閆林林，王艷輝，張佳嬋，鄭光耀,

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210042；2.北京工商大學(xué)，北京市植物資源研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

迷迭香酸（Rosmarinic acid，RA）是一種優(yōu)質(zhì)的天然抗氧化劑，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗過(guò)敏等多種活性功效，在制藥、食品和化妝品等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值[1-5]。迷迭香酸廣泛存在于唇形科、紫草科和傘形科的多種植物中，尤以唇形科和紫草科含量較高[6-7]。紫蘇（Perilla frutescensL.）為唇形科一年生芳香草本植物，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，長(zhǎng)期以來(lái)一直用于食品、香料和傳統(tǒng)中草藥領(lǐng)域[8-11]。研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇籽榨油后的餅粕（即紫蘇籽粕）中含有大量的迷迭香酸[12-15]，是一種價(jià)格低廉、資源豐富的迷迭香酸提取原料。

目前，迷迭香酸的常用提取方法有浸漬法[12,15-16]、加熱回流提取法[4,14]、酸水解法[17-19]、索氏提取法[20]、超聲輔助提取法[13,21]、酶輔助提取法[22]、微波輔助提取法[23]等，這些方法大多存在耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、效率低、提取溶劑有毒性、易造成環(huán)境污染等問(wèn)題，不符合綠色化學(xué)的理念[24-25]。近期，也有研究者使用離子液體作為溶劑提取植物材料中的迷迭香酸[26]，但離子液體的成本較高且并非完全無(wú)毒，存在生物不可降解性、溶質(zhì)分離困難、溶劑殘留等問(wèn)題[27-28]。

相較于上述提取方法，亞臨界水提取（Subcritical water extraction，SWE）是以安全、價(jià)廉、環(huán)境友好的水為提取介質(zhì)，近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注[24-25,29]。亞臨界水在一定的高溫高壓條件下依然能夠保持液體狀態(tài)，但理化性質(zhì)發(fā)生了改變，如介電常數(shù)降低、極性降低、擴(kuò)散系數(shù)增加、溶解力增加等，具有與有機(jī)溶劑相似的性質(zhì)，使得提取效率顯著提高[29-31]。目前，亞臨界水提取法已被應(yīng)用于多酚、黃酮、多糖、生物堿、萜類等多種活性成分的提取[29,32-36]。例如，Shi 等[37]利用亞臨界水提取紅心火龍果種子中的酚類物質(zhì)；Wang 等[38]利用亞臨界水提取覆盆子中的花青素；Dazh 等[39]利用亞臨界水提取苦蕎多酚，研究結(jié)果均顯示亞臨界水提取的目標(biāo)物質(zhì)得率和生物活性顯著高于傳統(tǒng)溶劑提取法。然而，目前尚未有利用亞臨界水提取紫蘇籽粕中迷迭香酸的相關(guān)報(bào)道。

因此，本研究以紫蘇籽粕為原料，采用亞臨界水提取法提取其中的迷迭香酸，考察提取溫度、提取時(shí)間、料液比等參數(shù)對(duì)提取得率的影響，用響應(yīng)面法優(yōu)化迷迭香酸的亞臨界水提取工藝，并評(píng)價(jià)其抗氧化活性，以期為紫蘇籽粕中迷迭香酸的提取提供一種綠色、高效、經(jīng)濟(jì)的技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫蘇籽粕 甘肅靈臺(tái)縣隴香食品有限公司；沒(méi)食子酸（純度≥98%）、蘆丁（純度≥98%）、迷迭香酸（純度≥98%） 南京春秋生物工程有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、抗壞血酸（VC）Sigma 公司；甲醇、乙腈、甲酸 色譜級(jí)，阿拉丁試劑（上海）有限公司；碳酸鈉、六水氯化鋁、鐵氰化鉀、氯化鐵、三水乙酸鈉和甲醇等其他試劑 國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

LC-20AT 液相色譜工作站配有自動(dòng)進(jìn)樣器（SIL-20A）、PDA 檢測(cè)器（SPD-20A）、柱溫箱（CTO-10AS）、UV-1700 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；TGL-16C 型高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；亞臨界水萃取裝置（HAWG 型反應(yīng)釜）江蘇華安科研儀器有限公司；KH5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；Sigma HD 型熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國(guó)蔡司公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫蘇籽粕預(yù)處理 干燥的紫蘇籽經(jīng)冷榨法萃取紫蘇油脂后立即收集其餅粕（即紫蘇籽粕），將紫蘇籽粕于50 ℃烘箱干燥，粉碎，過(guò)60 目篩，密封保存，使用前干燥至恒重。

1.2.2 亞臨界水提取 精確稱取紫蘇籽粕5 g，置于亞臨界水萃取罐中，按照一定的料液比加入去離子水，設(shè)定適當(dāng)?shù)奶崛毫吞崛囟?，提取一定時(shí)間后，得到紫蘇籽粕提取液，迅速將其抽濾，重復(fù)提取兩次，合并濾液上清，定容，備用。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 采用1.2.2 中的提取方法考察各單因素（提取溫度、提取時(shí)間、料液比和提取壓力）對(duì)紫蘇籽粕中迷迭香酸提取得率的影響。固定提取壓力為3.0 MPa、提取時(shí)間為20 min、料液比為1:20 g/mL 的條件下，設(shè)置提取溫度為100、120、140、160、180、200、220 ℃；固定提取壓力為3.0 MPa、提取溫度為160 ℃、料液比為1:20 g/mL 的條件下，設(shè)置提取時(shí)間為10、20、30、40、50、60 min；固定提取壓力為3.0 MPa、提取溫度為160 ℃、提取時(shí)間為30 min 的條件下，設(shè)置料液比為1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 g/mL；固定提取溫度為160 ℃、提取時(shí)間為30 min、料液比為1:40 g/mL 的條件下，設(shè)置提取壓力為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 MPa。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)迷迭香酸提取得率影響較大的三個(gè)因素提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）和料液比（X3）為自變量，以迷迭香酸提取得率為響應(yīng)值（Y），按照Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3 因素3 水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)（具體見(jiàn)表1），根據(jù)回歸模型分析各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，優(yōu)化亞臨界水提取工藝參數(shù)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface experiment

1.2.5 迷迭香酸含量的測(cè)定及其提取得率計(jì)算

1.2.5.1 高效液相色譜分析條件 采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定紫蘇籽粕提取物中迷迭香酸的含量，色譜條件和方法參考文獻(xiàn)并稍作改進(jìn)[14]。色譜柱：Diamonsil RP-C18色譜柱（250 mm，4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.2%甲酸水（A）:甲醇（B）；梯度洗脫程序?yàn)椋?～40 min，流動(dòng)相B 為5.0%～65%；40～45 min，流動(dòng)相B 為65%～5%。40～45 min，流動(dòng)相B 為5%；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm；柱溫35 ℃。

1.2.5.2 迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取適量迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品，用50%甲醇水溶液配制成濃度為0.1 mg/mL的母液，再用50%甲醇水溶液稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，分別進(jìn)HPLC 測(cè)定其峰面積。以迷迭香酸的濃度為橫坐標(biāo)（x），以峰面積為縱坐標(biāo)（y）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=68733.85x-70126.21，R2=0.9994，迷迭香酸在濃度0.01～0.10 mg/mL 范圍內(nèi)線性良好。

1.2.5.3 迷迭香酸提取得率的計(jì)算 將紫蘇籽粕提取液用50%的甲醇水溶液稀釋，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜后，進(jìn)HPLC 分析。按照公式（1）計(jì)算迷迭香酸的提取得率[14]。

式中：Y 表示迷迭香酸的提取得率，mg/g dw（dry weight）；C 表示通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的迷迭香酸濃度，mg/mL；n 表示樣品提取液的稀釋倍數(shù)；V 表示樣品提取液的體積，mL；m 表示紫蘇籽粕原料的用量，g。

1.2.6 不同提取方法的比較 比較亞臨界水提取法與常規(guī)溶劑提取法（如甲醇回流、水回流、甲醇超聲、水超聲）對(duì)迷迭香酸提取得率及其抗氧化活性的影響。其中，亞臨界水提取采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的工藝參數(shù)，常規(guī)溶劑提取則參考相關(guān)文獻(xiàn)，具體如下。

1.2.6.1 加熱回流提取 參考Yan 等[19]的方法并稍作修改。精確稱取紫蘇籽粕5 g 置于圓底燒瓶中，按料液比1:40 g/mL 分別加入80%甲醇水溶液和純水，設(shè)置提取溫度為80 ℃，加熱回流提取1 h 后，得到紫蘇籽粕提取液，迅速將其抽濾，在上述相同條件下重復(fù)提取兩次，合并濾液上清，定容，測(cè)定提取液中迷迭香酸的含量并計(jì)算得率。

1.2.6.2 超聲輔助提取 參考Tang 等[13]的方法并稍作修改。精確稱取紫蘇籽粕5 g 置于圓底燒瓶中，按料液比1:40 g/mL 分別加入80%甲醇水溶液和純水，設(shè)置超聲提取溫度60 ℃，超聲功率為90 W，超聲頻率50 Hz，提取1 h 后，得到紫蘇籽粕提取液，迅速將其抽濾，在上述相同條件下重復(fù)提取兩次，合并濾液上清，定容，測(cè)定提取液中迷迭香酸的含量并計(jì)算得率。

1.2.7 抗氧化活性的測(cè)定 本研究通過(guò)DPPH 和ABTS 自由基清除試驗(yàn)比較不同提取方法下紫蘇籽粕提取液的抗氧化活性。

1.2.7.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)[14,40]方法并稍作修改。首先，用去離子水配制一系列濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL），取0.1 mL 的VC標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入0.25 mL 新鮮配制的DPPH 甲醇溶液（濃度為1 mmol/L），再加入2 mL 甲醇，充分混合后于室溫下避光放置20 min，以甲醇為空白對(duì)照，于517 nm 下測(cè)定其吸光值，按照公式（2）計(jì)算VC標(biāo)準(zhǔn)品溶液的DPPH 自由基清除率（%）。以VC濃度為橫坐標(biāo)（x），以DPPH 自由基清除率（%）為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其線性方程y=492.7x+6.4747，其R2=0.9994，在濃度0.05～0.20 mg/mL 范圍內(nèi)線性良好。將紫蘇籽粕提取液樣品稀釋一定倍數(shù)，按照上述方法測(cè)定其DPPH 自由基清除率（%），代入線性方程，計(jì)算其DPPH 自由基清除能力的VC當(dāng)量（mg VC/g dw），即每g 紫蘇籽粕干樣的自由基清除能力相當(dāng)于多少mg 的VC[41]。

式中，A0表示空白對(duì)照在517 nm 處的吸光值；As表示VC標(biāo)準(zhǔn)品（或紫蘇籽粕提取液樣品）溶液在517 nm 處的吸光值。

1.2.7.2 ABTS 自由基清除能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)[14,40]方法并稍作修改。首先，用去離子水配制一系列不同濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01、0.015、0.02、0.03、0.04、0.06、0.08 mg/mL）。取0.15 mL 的VC標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入2.85 mL 用甲醇新鮮配制的ABTS+·工作液，充分混合后于室溫下避光放置6～10 min，以甲醇為空白對(duì)照，在734 nm 下讀取樣品吸光值，按照公式（3）計(jì)算VC標(biāo)準(zhǔn)品（或待測(cè)樣品）溶液的ABTS 自由基清除率（%）。以VC濃度為橫坐標(biāo)（x），以ABTS 自由基清除率（%）為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程y=1036.8x-2.1096，其R2=0.999，在濃度0.05～0.20 mg/mL 范圍內(nèi)線性良好。同上，將測(cè)得的紫蘇籽粕提取液樣品的ABTS 自由基清除率（%）代入線性方程，計(jì)算其ABTS 自由基清除能力的VC當(dāng)量（mg VC/g dw）。

式中，A0表示空白對(duì)照在734 nm 處的吸光值；As表示VC標(biāo)準(zhǔn)品（或紫蘇籽粕提取液樣品）溶液在734 nm 處的吸光值。

1.2.8 紫蘇籽粕粉末的物理形態(tài)觀察 將紫蘇籽粕原料和經(jīng)過(guò)不同提取方法處理后的殘?jiān)?0 ℃烘干至恒重后，取適量在掃描電鏡（SEM）下觀察其在提取前后的微觀結(jié)構(gòu)變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下均進(jìn)行3 次平行操作，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。采用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，并進(jìn)行模型優(yōu)化。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取溫度對(duì)紫蘇籽粕中迷迭香酸提取得率的影響 由圖1A 中可知，隨著提取溫度的升高（100～160 ℃），迷迭香酸的提取得率也逐漸升高，在160 ℃時(shí)達(dá)到最大值（3.23 mg/g dw）；但是，當(dāng)提取溫度超過(guò)160 ℃之后，其提取得率有明顯下降的趨勢(shì)；當(dāng)溫度達(dá)到220 ℃時(shí)，只能檢測(cè)到微量的迷迭香酸（0.13 mg/g dw）。相關(guān)研究表明，在亞臨界水提取過(guò)程中，提取溫度起著關(guān)鍵性的作用，溫度的升高可加速分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，提高亞臨界水對(duì)原料中目標(biāo)化合物的溶解性，從而提高目標(biāo)化合物的提取得率[42]，但是由于迷迭香酸是熱敏感性化合物，過(guò)高的提取溫度會(huì)造成迷迭香酸的降解，從而導(dǎo)致其提取得率降低[26]。因此，在后續(xù)的單因素實(shí)驗(yàn)中選取160 ℃作為亞臨界水提取紫蘇籽粕的溫度。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)紫蘇籽粕中迷迭香酸提取得率的影響 由圖1B 中可知，當(dāng)提取時(shí)間在10～30 min內(nèi)，隨著提取時(shí)間的逐漸增加，迷迭香酸的提取得率不斷升高，在30 min 時(shí)達(dá)到最大值（3.71 mg/g dw）；超過(guò)30 min 后，迷迭香酸的提取得率有下降趨勢(shì)，提取時(shí)間為50 min 時(shí)，其提取得率為2.37 mg/g dw。在一定提取時(shí)間范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，亞臨界水溶解的物質(zhì)不斷增加，原料中的活性成分與提取溶劑逐漸達(dá)到了固液平衡；當(dāng)達(dá)到平衡之后，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間不能再增加目標(biāo)化合物的得率，相反長(zhǎng)時(shí)間的高溫條件會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)化合物的降解，從而使其得率降低[42-44]。因此，在后續(xù)的單因素實(shí)驗(yàn)中，選取30 min 作為亞臨界水提取紫蘇籽粕的提取時(shí)間。

2.1.3 料液比對(duì)紫蘇籽粕迷迭香酸提取得率的影響

由圖1C 中可知，迷迭香酸的提取得率隨料液比的增加而增加；但是當(dāng)料液比超過(guò)1:40 g/mL 后，迷迭香酸的提取得率逐漸趨于穩(wěn)定。在一定范圍內(nèi)，增加料液比有利于加快介質(zhì)傳遞，提高目標(biāo)化合物的得率[45]；但是當(dāng)達(dá)到平衡之后，目標(biāo)化合物的提取得率便趨于穩(wěn)定、不再增加，過(guò)多的提取溶劑不僅會(huì)造成資源浪費(fèi)，還會(huì)增加后期除去溶劑過(guò)程的工作量。因此，在后續(xù)的單因素實(shí)驗(yàn)中，選取1:40 g/mL 作為亞臨界水提取紫蘇籽粕的料液比。

2.1.4 提取壓力對(duì)紫蘇籽粕迷迭香酸提取得率的影響 由圖1D 中可知，起初隨著壓力的增加，迷迭香酸的提取得率有升高趨勢(shì)，但達(dá)到3.0 MPa 后不再變化。相關(guān)文獻(xiàn)表明，亞臨界水提取過(guò)程中提取壓力的作用是使水能夠保持液體狀態(tài)，提取壓力對(duì)提取得率的影響較小，甚至可以忽略不計(jì)[29,46]。因此，本研究選取3.0 MPa 作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中亞臨界水提取紫蘇籽粕的提取壓力，且不再對(duì)提取壓力參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化模型的建立 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）和料液比（X3）為自變量，以迷迭香酸提取得率為響應(yīng)值（Y），根據(jù)Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3 因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)回歸模型分析各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，優(yōu)化得到亞臨界水提取紫蘇籽粕迷迭香酸的工藝參數(shù)。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface optimization experiment

運(yùn)用Design-Expert 軟件對(duì)表2 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到迷迭香酸提取得率（Y）的回歸模型方程為：Y=-63.51175+0.68414X1+0.44690X2+0.29283X3+0.000025X1X2-0.0001625X1X3-0.0002X2X3-0.00208187X12-0.0075025X22-0.0031775X32。通過(guò)表3 中的方差分析及和相關(guān)系數(shù)判斷該模型的可靠性。由表3 可知，該模型達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01）；失擬項(xiàng)（P=0.4901＞0.05）不顯著，說(shuō)明該模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值較吻合，能夠較好地反映自變量與各因素之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)可靠；該模型的決定系數(shù)R2=0.9877、調(diào)整決定系數(shù)R2Adj= 0.9719，說(shuō)明三個(gè)自變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系顯著，模型和試驗(yàn)較為可靠，可解釋97.19%的響應(yīng)值變化[45]。變異系數(shù)（CV）是用平均值的百分比來(lái)表示標(biāo)準(zhǔn)偏差的量度，用來(lái)描述數(shù)據(jù)的分散程度，值越小說(shuō)明模型的重現(xiàn)性越好、可靠性越高[42-43]，該模型中變異系數(shù)CV 值為2.84%，說(shuō)明模型可靠。模型中的一次項(xiàng)X1對(duì)提取得率（Y）的影響極顯著（P＜0.01），X2和X3（P＞0.05）對(duì)其影響不顯著；二次項(xiàng)X12、X22和X32均影響極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)X1X2、X1X3和X2X3的影響不顯著（P＞0.05），說(shuō)明各因素之間的交互作用小，這與閆拯等[43]報(bào)道的結(jié)果相似，可能是因?yàn)楦饕蛩貙?duì)其響應(yīng)值的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系[47]。由各因素的F值和P值可知，三個(gè)因素對(duì)迷迭香酸提取得率（Y）的影響程度依次是X1＞X2＞X3，即提取溫度（℃）＞提取時(shí)間（min）＞料液比（g/mL）。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA of variance for response surface quadratic model

2.2.2 模型的響應(yīng)曲面分析及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)回歸模型擬合了迷迭香酸提取得率（Y）隨各提取參數(shù)變化的二維和三維曲面圖（見(jiàn)圖3），可反映出提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）和料液比（X3）三個(gè)因素對(duì)迷迭香酸提取得率（Y）的影響。曲面的曲線越陡峭，說(shuō)明該因素對(duì)迷迭香酸提取得率的影響越大；相反，曲面越平緩，則影響越不顯著[48]。橢圓形的等高線說(shuō)明兩個(gè)因素的交互作用強(qiáng)，等高線的形狀越扁平，說(shuō)明各因素之間的交互作用就越強(qiáng)，等高線越密集說(shuō)明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著[49]。由結(jié)果可知，對(duì)迷迭香酸提取得率（Y）的影響較大的因素是提取溫度和料液比的交互作用（X1X3），這與文獻(xiàn)[43]中結(jié)果相似；其次是提取時(shí)間和料液比的交互作用（X2X3）；但各交互作用均未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。

圖3 兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響Fig.3 Effects of the interaction between two factors on the response value

根據(jù)建立的模型進(jìn)行優(yōu)化，可得出亞臨界水提取紫蘇籽粕迷迭香酸的最佳工藝參數(shù)為：提取溫度162.90 ℃、提取時(shí)間29.51 min、料液比1:40.98 g/mL，迷迭香酸提取得率（Y）的理論值為4.80 mg/g dw。為驗(yàn)證響應(yīng)面法優(yōu)化的可靠性，根據(jù)預(yù)測(cè)的工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，考慮到試驗(yàn)的實(shí)際操作性將亞臨界水提取溫度設(shè)置為163 ℃、提取時(shí)間為30 min、料液比為1:41 g/mL，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)測(cè)得迷迭香酸提取得率為4.91±0.16 mg/g dw，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)的理論值接近，表明優(yōu)化后的提取工藝可行。

2.3 不同提取方法的比較

2.3.1 迷迭香酸提取得率的比較 本研究比較了亞臨界水提取法與常規(guī)溶劑提取法（如甲醇回流、水回流、甲醇超聲、水超聲）對(duì)迷迭香酸提取得率及其抗氧化活性的影響。由圖4A 可知，亞臨界水提取法的迷迭香酸提取得率最高（4.91±0.16 mg/g dw），其次是甲醇回流提?。?.20±0.09 mg/g dw）、甲醇超聲提?。?.95±0.19 mg/g dw）、水回流提取（1.46±0.08 mg/g dw）和水超聲提?。?.70±0.03 mg/g dw），且各提取方法存在顯著差異（P＜0.05）。其中，亞臨界水的迷迭香酸提取得率約為甲醇回流提取的1.5 倍，約為甲醇超聲提取的1.7 倍。此前，Lee 等[12]采用甲醇浸漬法提取紫蘇餅粕中的迷迭香酸的得率為1.72 mg/g；閆拯等[43]采用超聲波輔助提取紫蘇餅粕中的迷迭香酸，優(yōu)化工藝參數(shù)后迷迭香酸提取得率為0.289%（即2.89 mg/g），梅喜剛等[18]采用硫酸水解法提取紫蘇籽粕中迷迭香酸，優(yōu)化工藝參數(shù)后迷迭香酸提取得率為0.541 mg/g，均低于本研究中亞臨界水提取法的迷迭香酸得率；而在張玥莉等[50]的研究中，采用超聲輔助提取紫蘇籽中迷迭香酸的得率為0.59%（即5.9 mg/g），略高于本研究中亞臨界水的提取得率，但其提取過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，且使用大量乙醇溶劑，提取產(chǎn)品存在溶劑殘留等風(fēng)險(xiǎn)。

圖4 不同提取方法下紫蘇籽粕迷迭香酸提取得率及抗氧化活性比較Fig.4 Comparison of rosmarinic acid yields and antioxidant activities of perilla meal extracts obtained by different extraction methods

2.3.2 抗氧化活性比較 比較不同提取方法下紫蘇籽粕提取液的抗氧化活性（見(jiàn)圖4B）發(fā)現(xiàn)，亞臨界水提取物的抗氧化活性最高，其清除DPPH 和ABTS自由基能力的VC當(dāng)量分別為10.62 和13.46 mgVC/g dw；其次是甲醇回流（7.51 和8.84 mgVC/g dw）、甲醇超聲（7.49 和8.69 mgVC/g dw）、水回流（5.53 和8.03 mgVC/g dw）和水超聲提取（4.56 和6.59 mgVC/g dw）。通過(guò)Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，紫蘇籽粕提取物對(duì)DPPH 和ABTS 自由基的清除能力與其迷迭香酸的提取得率之間均存在顯著的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別是RDPPH=0.991 和RABTS=0.930。換言之，亞臨界水提取迷迭香酸的提取得率高，其提取物的抗氧化活性也越強(qiáng)[51]。在前人的研究中也證實(shí)了相似的結(jié)論，如Park 等[52]比較了亞臨界水提取和甲醇提取法對(duì)鼠尾藻中活性物質(zhì)的提取得率及其抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)不同溫度條件下亞臨界水的提取效率均顯著地高于甲醇提取法，并且亞臨界水提取物的抗氧化活性約為甲醇提取物的8～100 倍；Wang 等[38]利用亞臨界水提取覆盆子中的花青素，提取得率及其提取物的抗氧化活性均顯著地優(yōu)于常規(guī)熱水提取和甲醇提取法。綜上可知，相比于常規(guī)提取法，本研究利用亞臨界水提取紫蘇籽粕中的迷迭香酸更具優(yōu)勢(shì)，不僅可以提高迷迭香酸的提取得率及其提取物的抗氧化活性，還可避免有機(jī)溶劑的使用，是一種安全環(huán)保、高效的提取方法。

2.3.3 電鏡掃描結(jié)果 通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）觀察比較不同提取方法處理后紫蘇籽粕的微觀結(jié)構(gòu)。從圖5 可知，未經(jīng)過(guò)提取的紫蘇籽粕原料顆粒（見(jiàn)圖5A）表面光滑、無(wú)氣孔、結(jié)構(gòu)相對(duì)完整；而提取后的紫蘇籽粕殘?jiān)w粒均遭到不同程度破壞，表面結(jié)構(gòu)疏松、有孔隙。并且，亞臨界水提取（SWE）的紫蘇籽粕顆粒的孔隙呈片狀排列，空隙較大，疏松程度遠(yuǎn)大于其它幾種常規(guī)提取方法。這可能是因?yàn)閬喤R界水提取過(guò)程中，高溫和高壓條件使紫蘇籽粕的結(jié)構(gòu)受到了較大程度的破壞，形成了多孔隙的疏松結(jié)構(gòu)，更有利于目標(biāo)化合物的釋放，從而獲得較高的提取得率[53-54]。

圖5 不同提取方法處理后的紫蘇籽粕SEM 形貌圖Fig.5 SEM morphology of perilla seed meal treated by different extraction methods

3 結(jié)論

亞臨界水提取技術(shù)作為一種綠色環(huán)保的新型提取技術(shù)，可顯著提高多酚、黃酮、多糖等多種天然活性成分的提取效率[31]。本研究中采用亞臨界水提取法提取紫蘇籽粕中迷迭香酸，優(yōu)化后的最佳工藝條件為提取溫度163 ℃、提取時(shí)間30 min、料液比1:41 g/mL。在此條件下，紫蘇籽粕中迷迭香酸的提取得率為4.91±0.16 mg/g dw，其清除DPPH 和ABTS自由基能力的VC當(dāng)量分別為10.62 和13.46 mgVC/g dw。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，亞臨界水提取法的迷迭香酸提取得率及其抗氧化活性均顯著高于幾種常規(guī)提取法（P＜0.05），不僅提高了提取效率，還可避免有機(jī)溶劑的使用，節(jié)省提取時(shí)間。綜上，亞臨界水提取是一項(xiàng)綠色環(huán)保、高效的提取技術(shù)，可應(yīng)用于紫蘇籽粕中迷迭香酸的提取，具有良好的開發(fā)前景。