王 玥,董 聰,羅同陽,王慶慶,高慶華,王云鵬,唐兆宏,2,耿革霞

(1.河北省微生物研究所有限公司,河北 保定 071051;2.保定鮮爾康生物工程有限責任公司,河北 保定 071051;3.河北省藥品職業(yè)化檢查員總隊,河北 石家莊 050024)

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,EC1.1.3.4,簡稱GOD)是一種氧化還原酶,被廣泛應用于食品[1,2]、生物醫(yī)療[3]、飼料[4,5]等領(lǐng)域,是生物行業(yè)中重要工具用酶之一。目前面對市場的大量需求,尋找高酶活且穩(wěn)定性好的葡萄糖氧化酶迫在眉睫。

基因工程技術(shù)的發(fā)展既能實現(xiàn)其高效表達,也能改良其穩(wěn)定性。GOD 已被應用于多種表達系統(tǒng)中表達。劉春瑩等人[6]從海洋細菌中克隆葡萄糖氧化酶基因連接到表達載體 pET28a(+) 中,該重組載體在大腸桿菌 E.coli BL21(DE3) 中被成功表達,測定酶活為 2.04 U/mL。然而,通過原核表達系統(tǒng)表達的外源蛋白,常以二聚體的形式存在,一般沒有生物活性且酶活低,因此,目前 GOD 的異源表達多采用真核表達系統(tǒng),特別是巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達系統(tǒng)。畢赤酵母表達系統(tǒng)實現(xiàn)外源蛋白高通量表達的研究一直受到大量關(guān)注[7,8],GOD 在畢赤酵母表達體系中高效表達的策略有很多,如表達元件優(yōu)化,密碼子優(yōu)化,改造蛋白的分泌途徑,發(fā)酵條件優(yōu)化等[9],近年來共表達分子伴侶[10]和增加基因拷貝數(shù)[11]是實現(xiàn)GOD高表達的有效手段。而單因素優(yōu)化后蛋白分泌表達水平的提升不太明顯,利用組合優(yōu)化策略更能促進蛋白修飾,提高分泌水平,獲得高酶活的重組菌株[10,12,13]。Yu 等人[12]通過多拷貝篩選、共表達UPR激活因子(Hac1p)構(gòu)建出 GOD 高產(chǎn)菌株,并在1 L發(fā)酵罐(BMGY培養(yǎng)基)中優(yōu)化GOD 酶活高達2 125.3 U/mL,是目前文獻報道中的最高水平。

我們在前期工作中,構(gòu)建了共表達分子伴侶PDI-Ero1的工程菌株X33/pMD-GOD/pPICZ-PDI-Ero1,在10 L發(fā)酵罐中優(yōu)化誘導策略GOD 酶活為 736 U/mL[14],同時還構(gòu)建了表達載體pMD-AOX(含AOX 強啟動子和終止子,G418 抗性基因)、分子伴侶重組質(zhì)粒( pPICZB-HAC1n(n=1,2,3或4),pPICZB-PDIn(n=1,2,3或4))。在此基礎(chǔ)上,本文采用組合優(yōu)化的策略提高GOD在畢赤酵母中的表達,首先分別構(gòu)建了重組表達載體 pMD-AOX-GOD和多拷貝表達載體 pPICZαA-GODn(n=1-5),通過高濃度G418、博來霉素抗性篩選平板,得到 1株高表達GOD的重組菌。在此基礎(chǔ)上,分別構(gòu)建了HAC1、PDI 兩種分子伴侶1-4拷貝共表達重組菌株,進行高密度發(fā)酵,提高了GOD的高效表達和積累,對促進其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

黑曲霉(Aspergillusniger)菌株、畢赤酵母(Pichiapastoris)X33均由河北省微生物研究所有限公司保存;大腸桿菌EscherichiacoliTOP10 菌株購自天根生化科技有限公司;表達載體pMD-AOX(含AOX 強啟動子和終止子,G418 抗性基因)、分子伴侶重組質(zhì)粒pPICZB-HAC1n(n=1,2,3或4),pPICZB-PDIn(n=1,2,3或4)均由本實驗室構(gòu)建;表達載體pPICZαA購自優(yōu)寶生物公司。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

DNA聚合酶、連接酶、限制性內(nèi)切酶、蝦堿性磷酸酶rSAP等工具酶均購自NEB公司;其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純;PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自全式金生物科技公司;遺傳霉素(G418)、博來霉素(Zeocin) 均購自索萊寶生物科技有限公司;酵母基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自北京天根生物技術(shù)有限公司;引物合成和測序工作由北京中科希林生物科技有限公司完成(表1)。LB、MD、YPD、BMGY、YPCS、YPDS等培養(yǎng)基參照Invitrogen公司的畢赤酵母表達操作手冊配制。

表1 本文中所用的引物

1.2 實驗方法

1.2.1 表達載體pMD-AOX-GOD的構(gòu)建及畢赤酵母轉(zhuǎn)化

采用酵母基因組DNA提取試劑盒方法提取黑曲霉的基因組DNA。根據(jù)表1引物進行葡萄糖氧化酶基因的克隆,PCR反應條件:98 ℃ 5 min;98 ℃ 30 s,65 ℃ 60 s,72 ℃ 10 min,共30個循環(huán);72 ℃ 10 min;16 ℃ 30 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化回收后采用 GIBSON 方法連接到表達載體pMD-AOX中XhoⅠ、NotⅠ酶切位點上,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliTOP10。酶切驗證篩選出陽性克隆送測序,獲得質(zhì)粒pMD-AOX-GOD。

將表達載體 pMD-AOX-GOD經(jīng)PmeⅠ酶切線性化并回收后,電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母感受態(tài) X33 中,涂板于 MD 平板上,30 ℃培養(yǎng)2-3 d。用牙簽將MD平板生長的單菌落,分別點種至含 G418 梯度( 0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mg/mL) 的YPDS 平板上,30 ℃培養(yǎng) 3-5 d 后,觀察菌落生長情況,篩選重組菌株。

1.2.2 多拷貝表達載體的構(gòu)建及畢赤酵母轉(zhuǎn)化

根據(jù)表1引物進行葡萄糖氧化酶基因的克隆,PCR反應條件:98 ℃ 5 min;98 ℃ 30 s,62 ℃ 60 s,72 ℃ 10 min,共20個循環(huán);72 ℃ 10 min;16 ℃ 30 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化回收后采用 GIBSON 方法連接到表達載體pPICZαA中KpnⅠ、NotⅠ位點上,并轉(zhuǎn)化到E.coliTOP10。酶切驗證篩選出陽性克隆送去測序,獲得質(zhì)粒pPICZαA-GOD。

表達載體pPICZαA 的上游有BglⅡ 酶切位點,下游有BamHⅠ酶切位點,該載體經(jīng)BglⅡ/BamHⅠ雙酶切后會產(chǎn)生互補的粘性末端。利用BglⅡ、BamHⅠ 消化陽性載體,兩個表達框正向連接從而無法被切開,多拷貝表達載體即可再插入到BamHⅠ 酶切位點,重復插入含有5′ AOX1、目的片段和AOX1 TT 的表達框,由此來構(gòu)建多拷貝表達載體,如圖1所示。

圖1 多拷貝表達盒載體的構(gòu)建流程圖

將多拷貝表達載體利用BamHⅠ 酶切線性化,經(jīng)回收后分別電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33感受態(tài)中,涂板于含有 100 μg/mL Zeocin 抗性的YPDS平板上,30 ℃ 培養(yǎng) 2-3 d 篩選含多拷貝基因的重組菌株。

1.2.3 重組菌株的篩選

利用1.2.1和1.2.2方法獲得的轉(zhuǎn)化子點種至顯色篩選MM平板(Tryptone 20.0 g/L,Yeast extract 10.0 g/L,1%甲醇,2%瓊脂)上,30 ℃培養(yǎng)1 d,取出平板倒入顯色反應液(1% 鄰聯(lián)茴香胺溶液、3% 的90 U/mL辣根過氧化物酶、10%的18%葡萄糖溶液,1%瓊脂),30 ℃ 放置2 h后觀察顯色圈,篩選出棕色圈顏色深、面積大的菌株用于進一步試驗。將上述菌株接種于5 mL YPCS液體培養(yǎng)基中,30℃搖床培養(yǎng)20～24 h后OD600為10 左右,加入1% 甲醇,此后每隔24 h加入1% 甲醇誘導,誘導72 h后收菌,離心收集上清液,測定酶活。比較兩種方法,選擇酶活相對高且穩(wěn)定性較好的菌株作為第一代高產(chǎn)菌株(X33/AnGOD),并制備成感受態(tài)備用。

將分子伴侶HAC1,PDI多拷貝表達載體分別用BamHⅠ酶切線性化,電轉(zhuǎn)化至出發(fā)菌X33/AnGOD中,涂布于YPDS抗性篩選平板上,獲得陽性轉(zhuǎn)化子,分別命名為X33/AnGOD-HAC1n(n=1,2,3或4),X33/AnGOD-PDIn(n=1,2,3或4),試管水平測定GOD酶活。

1.2.4 重組表達菌株中基因拷貝數(shù)的檢測

熒光定量 PCR (RT-qPCR)方法參照 Takara 公司試劑盒(SYBR?Premix ExTaqTMkit)。儀器使用實時熒光定量PCR儀(Thermofisher QuantStutio 1),PCR 反應條件為: 50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min 后開始循環(huán); 95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 40 s,共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因,采用比較Ct值法(2-(ΔΔCt)法)分析確定重組菌株所含的基因拷貝數(shù)。使用的 RT-qPCR 引物見表1。

1.2.5 10 L 發(fā)酵罐高密度發(fā)酵

將采用組合優(yōu)化策略篩選出的重組菌株X33/AnGOD-PDI劃線培養(yǎng)。挑取單菌落接種于5 mL YPD 液體培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)12 h后按3%的接種量轉(zhuǎn)接至150 mL BMGY 培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)至菌液OD600≈8～10接種于發(fā)酵罐中。10 L發(fā)酵罐中含有4.5 L BSM 培養(yǎng)基,發(fā)酵罐滅菌后以10% 發(fā)酵體積(5 L)進行接種,采用濃氨水自動流加以控制發(fā)酵期間 pH 值,發(fā)酵溫度設(shè)置為30 ℃。具體發(fā)酵過程分為菌體培養(yǎng)階段、碳源飼喂階段、饑餓培養(yǎng)階段和誘導表達階段等4個階段,具體方法參見Invitrogen手冊。每隔12 h 檢測OD600、GOD活性,同時采用SDS-PAGE 檢測表達量的累積。

1.2.6 葡萄糖氧化酶的酶活測定

GOD活性測定方法參照文獻[14],采用鄰-聯(lián)(二)茴香胺分光光度法。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組表達載體 pMD-AOX-GOD的構(gòu)建及陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

2.1.1 重組表達載體 pMD-AOX-GOD的構(gòu)建

按照1.2.1方法構(gòu)建重組表達載體pMD-AOX-GOD,目的基因PCR和酶切驗證結(jié)果如圖2所示,目的基因PCR得到大小約 1 700 bp 的目的片段,用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切質(zhì)粒后得到1 700 bp和5 900 bp兩個片段,均與理論值相符,重組表達載體構(gòu)建成功。

圖2 葡萄糖氧化酶的·PCR·擴增和重組質(zhì)粒 pMD-AOX-GOD酶切鑒定

2.1.2 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

一般情況下,整合到畢赤酵母基因組中的拷貝數(shù)越多重組菌株的抗性濃度會越高,這樣可以通過不同抗性濃度的平板來篩選不同拷貝數(shù)的重組菌株[15]。利用不同 G418 濃度對重組質(zhì)粒 pMD-AOX-GOD在畢赤酵母X33感受態(tài)中進行轉(zhuǎn)化子的篩選,通過不同抗性濃度以期得到不同拷貝數(shù)的重組菌株。篩選平板上G418的濃度分別為 0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mg/mL,2-3 d 后1.00 mg/mL濃度以下的長出數(shù)量不一的單菌落,2.00 mg/mL G418 條件下3 d后開始生長零星菌落,并且菌落總數(shù)隨著抗性濃度增加而減少,菌落也越來越小。望松柏等人[16]研究發(fā)現(xiàn)卡氏德巴利酵母植酸酶重組菌株在 G418 濃度為 2.00 mg/mL 條件下無法生長。Aw等人[17]的研究也發(fā)現(xiàn)高濃度 G418 會影響單菌落生長,這往往是初始抗性壓力過大造成的。

挑取部分重組菌株進行試管水平發(fā)酵,甲醇誘導72 h后測定發(fā)酵上清液的GOD酶活(圖3),重復3次結(jié)果顯示在G418濃度為1.00 mg/mL的平板上篩選出一株GOD酶活高且穩(wěn)定性好的菌株。

圖3 篩選重組菌株發(fā)酵上清液的酶活檢測

利用熒光定量PCR方法[18]測定該重組菌株中GOD基因拷貝數(shù)為4,高密度甲醇發(fā)酵誘導 120 h 后GOD酶活力達 426 U/mL,該菌株作為第一代高產(chǎn)量GOD重組菌,命名為 X33/AnGOD,制備成感受態(tài)備用。

2.2 基因多拷貝表達載體的構(gòu)建及陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

2.2.1 多拷貝表達載體的構(gòu)建

多表達盒載體的構(gòu)建參照方法1.2.2,利用同尾酶BamHⅠ和BglⅡ 對pPICZαA-GOD進行雙酶切,回收一段含有醇氧化酶基因啟動子( 5′AOX1)、α-factor 信號因子、目的基因(god)和醇氧化酶基因終止子(3′AOX1) 的順式作用元件,同時,用BamHⅠ對pPICZαA-GOD進行單酶切,將獲得的線性片段與表達盒片段連接轉(zhuǎn)化,篩選陽性克隆,通過雙酶切對含有2拷貝表達盒的重組表達載體pPICZαA-GOD2進行驗證(圖4(a))。利用BamHⅠ/BglⅡ?qū)PICZαA-GOD2雙酶切,獲得2拷貝表達盒片段,將其與用BamHⅠ酶切線性化的pPICZαA-GOD2連接,獲得含有4拷貝表達盒的重組表達載體 pPICZαA-GOD4,用同樣的方法對其驗證。使用同樣的方法改造、構(gòu)建和驗證含有3拷貝、5拷貝表達盒的重組表達載體pPICZαA-GOD3、pPICZαA-GOD5。如圖4(b)所示,用BamHⅠ/BglⅡ 對pPICZαA-GODn(n=1-5)雙酶切后,分別在位置3.4 kb、6.8 kb、10.0 kb、13.6 kb、17.0 kb有5個片段,與理論值相符。結(jié)果表明已成功構(gòu)建多拷貝表達盒表達載體。

圖4 多拷貝表達載體的酶切檢測

2.2.2 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

將含有多拷貝表達盒的重組表達載體pPICZαA-GODn(n=1-5)分別用BamHⅠ 酶切線性化,分別電擊轉(zhuǎn)化后涂布于Zeocin抗性平板上,篩選含多拷貝基因的轉(zhuǎn)化子。每個基因劑量選取部分菌株進行測定,其拷貝數(shù)目分別為1～5。挑取部分轉(zhuǎn)化子測定試管發(fā)酵水平的酶活,用 SDS-PAGE 蛋白電泳檢測分析發(fā)酵上清液中的蛋白。結(jié)果如圖5所示,隨著基因拷貝表達盒數(shù)量的增加,GOD 酶活力逐漸增加,4拷貝轉(zhuǎn)化子酶活性最高,約為1拷貝重組菌株的3倍,但是,5拷貝GOD酶活反而下降了,說明在一定范圍內(nèi),基因拷貝數(shù)的增加可以提高酶活水平。4拷貝基因重組菌株高密度甲醇發(fā)酵誘導 120 h 后GOD酶活力達 373 U/mL。

圖5 拷貝數(shù)對蛋白表達水平的影響

結(jié)果表明,隨著基因表達盒數(shù)量的增加,GOD 酶活逐漸增加,4拷貝轉(zhuǎn)化子酶活性最高,但5拷貝GOD酶活出現(xiàn)下降,甚至低于3拷貝。這說明一定數(shù)量的基因拷貝數(shù)會增加外源蛋白的表達量,但拷貝數(shù)過多會影響外源蛋白的表達水平。Jiao等人[19]研究脂肪酶在畢赤酵母中高效表達時發(fā)現(xiàn),基因拷貝數(shù)多于5個后脂肪酶的表達水平出現(xiàn)降低。陳姍姍[20]通過構(gòu)建多拷貝串聯(lián)hLYZ基因轉(zhuǎn)化重組子研究人源溶菌酶在畢赤酵母中的高效表達,發(fā)現(xiàn)多拷貝重組子的溶菌酶表達性能較低。Wu等人[21]研究在畢赤酵母中高水平分泌HSA/GH融合蛋白時構(gòu)建了1～7拷貝的重組菌株,發(fā)現(xiàn)含2～3個HSA/GH基因拷貝的轉(zhuǎn)化子蛋白表達量顯著增加,與7拷貝無顯著差異。這是由于隨著基因拷貝數(shù)的增加,mRNA翻譯,蛋白質(zhì)折疊可能受到了限制,大量未折疊或者錯誤折疊的蛋白積累,從而產(chǎn)生負反饋作用[22,23],因此,蛋白折疊分泌的研究也十分重要。

2.3 多拷貝分子伴侶共表達重組菌株的篩選及鑒定

將多拷貝HAC1、PDI表達載體分別用BamHⅠ酶切線性化,電擊轉(zhuǎn)化至X33/AnGOD 感受態(tài)后涂布于含G418和Zeocin 的雙抗篩選平板上得到轉(zhuǎn)化子。挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行試管水平誘導發(fā)酵,用1% 甲醇誘導3 d,發(fā)酵上清液測定GOD酶活力。結(jié)果如圖6 所示,不同拷貝數(shù)的分子伴侶共表達重組菌株的GOD酶活,隨著分子伴侶拷貝數(shù)的增加呈現(xiàn)出上升的趨勢,但是超過一定的拷貝數(shù)后GOD酶活反而下降。其中,2拷貝的HAC1共表達重組菌株GOD酶活最高,比出發(fā)菌株提高67% ;1 拷貝的PDI共表達重組菌株GOD酶活最高,比出發(fā)菌株提高128%,將該菌株作為第二代高產(chǎn)量GOD重組菌,命名為X33/AnGOD-PDI。實驗結(jié)果表明適當增加分子伴侶的拷貝數(shù)可以提高酶活。利用RT-qPCR 檢測方法測定共表達重組菌株中分子伴侶HAC1、PDI的基因拷貝數(shù),結(jié)果顯示共表達重組菌株中分子伴侶HAC1、PDI的基因拷貝數(shù)符合預期。

圖6 共表達分子伴侶對GOD表達水平的影響

很多參與蛋白折疊的分子伴侶已經(jīng)被驗證可以提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達水平,如蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶 PDI[24-26]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶 Ero1[24,27]、UPR 調(diào)節(jié)因子HAC1[6,28]等。通過整合分子伴侶蛋白以期提高GOD表達,結(jié)果顯示與前人研究成果一致,整合分子伴侶的重組菌株 GOD酶活均比出發(fā)菌株高。

2.4 10 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵試驗

將第一代菌株 X33/AnGOD 和整合分子伴侶PDI 的第二代菌株 X33/AnGOD-PDI 按上述條件進行10 L 發(fā)酵罐高密度放大培養(yǎng)。發(fā)酵上清液檢測GOD酶活(圖7),整合分子伴侶的菌株GOD酶活較第一代菌株有很大提高,第一代重組菌株在發(fā)酵結(jié)束時酶活為537 U/mL(圖7(a)),而整合分子伴侶PDI的重組菌株發(fā)酵誘導 156 h 后酶活達到 1 198 U/mL,提高123%(圖7(b))。

圖7 在10 L發(fā)酵罐中的生長曲線和酶活力分析

3 結(jié)論

本研究利用抗生素濃度梯度、體外多拷貝構(gòu)建篩選獲得了第一代高產(chǎn)GOD重組菌株,以此為基礎(chǔ),本研究首次構(gòu)建了分子伴侶HAC1、PDI多拷貝共表達重組菌株,1 拷貝的PDI共表達重組菌株X33/AnGOD-PDI中 GOD 表達量比出發(fā)菌株提高128%。通過10 L 發(fā)酵罐高密度發(fā)酵,酶活達到1 198 U/mL,與出發(fā)菌株相比,其發(fā)酵生產(chǎn) GOD 的能力顯著增加,表達量提高123%。使用的發(fā)酵培養(yǎng)基為BSM培養(yǎng)基,提高重組菌株中GOD酶活的同時大大降低了發(fā)酵成本,適宜大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。