林 泉，孔翔玉，莫明添，石身儷，梁海潔，蔡妮娜，陸紅英

（1.廣西愛思特整形外科醫(yī)院美容外科，廣西 南寧，530001；2.廣西南寧七和醫(yī)療美容門診部，廣西 南寧，530001；3.廣西南寧愛瑪莎醫(yī)療美容醫(yī)院美容外科，廣西 南寧，530001）

自體脂肪移植填充是當今美容外科的熱點手術之一，能解決諸多體表凹陷或形體欠飽滿的問題，術后形體能達到和諧的美以及面容獲得飽滿的年輕態(tài)。自體脂肪由于是自身組織具備無免疫抗原性、取材容易、量充足等優(yōu)點，已成為整形外科軟組織填充的首選材料。但是，脂肪細胞的存活率或移植物體積留存率在術前無法預知確定，致使其臨床應用受到較多限制，據統計其吸收率可達20-90%[1]。自體細胞輔助脂肪移植技術（cell-assisted lipotransfer，CAL）解決了存活率低的問題，通過提高待移植脂肪組織中脂肪間充質干細胞等多種血管基質成分含量的方式可以顯著提高移植后脂肪的存活率[2]。然而，脂肪間充質干細胞（adipose derived stem or stromal cells，ADSCs）移植雖然能提高移植脂肪組織的成活率，但這種方法對于乳腺組織，尤其是處于癌前病變期的乳腺組織的作用及影響尚不明確。本實驗應用大鼠自體脂肪間充質干細胞移植，觀察其對乳腺癌前病變組織的作用及影響，結果報告如下。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

選擇72只雌性未育Wistar大鼠（10周，220±10 g）購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心，實驗過程中嚴格遵守操作流程及倫理標準，大鼠全程自由飲食、進水。動物證書編號：SXCK（桂）K2021-0002；SPF動物房 22～26℃，相對濕度 52%～58%；倫理審批號：gx20210361。

1.1.2 試劑

多聚甲醛溶液（湖北科沃德化工有限公司）、大鼠免疫組化試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 通過1 次性胃管灌注DMBA100mg/Kg 的方式構建化學誘導性乳腺癌前病變大鼠模型。

1.2.2 脂肪間充質干細胞制備方法 建模同日，在麻醉情況下，常規(guī)消毒鋪巾，打開實驗組大鼠單側腹股溝，切取皮下脂肪墊，隨后獲取脂肪組織中的脂肪間充質干細胞并通過流式細胞儀對其鑒定。使用CAL技術，將脂肪間充質干細胞進行濃縮提純備用。

1.2.3 移植方法 建模同日，將建模成功的乳腺癌前病變大鼠72 只隨機分為實驗組和對照組，每組36 只，在實驗組大鼠第5 對乳腺組織內注射脂肪間充質干細胞1×106，對照組相同位置注射生理鹽水 0.1ml。

1.2.4 檢測方法 建模第10 周，處死所有實驗大鼠，無菌操作下切除大鼠第5 對乳腺及周圍組織，逐一完成以下檢測。

1.2.4.1 病理學檢測 將大鼠第5 對乳房腺體組織，冰凍切片，進行細胞學檢查、常規(guī)組織學檢查。

1.2.4.2 免疫組化法 清洗載玻片，將大鼠第5 對乳房腺體組織，進行固定、脫水、包埋、切片，厚度為5μ m，然后按照撈組織、脫蠟、抗原修復、血清封閉、加一抗、加二抗、加SABC、加顯色劑、復染、脫水、封片等步驟逐一完成，詳按試劑盒說明書進行操作。封片后，在顯微鏡（200 倍）下隨機選取5 個區(qū)域，用圖像分析系統準確測定VEGF 平均光密度值。

1.3 統計學處理

數據統計處理采用SPSS23.0進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗，計量數據以均數()表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理細胞學觀察

實驗組與對照組大鼠乳腺增生程度無統計學差異（P＞0.05），見表1、圖1.

圖1a 實驗組大鼠乳腺組織病理學結果（X200）圖1b 對照組大鼠乳腺組織病理學結果（X200）

表1.大鼠乳腺組織增生程度

2.2 免疫組

化法檢測乳腺組織內血管內皮生長因子VEGF平均光密度結果與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2、圖2。

表2.大鼠乳腺組織增生程度

圖2a 實驗組大鼠乳腺組織VEGF 的表達（X200）圖2b 對照組大鼠乳腺組織VEGF 的表達（X200）

3 討論

乳房作為性器官一直是反映女性體態(tài)美的重要因素，對稱、圓潤、挺拔、和諧的乳房代表著年輕、活力十足而受到所有人的喜愛。隨著社會文明的進步，主動追求乳房形態(tài)美感的人群也越來越多。自體脂肪移植隆乳具有損傷小、無排異性、質地柔軟等優(yōu)點已成為臨床乳房美化的重要手段和選擇之一。據統計，早在2017年全球已進行了137070例自體脂肪移植隆乳手術，占當年總隆乳量的8.2%。但脂肪隆乳技術仍有至今未解決的臨床問題，即存活率及安全性，引發(fā)較多學者進行研究。即使Torsvik和Bjerkvig報道脂肪間充質干細胞移植物在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中不同階段發(fā)揮不同的作用[3]，也未見臨床報道脂肪移植增加了乳腺癌的發(fā)生風險[4]。研究已證實CAL技術能夠提高自制體脂肪移植隆乳后脂肪組織的存活率，但在乳腺癌發(fā)病率居高不下的背景下，濃縮獲取的脂肪間充質干細胞是否對乳腺癌前病變組織有促進癌變作用或其它影響，應當展開深入研究。

乳腺癌癌前病變是指乳腺導管內上皮細胞的異常增生，出現形態(tài)學改變，這些變異增生的部分病例可能發(fā)展成癌的乳腺增生性病變[5]。研究顯示乳腺癌癌前病變組織5年癌變率為6.6%，25年最高癌變率為 46.0%[6]。探究乳腺癌形成的原因，主要是正常乳腺導管上皮細胞轉化為癌細胞是復雜的過程，分為不同階段、不同步驟，受較多因素調控。乳腺癌癌前病變是這一過程中不可缺少的環(huán)節(jié)，且是這一過程是可逆。如果乳腺癌癌前病變加速發(fā)展，則不可避免的發(fā)展為乳腺癌。ADSCs具有自身多方向分化潛能，而且有發(fā)揮旁分泌和免疫調節(jié)功能，可調控周圍細胞增殖分化。那么，移植以脂肪間充質干細胞為主的血管基質成分濃度較高的物質后，乳腺癌前病變組織在移植物的調控作用下，局部血管增加或不變，加速向癌變方向轉化或是往正常組織轉歸最值得觀察。

乳腺癌癌前病變模型的制造學界一直有爭論，通常分為自發(fā)性模型、誘發(fā)模型或可移植模型三種，李靜蔚等[7]認為DMBA誘導的SD大鼠乳腺增生及癌變,造模10周后出現乳腺癌癌前病變,成功率優(yōu)于wister大鼠，但也學者持不同觀點[8]。本實驗選擇了Wistar大鼠，緣于其體型較SD大鼠短胖大腿內側脂肪相對較豐富，利于實驗。建立乳腺癌癌前病變模型時，選擇了1次性胃管灌注DMBA100mg/Kg的方式構建化學誘導性乳腺癌前病變大鼠模型，成模便捷穩(wěn)定。文獻報道還有利用DMBA+雌孕激素序貫5天組建立乳腺癌癌前病變方法，雖然該方法是建立乳腺癌癌前病變模型較好的方法之一[8]，但耗時、繁瑣，亦不為首選。

VEGF又稱血管通透因子，能增加血管通透性，而且還可以促進細胞外基質變性，也能夠促進新生血管形成。VEGF不僅促進腫瘤血管生長，對乳腺癌細胞本身也有促進作用，與乳腺的發(fā)生、發(fā)展、轉移呈正相關[9]。因此，檢測VEGF的值可以判斷癌前病變的轉歸方向。本實驗的免疫組化結果提示，VEGF光密度值無明顯變化，這可能是脂肪間充質干細胞移植后可能已直接替代作用參與組織修復，對周圍乳腺組織發(fā)揮旁分泌和免疫調節(jié)功能，調控組織周圍相關細胞改善微循環(huán)等作用參與組織修復和重建[10,11]，致使乳腺組織局部微循環(huán)得到明顯改善，而不是加速癌前病變向癌癥轉歸。因此，運用CAL技術制備的高濃度脂肪間充質干細胞移植物對乳腺癌前病變起到修復、抑制及促使增生細胞逆轉的作用，是一種良好的作用。本實驗的研究手段通用可靠，采用的病理檢測、免疫組化均已被廣泛應用與乳腺癌的發(fā)病機制研究[12-14]，其準確性得到公認。

此外，研究證實乳腺增生程度與乳腺血液流變學的諸多因素關系密切，特別是與乳腺的血液黏稠度、局部微循環(huán)障礙呈正相關[15]，檢測乳腺血液流變學對乳腺癌癌前病變的診斷、轉歸均有積極的意義和重要價值。在實體腫瘤乳腺癌發(fā)生前的非典型增生階段，病變組織中已有新血管生成，尤其在中、重度非典型增生及原位癌階段，新生血管明顯增多[7，16]，因此，檢測局部血管數量及微循環(huán)可以判斷組織的轉歸方向，也可作為腫瘤發(fā)生發(fā)展演變的佐證，需要下一步再研究。

綜上所述，自體脂肪間充質干細胞移植可安全用于乳腺癌前病變組織，不會導致乳腺癌前病變組織加速向乳腺癌發(fā)展。對于正常乳腺而言，脂肪隆乳致癌的可能性更低、安全性更高。