周昌頤 王瑞 沈靂

(復旦大學附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科 上海市心血管病研究所,上海 200032)

藥物洗脫支架(drug-eluting stent,DES)在經(jīng)皮冠狀動脈介入治療中的應用,顯著降低了血運重建后不良事件的發(fā)生率,但支架內(nèi)再狹窄和支架內(nèi)新生動脈粥樣硬化等晚期并發(fā)癥仍舊影響支架植入患者的遠期預后[1]。近年來被寄予厚望的生物可降解支架(bioresorbable stents,BRS)仍未能減少支架相關并發(fā)癥的發(fā)生[2],BRS吸收過程中局部降解產(chǎn)物的聚集,使其存在獨特于DES的血管交互機制。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)是動脈血管中膜的主要細胞成分,支架植入后與支架表面直接接觸,其增殖、遷移、凋亡等生物學行為與不良事件的發(fā)生密切相關。因此,更好地理解支架植入對VSMC行為的影響,將有助于現(xiàn)有器械的優(yōu)化和改進,并為未來創(chuàng)新治療手段的開拓提供理論基礎。現(xiàn)就血管支架植入對VSMC的影響做簡要綜述。

1 VSMC的表型

生理情況下動脈血管中膜中的VSMC形態(tài)細長,呈長梭形,似紡錘,主要表達細胞骨架蛋白家族,如肌動蛋白、平滑肌肌球蛋白重鏈和平滑肌細胞特異性抗原[3],此時VSMC細胞周期停滯、增殖和遷移能力低下,主要參與動脈的收縮與舒張,從而調(diào)節(jié)器官和組織的血流量,故稱其為收縮表型[4]。收縮表型并不是VSMC分化的終末,在包含絲裂原和各種生長因子的血清等刺激下,VSMC能夠重編程、去分化,重新進入細胞周期,開始增殖[5]。

具有增殖能力的VSMC形態(tài)轉變?yōu)榱庑?遷移能力增強,并且上調(diào)了與細胞外基質相關蛋白的表達豐度,呈現(xiàn)合成表型。一般將VSMC從收縮表型去分化成為合成表型的這一過程稱為表型轉換[6]。VSMC的表型轉換促進了肺動脈高壓[7]和動脈瘤[8]等疾病的發(fā)生發(fā)展,合成表型的VSMC能夠合成、分泌過量細胞外基質,增加動脈血管的硬度,并且能夠遷移至血管內(nèi)膜后過度增殖導致內(nèi)膜增厚,以及血管腔狹窄[9]。

血管支架植入誘導VSMC成為表達c-Kit的干細胞表型,參與血管修復[10],并且通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路[11]、Yes相關蛋白(Yes-associated protein,YAP)通路[12-13]將自身轉化為合成表型,導致新生內(nèi)膜過度增殖。

近年來隨著單細胞測序技術的蓬勃發(fā)展,從病理性血管組織中鑒定出了更多VSMC亞群[14],提示VSMC具有高度的異質性,但其與支架植入后并發(fā)癥的關系尚未完全闡明。一般認為VSMC還具有以下表型：(1)間充質細胞樣表型：VSMC收縮能力下降,增殖能力增強,高表達間充質細胞具有的標志物,如SCA1、CD34及CD44;(2)纖維細胞樣表型：VSMC更多參與到細胞外基質蛋白的分泌過程,高表達膠原蛋白(如COL1A1)及蛋白聚糖(如DCN、BGN),與間充質細胞樣表型的VSMC一同導致新生內(nèi)膜過度增殖和血管僵硬[15];(3)巨噬細胞樣表型：通過獲得巨噬細胞標志蛋白(如LGALS3、CD45及CD68),VSMC能夠吞噬脂質并繼續(xù)分化為泡沫細胞[16];(4)成骨表型：成骨相關的轉錄因子(如MSX2、RUNX2及SOX9)被激活,合成分泌含生物礦化相關堿性磷酸酶的囊泡至細胞外膠原纖維致使鈣鹽沉積,最終導致血管鈣化[4];(5)脂肪細胞樣表型：功能類似棕色脂肪細胞[17]。目前鮮有研究驗證VSMC的表型在支架植入后的變化,尚需進一步明確不同表型是否參與了支架植入后血管修復的過程。

2 機械作用的影響

血管中膜的VSMC、膠原纖維及彈性纖維是血管壁主要的承力結構,維持著血管的彈性和張力。血管支架植入后管壁被拉伸,產(chǎn)生強周向應力。細胞表面的整合素、非選擇性陽離子通道和一些G蛋白耦聯(lián)受體可將這些機械性牽拉信號轉導至細胞內(nèi),使黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、血小板衍生生長因子受體α等發(fā)生磷酸化,進而通過Rho、MAPK及PI3K/Akt等通路,激活p53,促使DNA片段化,使VSMC發(fā)生細胞凋亡[18]。機械性牽拉還能通過升高胞內(nèi)活性氧水平激活NOTCH信號通路,促進VSMC增殖和表型轉換[19]。

FAK是傳導細胞外機械信號的關鍵分子,其作為一種酪氨酸激酶,能夠通過其C端的黏著斑靶向結構域接受來自血小板衍生生長因子受體和整合素的信號,進而從細胞質向細胞核穿梭。FAK蛋白的N端能夠與S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,SKP2)相互作用促進SKP2的泛素化降解,在被外界信號激活后,VSMC胞內(nèi)的FAK更多定位于細胞質,細胞核中FAK依賴的蛋白酶體途徑對轉錄因子GATA4和SKP2的降解作用減少,使核內(nèi)GATA4直接結合cyclin D1基因啟動子區(qū)域,促進cyclin D1蛋白表達,繼而與SKP2結合,使VSMC進入細胞周期[20]。另外,FAK還可通過表觀遺傳學途徑調(diào)控VSMC表型。核內(nèi)DNMT3A的泛素化降解同樣受FAK調(diào)控,FAK出核能夠增加收縮相關基因啟動子中的DNA甲基化程度,阻礙收縮相關基因表達,使VSMC發(fā)生去分化[21]。血管支架植入伴隨著血清中血小板衍生生長因子等化學信號的刺激及血管壁牽拉傳遞的機械信號刺激,而FAK是兩種刺激的共同下游關鍵蛋白分子,針對其活性的調(diào)控將有望成為防止支架植入對血管壁損傷的靶點之一。

3 抗增殖藥物的影響

DES使用涂層控制抗細胞增殖藥物的釋放,主要目的是抑制新生內(nèi)膜的過度增殖。新生內(nèi)膜主要由VSMC及細胞外基質如蛋白多糖、膠原等成分構成。動物模型的DES植入后新生內(nèi)膜組織進行單細胞測序分析結果表明,內(nèi)皮細胞僅占總細胞數(shù)的10%[22],故抑制VSMC增殖應是抗支架內(nèi)再狹窄的主要靶點。

微管抑制劑紫杉醇促使VSMC靜止于M期,阻止其增殖和遷移,是較早應用于DES的抗細胞增殖藥物,但部分研究表明其支架內(nèi)血栓發(fā)生率相較其他DES高[23],現(xiàn)已少用。

目前廣泛應用于DES涂層的是大環(huán)內(nèi)酯類抗增殖藥物雷帕霉素及其類似物(如sirolimus、everolimus、zotarolimus和biolimus A9),主要結合細胞存活和增殖的關鍵調(diào)控蛋白mTOR復合體中的mTORC1[24],進而抑制mTOR通路,促進VSMC向收縮表型轉換。

雷帕霉素的應用顯著降低了支架內(nèi)再狹窄率,但卻提高了支架內(nèi)新生動脈粥樣硬化發(fā)生率[25]。新生動脈粥樣硬化定義為支架周圍新生內(nèi)膜內(nèi)出現(xiàn)帶有CD68抗原的泡沫狀巨噬細胞簇,伴或不伴鈣化、纖維粥樣斑塊、薄纖維帽粥樣斑塊和血栓形成破裂[26],但DES引起新生動脈粥樣硬化的機制尚未完全闡明。通過譜系追蹤技術構建的動脈粥樣硬化小鼠模型表明,VSMC可以通過表型轉換成為表達CD68表面抗原的巨噬細胞樣VSMC[27],利用單細胞技術等分析方法表明其占小鼠動脈粥樣硬化斑塊中泡沫細胞總量的30%～70%[4,28]。目前,支架植入后的新生動脈粥樣硬化中泡沫細胞的來源尚不明確,VSMC向巨噬細胞樣表型轉換是否受到抗增殖藥物涂層的支架影響也缺乏嚴格的實驗證據(jù),仍需要進一步探索。

近年來也有許多研究嘗試在DES上應用新型的抗增殖藥物。比如以傳統(tǒng)毒性藥物砒霜制成的三氧化二砷DES,能夠通過阻斷VSMC中的YAP/ROCK通路,調(diào)節(jié)其表型,達到抑制新生內(nèi)膜的形成、抗支架內(nèi)再狹窄的效果[13]。

4 聚乳酸及其降解產(chǎn)物的影響

聚乳酸是應用最為廣泛的BRS骨架和可降解涂層材料,其最終降解產(chǎn)物為二氧化碳和水被血管壁所吸收,支架梁局部被結締組織填充修復,而聚乳酸在降解過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物乳酸可能影響VSMC表型,從而導致不良事件的發(fā)生。內(nèi)源性乳酸是哺乳動物細胞有氧糖酵解的產(chǎn)物,VSMC在鈣化培養(yǎng)基中培養(yǎng)時,乳酸含量與有氧糖酵解的關鍵酶PFKFB3的含量均增加[29]。同時,其他研究[30-31]提示,有氧糖酵解的關鍵酶乳酸脫氫酶和丙酮酸激酶在VSMC增殖過程中也發(fā)揮重要作用,提示W(wǎng)arburg效應參與介導調(diào)控VSMC表型。外源性的高乳酸環(huán)境能夠促進VSMC發(fā)生表型轉換,增強VSMC細胞的增殖及遷移能力[32],同時抑制BNIP3蛋白調(diào)節(jié)的線粒體自噬,使線粒體功能受損,從而誘導其氧化應激,促進其分化為成骨表型[33]。一些動物實驗和臨床研究表明,聚乳酸BRS植入后新生動脈粥樣硬化進展明顯,支架內(nèi)血管段鈣化進展迅速[34]。以上研究提示聚乳酸及其降解產(chǎn)物影響VSMC的糖代謝過程,通過Warburg效應改變表型,促進增殖并且轉化為巨噬細胞樣表型以及成骨表型,進而介導支架內(nèi)再狹窄和新生動脈粥樣硬化等不良事件的發(fā)生。

5 鎂、鋅及稀土元素的影響

鎂合金因其優(yōu)越的力學性能和抗栓能力,成為繼聚乳酸之后又一理想的BRS骨架材料。鎂離子在人體中含量豐富,且是鈣的天然拮抗劑,在體外試驗中能夠抑制高磷誘導的VSMC成骨分化,近年來有研究認為提高鈣化易感患者血清中的鎂濃度可能有助于預防血管鈣化[35]。

在添加有雷帕霉素和鎂離子的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)家兔VSMC和家兔內(nèi)皮細胞時,發(fā)現(xiàn)將鎂離子濃度從1 mM提高至3 mM并不影響雷帕霉素對家兔VSMC增殖、遷移的抑制作用,但卻能顯著恢復家兔內(nèi)皮細胞的增殖和遷移能力[36]。鈰、釹、釔和鐿等元素的體外試驗[37]結果表明,這些稀土元素添加至鎂合金中只能使VSMC上調(diào)炎癥相關基因的表達,但并不引起VSMC凋亡。另外,一項臨床前研究[38]表明,鎂基BRS與DES相比,新生動脈粥樣硬化發(fā)生率顯著降低。以上研究共同說明,鎂合金不僅具有良好的生物相容性,而且可能抑制VSMC向成骨表型轉換,是具有良好前景的BRS骨架材料。

與鎂類似,鋅基支架對新生內(nèi)膜形成也呈明顯的抑制作用[39],能夠誘導VSMC產(chǎn)生線粒體融合,提高VSMC的最大和基礎耗氧量[40],以及通過激活半胱天冬酶凋亡信號通路促進VSMC凋亡[41]。在高糖環(huán)境中,鋅離子上調(diào)VSMC中的TNFAIP3,抑制VSMC向成骨表型分化[42]。鋅具有出色的生物相容性和理想的降解速率,但其機械強度較低,近年來才開始將其作為BRS材料研究,仍需要優(yōu)化和尋找具有更強機械性能的鋅合金。

6 總結與展望

VSMC在支架植入后血管壁愈合、組織重塑及最終支架內(nèi)再狹窄和新生動脈粥樣硬化形成中發(fā)揮著核心作用。在這些過程中,VSMC經(jīng)歷了復雜的變化,由收縮型轉換為合成型,獲得了高增殖和遷移的能力。同時,許多關于VSMC異質性的研究在體外分離鑒定出更多的VSMC亞群,通過鑒定這些可由特定基因/蛋白表征的不同VSMC表型,可更好地闡明VSMC在支架植入后血管修復中的作用,有助于設計預防支架相關不良事件的個體化治療手段。通過對裸金屬支架失敗機制的研究,DES得以發(fā)展,并成功抑制了再狹窄的發(fā)生,但卻使新生動脈粥樣硬化發(fā)生率顯著提高。BRS技術的發(fā)展旨在通過介入無植入的理念,完成病變血管生理性功能的恢復,但其降解過程中的中間產(chǎn)物也影響著VSMC的生物學行為,對血管重構的結局至關重要。因此,闡明VSMC在血管支架植入后發(fā)生表型轉換的分子機制,有助于改進血管支架機械支撐物結構、BRS的分子組成及選擇理想的涂層藥物,或許將引領介入領域的下一場技術革命。