許昊男，王兆耀，吳慧敏，許 蕾

（1. 江蘇省人民醫(yī)院，江蘇 南京 210029； 2. 江蘇省蘇州市獨(dú)墅湖醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000； 3. 中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，江蘇 南京 210002）

上呼吸道感染（URTI）是嬰幼兒常見且多發(fā)的疾病，主要由病毒、細(xì)菌等感染所致鼻、咽、扁桃體等部位產(chǎn)生炎癥，從而出現(xiàn)咳嗽、流涕、發(fā)燒等多種癥狀，易引起并發(fā)癥，且傳染性較強(qiáng)，需及時(shí)治療［1］。臨床常用治療藥物為磷酸奧司他韋，療效較好，但患兒用藥后可能出現(xiàn)惡心嘔吐、皮膚紅疹等不良反應(yīng)，用藥安全性欠佳［2-3］。藍(lán)芩口服液由板藍(lán)根、黃芩、梔子、黃柏、胖大海5 味中藥組方，有清熱解毒、利咽消腫功效，其不良反應(yīng)較少，尤其適用于治療嬰幼兒URTI。目前，藍(lán)芩口服液已廣泛應(yīng)用于治療小兒手足口病［4］、流行性腮腺炎［5］、水痘［6］、急性扁桃體炎［7］、皰疹性咽峽炎［8］、流行性感冒（簡稱流感）［9-10］等URTI。但其復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)和藥物相互作用導(dǎo)致傳統(tǒng)藥理學(xué)的研究手段不易探尋其藥效機(jī)制。鑒于此，本研究中借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選藍(lán)芩口服液的活性成分和作用靶點(diǎn)，探索其藥效途徑，分析不同組分對不同環(huán)節(jié)的作用機(jī)制，為臨床治療URTI 提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藍(lán)芩口服液活性成分及靶點(diǎn)篩選

以“板藍(lán)根”“黃芩”“梔子”“黃柏”“胖大海”為關(guān)鍵詞，分別檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，http：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）和中藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID，http：//www.megabionet.org/tcmid/），預(yù)測藍(lán)芩口服液的活性成分及作用靶點(diǎn)。以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件，保留符合條件的潛在活性成分和作用靶點(diǎn)。

1.2 URTI 靶點(diǎn)的篩選及共有靶點(diǎn)確定

以“upper respiratory tract infections”“upper respiratory infections”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards（https：//www.genecards.org/）疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，預(yù)測并收集URTI 相關(guān)靶點(diǎn)，再將URTI 的疾病靶點(diǎn)與藍(lán)芩口服液作用靶點(diǎn)相映射，取交集得到共有靶點(diǎn)（即藍(lán)芩口服液參與治療URTI的潛在作用靶點(diǎn)）。利用Uniprot（https：//www.uniprot. org/）數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo Sapiens”，將共有靶點(diǎn)的蛋白名稱規(guī)范為人源的標(biāo)準(zhǔn)基因名稱，作為靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化名稱。

1.3 中藥-成分-共有靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將獲得的共有靶點(diǎn)及潛在活性成分導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制藍(lán)芩口服液與URTI“中藥-成分-共有靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，以不同顏色的節(jié)點(diǎn)（node）分別表示藥材、活性成分、靶點(diǎn)，成分和靶點(diǎn)以邊（edge）相連。利用Network Analyzer工具對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)分析，計(jì)算蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)度值（degree），degree 的大小表示對應(yīng)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵度，依據(jù)degree降序排列，獲得藍(lán)芩口服液的核心成分。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將獲得的共有靶點(diǎn)上傳至String 11.0 數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org），設(shè)定物種為“Homosapiens”，選定interaction score ＞0.7，進(jìn)行蛋白與蛋白相互作用分析，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行可視化處理，并利用軟件中Network Analyzer 工具計(jì)算degree 等拓?fù)鋮?shù)，以degree 不小于所有degree 中位數(shù)的2 倍為篩選條件，確定具有重要貢獻(xiàn)的核心靶點(diǎn)。

1.5 富集分析

將核心靶點(diǎn)通過Metascape數(shù)據(jù)庫（http：//metascape.org/gp/index.html）進(jìn)行基因本體論（GO）功能富集分析，通過R 包c(diǎn)lusterProfiler 進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析，獲得藍(lán)芩口服液對URTI 可能的作用機(jī)制通路。設(shè)定P＜0.01，并按P值從小到大排序，獲取GO 功能富集分析中分子功能（MF）、細(xì)胞組成（CC）和生物過程（BP）的前10 個(gè)條目，以及KEGG 通路富集分析中的信號通路，并分別以條形圖和氣泡圖進(jìn)行可視化展示。

1.6 分子對接驗(yàn)證

在RCSB（https：// www. rcsb. org/）數(shù)據(jù)庫中下載核心靶點(diǎn)的立體結(jié)構(gòu)，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中獲得核心成分的立體結(jié)構(gòu)。應(yīng)用分子對接模擬軟件AutoDock 對degree 排名前10 的核心成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行受體-配體對接模擬計(jì)算，采用拉馬克遺傳算法進(jìn)行半柔性對接，設(shè)置運(yùn)行次數(shù)為50次，最大能量評價(jià)次數(shù)為2 500 000次，模擬得到最低結(jié)合能，驗(yàn)證二者能否較好地結(jié)合。

2 結(jié)果

2.1 藍(lán)芩口服液的潛在活性成分和作用靶點(diǎn)

檢索到藍(lán)芩口服液5 味組方藥材的522 個(gè)潛在活性成分和541 個(gè)作用靶點(diǎn)，篩選后得到119 個(gè)潛在活性成分，具體藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1（其中_qt 表示成分失糖苷鍵）。潛在活性成分中，板藍(lán)根39 個(gè)、黃芩36 個(gè)、梔子15 個(gè)、黃柏38 個(gè)、胖大海5 個(gè)，重復(fù)成分8 個(gè)（為多個(gè)藥材共有）。對藍(lán)芩口服液中活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，其中板藍(lán)根、黃芩、梔子、黃柏、胖大海對應(yīng)靶點(diǎn)分別有104，108，177，184，35個(gè)；去重后，共得到240個(gè)靶點(diǎn)。

表1 潛在活性成分的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.1 Pharmacokinetics parameters of potential active ingredients

2.2 藍(lán)芩口服液治療URTI 的潛在靶點(diǎn)

去重后得到URTI 靶點(diǎn)7 893 個(gè)，與藍(lán)芩口服液的作用靶點(diǎn)取交集，得共有靶點(diǎn)213 個(gè)，即為藍(lán)芩口服液治療URTI的潛在靶點(diǎn)，詳見圖1。

圖1 藍(lán)芩口服液對上呼吸道感染潛在作用靶點(diǎn)維恩圖Fig.1 Venn diagram of potential targets of Lanqin Oral Liquid in the treatment of URTI

2.3 中藥-成分-共有靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)

相應(yīng)網(wǎng)絡(luò)見圖2，共包括312 個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 727 條邊。根據(jù)degree 降序排列前10 的成分依次為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚、刺槐素、巴馬汀、N- 甲基蕓香堿、漢黃芩素、黃芩素和小檗堿，拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)見表2。

圖2 中藥-成分-共有靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Interaction network of TCM-ingredients-common targets-disease

表2 藍(lán)芩口服液核心活性成分拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)Tab.2 Topological properties of the core active ingredients of Lanqin Oral Liquid

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)

PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖3。圖中共涉及203 個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 653 條邊，其中節(jié)點(diǎn)越大degree越大，邊越粗評分越高，即關(guān)系越密切，顏色由藍(lán)變黃程度與degree 呈正相關(guān)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)進(jìn)一步分析可見，所有節(jié)點(diǎn)的degree中位數(shù)為12，按條件篩選出核心靶點(diǎn)44個(gè)，詳見圖4。

圖3 共有靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of common targets

圖4 核心靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)度值Fig.4 Node degree of core targets

2.5 富集分析

GO 功能富集分析結(jié)果見圖5。BP 主要涉及血管生成、上皮細(xì)胞增殖、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)、凋亡信號通路等；CC 主要涉及膜筏、囊泡內(nèi)腔、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等；MF 主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合等。

圖5 GO功能富集分析結(jié)果Fig.5 Results of GO function enrichment analysis

共獲得170 條重要信號通路富集結(jié)果，主要涉及白細(xì)胞介素17（IL - 17）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染等通路。氣泡圖見圖6。

圖6 KEGG通路富集分析結(jié)果Fig.6 Results of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接虛擬計(jì)算結(jié)果

分子對接結(jié)果見表3。分子對接結(jié)合能越小，表明分子間結(jié)合性越好。結(jié)果顯示，degree 排名前10 的核心靶點(diǎn)與核心活性成分均能較好地結(jié)合。

表3 藍(lán)芩口服液核心活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果（kJ/mol）Tab.3 Results of molecular docking between core active ingredients of Lanqin Oral Liquid and core targets（kJ/mol）

3 討論

本研究中通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測了藍(lán)芩口服液治療URTI 的主要活性成分和潛在作用機(jī)制。根據(jù)中藥-成分-共有靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)，槲皮素的degree最大，提示槲皮素在藍(lán)芩口服液治療URTI 過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。槲皮素為天然黃酮醇，同時(shí)存在于梔子和黃柏中，具有顯著的抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗腫瘤細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用［11］。有研究表明，槲皮素能通過阻斷流感病毒與細(xì)胞膜上血凝素（HA2）亞基的相互作用，抑制病毒-細(xì)胞融合、干擾病毒的侵入過程等對抗流感冒病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且其抗流感作用已經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證［12］。黃芩中的黃芩素和漢黃芩素也能通過抑制流感病毒復(fù)制發(fā)揮抗流感作用［13］。山柰酚等具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫的藥理作用［14］。以上研究結(jié)論充分證實(shí)了藍(lán)芩口服液治療URTI的物質(zhì)基礎(chǔ)。

通過構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，依據(jù)degree 篩選得到核心靶點(diǎn)，包括AKT1，TP53，MAPK1，MAPK8，JUN，IL - 6，TNF，EGFR 等，體現(xiàn)了中藥治療疾病的多靶點(diǎn)、多通路特性。AKT1 為絲氨酸- 蘇氨酸蛋白激酶，其磷酸化激活后參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、血管生成及細(xì)胞的增殖、代謝、遷移等多種細(xì)胞過程。有研究表明，AKT1 顯性陰性突變體可顯著抑制病毒RNA 的表達(dá)，降低病毒衣殼蛋白表達(dá)和病毒釋放［15］，而靶向PI3K/ AKT 的激酶抑制劑能顯著抑制中東呼吸綜合征冠狀病毒的復(fù)制。IL-6和TNF 則與免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和炎性反應(yīng)過程密切相關(guān)［16］。EGFR則在氣道上皮細(xì)胞的損傷和修復(fù)過程中發(fā)揮作用［17］?？梢?，藍(lán)芩口服液可通過抑制流感病毒復(fù)制、調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫、保護(hù)血管內(nèi)皮、減輕氣道損傷等機(jī)制治療UTRI。

GO 和KEGG 富集分析結(jié)果表明，藍(lán)芩口服液主要通過干預(yù)細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)等生物過程，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子活性、受體配體活性，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子等分子功能發(fā)揮作用。KEGG分析結(jié)果顯示，其治療作用涉及了IL-17 信號通路、TNF 信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染等通路。臨床研究顯示，血清IL - 17 水平與流感患兒的病情進(jìn)展密切相關(guān)，可作為診斷和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)［18］，其介導(dǎo)的信號通路在機(jī)體的自身免疫及對外來病原菌的免疫過程中都發(fā)揮了重要作用［19］。TNF/NF- κB 信號通路則在機(jī)體自身的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［20］，推測藍(lán)芩口服液可能通過抑制機(jī)體炎性反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，從而治療URTI。

本研究中構(gòu)建了藍(lán)芩口服液組方中藥-成分-共有靶點(diǎn)- 疾病的多層次網(wǎng)絡(luò)，初步探索了其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，但亦有一定的局限性，如探索結(jié)果未在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)中證實(shí)所得潛在活性成分和作用機(jī)制，且活性成分僅在體內(nèi)達(dá)到一定濃度才能成為藥效物質(zhì)，未測定活性成分的具體含量。未來將進(jìn)一步完善研究內(nèi)容和方法，明晰藍(lán)芩口服液的作用機(jī)制，從而使其能更好地應(yīng)用于臨床。