馬總樣本量的1/3。特別指出的是,所有大海馬樣本中苯并芘含量均未超過限量值(圖1)。

2.1.3 野生海馬腸道中微塑料顆粒的含量

在所有的野生海馬樣本的腸道中均檢測到微塑料顆粒的存在,分布密度情況如圖2。從圖中看,本批次海馬樣本腸道中微塑料顆粒積累的數(shù)量為92～322粒/尾,微塑料顆粒在腸道中分布的密度為12.2～41.8粒/cm(平均腸道長度為7.54 cm)。其中,除來自福建東山的三斑海馬外,其余所有日本海馬樣本和三斑海馬樣本中的微塑料顆粒的數(shù)量均大于大海馬(P<0.05)。經(jīng)分析,微塑料的積累趨勢也與海馬種類及產(chǎn)地有關(guān)系,來自陵水的三斑海馬中的微塑料積蓄量和密度都比同樣來自陵水的大海馬高出約3倍;而威海的日本海馬中的微塑料積蓄密度要遠高于來自秦皇島和東營的日本海馬(P<0.05),陵水的三斑海馬中的積蓄密度也遠高于來自北海的三斑海馬(P<0.05),且兩者均高于東山的三班海馬(P<0.05);象山的大海馬中的微塑料含量也略高于來自陵水的大海馬?？傮w而言,威海、陵水、北海和東營等產(chǎn)地的海馬腸道中的微塑料顆粒密度相對較高。同時本研究發(fā)現(xiàn),所采集區(qū)域的海水及產(chǎn)自該區(qū)域的其他水產(chǎn)品中的重金屬和苯并芘的含量也超過標準限量值[6,7,34],因此考慮重金屬和苯并芘的超標可能與微塑料的攝入有關(guān)。

圖2 各野生海馬中微塑料的積累數(shù)量比較注:1、2、3分別為東營、秦皇島和威海的日本海馬;4, 5, 6分別為東山、北海和陵水的三斑海馬;7, 8, 9分別為陵水、南澳和象山的大海馬。Fig.2 Comparison of microplastics quantity in the wild seahorses Note: Samples No. 1, 2 and 3 were H. japonicus sampled from Dongying, Qinhuangdao and Weihai, respectively; No. 4, 5, and 6 were H. trimaculatus from Dongshan, Beihai, and Lingshui, respectively;No. 7, 8 and 9 were H. kuda from Lingshui, Nan’ao, and Xiangshan, respectively.

2.2 野生海馬中污染物的積累水平評估

2.2.1 重金屬評估

根據(jù)公式,野生海馬各個樣本中的重金屬的單項污染指數(shù)(Pi)和綜合污染指數(shù)(Ps)的計算結(jié)果見表4。

通過分析Pi值可以看出:中國野生海馬樣本主要受到了Pb、Cd和Cr 等3種重金屬的污染。各約有一半的海馬樣本分別遭受一種重金屬污染,有4個海馬樣本同時受到2種重金屬污染,有1個海馬樣本(威海日本海馬)受到3種重金屬污染,只有1個海馬樣本(南澳大海馬)未發(fā)現(xiàn)有重金屬污染,而所有的海馬樣本均未受到Cu和Hg的污染(表4)。此外,根據(jù)Pi值顯示,在3種野生海馬中,受Pb污染程度相近;而日本海馬、三斑海馬受Cd和Cr污染較大海馬要更為嚴重。重金屬的污染也與采樣點有關(guān),如來自威海的日本海馬中Pb、Cd和Cr的Pi值分別為38.50、29.287和30.922。這可能與威海沿海海水嚴重被污染有關(guān),該區(qū)域捕獲的其他水產(chǎn)品也遭受到Pb、Cd和Cr等重金屬的污染[34]。根據(jù)Pi的平均值,野生海馬樣本中遭受5種重金屬的污染水平按序排列為Cd >Pb >Cr >Cu >Hg。上述分析結(jié)果表明,中國野生海馬中Pb、Cr和Cd的Pi值相對較高,這可能與沿海水環(huán)境中Pb、Cr和Cd的嚴重污染有關(guān)[23,34],也可能是野生海馬的一個特性,易于積蓄Pb、Cr和Cd而不易積蓄Cu和Hg。

從綜合污染指數(shù)Ps看,在所有分析的海馬樣本中,只有1個樣本(南澳大海馬)處于重金屬污染的安全等級,1個(秦皇島日本海馬)處于警戒狀態(tài),4個為輕度污染,剩余的3個為重度污染。這3個重度污染的海馬樣本包括山東東營和威海的日本海馬以及廣西北海的三斑海馬,他們的Ps值都在6以上,分別為6.027、21.687和9.676。尤其是來自威海的日本海馬中的5種重金屬的綜合污染指數(shù)值超過20,表明其遭受了重金屬的嚴重綜合污染[35](表4)。

表4 各野生海馬的單項污染指數(shù)Pi和綜合污染指數(shù)Ps分析結(jié)果Tab.4 Results of single (Pi) and comprehensive (Ps) pollution indexes in wild seahorses

2.2.2 苯并芘評估

根據(jù)重金屬的Pi指數(shù)計算公式和評價標準,得到了各野生海馬樣本中苯并芘的污染結(jié)果(表4)。整體上看,除威海的日本海馬以及陵水和北海的三斑海馬受到苯并芘的輕微污染外(Pi>1),其他的野生海馬樣本均未受到苯并芘的污染。從海馬種類看,所有大海馬樣本均未受到污染,而日本海馬和三斑海馬的樣本都有部分受到了污染。其中,三斑海馬樣本受苯并芘污染更嚴重一些,3個樣本中有2個遭受污染(表4)。

2.3 野生海馬食用安全風險評估

2.3.1 重金屬評估

利用目標風險系數(shù)法(THQ)對各野生海馬暴露于5種重金屬的食用安全風險作了評估,所得結(jié)果見表5。除來自威海的日本海馬中Cr的THQ值(1.717 9)較高外,其余的海馬樣本中的單個重金屬的THQ值都<1.0,表明食用海馬不會存在受單一重金屬暴露的健康風險。在所有分析的海馬樣本中,根據(jù)THQs結(jié)果,單一重金屬對食用人群人體健康的危害程度排序為Cr> Cd> Pb>Hg>Cu(表5)。

從表5中的TTHQs看,也是來自威海的日本海馬的TTHQs值最高,為3.329 6,遠高于臨界值1.0。表明長期食用來自威海的日本海馬具有潛在的重金屬食用安全風險。其他來源的海馬的TTHQs均低于1.0,表明無潛在食用安全風險[35]。

2.3.2 苯并芘評估

本研究還采用SV值來評價野生海馬中苯并芘積累對人類食用致癌的安全風險。當致癌率低于10-5(SV<10-5)時,食用安全風險被認為是可以接受的[33, 36]。通過計算,得出野生海馬樣本中苯并芘的SV值為0.47 μg/g,該值為海馬體內(nèi)苯并芘積累的上限臨界濃度[33]。從表1中看,本研究所分析的所有野生海馬樣本中苯并芘的含量都要低于該臨界值。根據(jù)表1中各野生海馬樣本中苯并芘的實測含量值,計算其對應(yīng)的SV值,結(jié)果見表6。

從表6中看,所有的計算結(jié)果都遠小于10-5,表明中國沿海各野生海馬樣本中苯并芘的積累濃度而導(dǎo)致食用致癌風險是可以接受的[33]。但也應(yīng)引起注意,其中威海的日本海馬、北海和陵水的三斑海馬中的苯并芘含量均超過水產(chǎn)品標準限值(圖1)。

表5 各野生海馬中重金屬積累的目標危險系數(shù)比較Tab.5 Target hazard quotient of heavy metals in the wild seahorses

表6 各野生海馬中苯并芘的安全風險評估結(jié)果(閾值為10-5)Tab.6 Safety risk assessment of benzopyrene in wild seahorses in China (The critical value is 10-5)

2.4 重金屬、苯并芘和微塑料之間的相關(guān)性分析

本研究還對3種野生海馬樣本中的微塑料密度、重金屬和苯并芘含量間的相關(guān)性進行了分析,結(jié)果見表7。從表中看,各重金屬與苯并芘之間均無顯著相關(guān)性(P>0.05),但微塑料與苯并芘之間的相關(guān)性極顯著(r=0.971,P<0.01),這一結(jié)果說明海馬體內(nèi)的苯并芘與微塑料的積蓄可能存在協(xié)同關(guān)系。另外,重金屬(除Cu和Hg外)與微塑料之間也有較顯著的相關(guān)性(P<0.05)這一結(jié)果可能的原因就是兩種污染物能被海馬協(xié)同攝入。因為已有一些研究證實了微塑料對重金屬和多環(huán)芳烴等環(huán)境污染物具有很強的吸附能力[36],本研究的相關(guān)性分析結(jié)果與此相互佐證,3種野生海馬體內(nèi)的重金屬和苯并芘的富集與積蓄可能與其腸道中的微塑料含量的積累有密切關(guān)系。

表7 3種野生海馬中微塑料、重金屬和苯并芘間的相關(guān)性分析Tab.7 Correlation analysis among microplastics, heavy metals and benzopyrene in wild seahorses

3 結(jié)論

通過對中國近海3種野生海馬樣本中的重金屬(Cu、Pb、Cd、Cr和Hg)、苯并芘和微塑料含量進行分析,進而評估了中國野生海馬的食用安全風險。

研究發(fā)現(xiàn)在受污染程度方面,海馬中的環(huán)境污染物含量因海馬的種類及產(chǎn)地不同有較大的差異。所有的野生海馬均遭受到Pb、Cd和Cr一種或多種重金屬的嚴重污染,但未受到Cu和Hg的污染;幾乎所有的野生海馬均未遭受苯并芘的污染。研究還發(fā)現(xiàn),野生海馬中上述環(huán)境污染物的積蓄與微塑料的攝入存在一定的關(guān)系。

在食用安全風險方面,除來自山東威海地區(qū)的日本海馬外,其他所有海馬樣本中重金屬的目標風險系數(shù)(THQs)均小于1.0,不會對人類食用安全性構(gòu)成潛在的健康風險。此外,苯并芘對人類致癌的健康風險評估顯示,所有野生海馬中積蓄的苯并芘含量均低于致癌臨界SV值,對食用人群人體造成致癌風險幾率較小。