劉 薇,劉改娟,邢龍龍,強(qiáng)亞欣,王麗珊,呂貫廷

(1.河北省健海生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司,河北 石家莊 050035;2.河北健海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050035)

0 引言

水通道蛋白4(aquaporin-4,AQP4)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,主要介導(dǎo)腦組織中水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)。2004年,Lennon等人[1]證實(shí)了在視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitisoptica,NMO)患者血清中存在一種自身抗體NMO-IgG,該抗體可與腦組織中病變的微血管、軟腦膜等部位特異性結(jié)合,進(jìn)而導(dǎo)致視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病的發(fā)生。隨后,該特異性抗體被證實(shí)即為AQP4-IgG抗體。隨著研究進(jìn)一步深入,AQP4-IgG抗體檢測開始應(yīng)用于視神經(jīng)脊髓炎的臨床輔助診斷。在2021版的《視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病診斷與治療指南》中提到,AQP4-IgG 是具有高度特異性的診斷標(biāo)志物,特異度高達(dá)90%,敏感度約70%,并且指南中推薦使用基于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的免疫熒光技術(shù)(cell based transfection immunofluorescence assay,CBA)或流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行血清檢測[2]。

本研究即利用診療指南中提到的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了AQP4過表達(dá)細(xì)胞系,之后應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù),建立了樣本中AQP4-IgG抗體的檢測流程,并對2021年1月至2022年12月本實(shí)驗(yàn)室收檢的2 241例樣本進(jìn)行了AQP4-IgG抗體檢測,之后將檢測結(jié)果進(jìn)行分析匯總,分析了AQP4-IgG抗體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的陽性率及男女發(fā)病占比,并探討了該抗體在視神經(jīng)脊髓炎診療中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2021年1月至2022年12月本實(shí)驗(yàn)室接收的2 241例送檢AQP4-IgG抗體的血清及腦脊液樣本。男女比例1∶1.28,平均年齡50.44±14.73。

1.2 儀器與設(shè)備

力康HealForce二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、力康HFsafe1200LC生物安全柜、ZHCHENG恒溫振蕩培養(yǎng)搖床、BioPard隔水式培養(yǎng)箱、奧林巴斯OLYMPUS BX51熒光顯微鏡等。

1.3 方法

1.3.1 基因合成

在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找AQP4-M23(NM_001364286.1)基因的mRNA序列,由南京金斯瑞公司進(jìn)行基因序列的合成,質(zhì)粒載體選用pcDNA3.1(+)-C-eGFP。

1.3.2 質(zhì)粒提取及驗(yàn)證

將基因合成后的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌TOP10,涂板氨芐培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),挑取陽性單克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),收集菌體,使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(天根DP118-02)對構(gòu)建的重組表達(dá)載體進(jìn)行質(zhì)粒提取。

提取后的質(zhì)粒進(jìn)行 NheI 和 EcoRV 雙酶切,37 ℃,15 min,80 ℃,20 min使酶失活,酶切體系見表1。同時(shí)提取的質(zhì)粒送擎科生物公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

表1 雙酶切體系

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

培養(yǎng)Hek293(人胚腎細(xì)胞)細(xì)胞,達(dá)80%～90%融合時(shí),使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑,按照說明書中步驟轉(zhuǎn)染AQP4基因表達(dá)質(zhì)粒。48 h后,觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.3.4 細(xì)胞固定、通透及爬片封閉

取出轉(zhuǎn)染率達(dá)到60%的細(xì)胞,使用4% 多聚甲醛對細(xì)胞進(jìn)行結(jié)構(gòu)固定,使用0.2% TritonX-100進(jìn)行細(xì)胞通透,使用3% BSA對細(xì)胞爬片進(jìn)行封閉處理。

1.3.5 一抗驗(yàn)證細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況

將處理好的細(xì)胞爬片與兔單克隆AQP4-IgG抗體(Abcame 貨號:ab259318)35 ℃孵育1 h,PBST洗3次后,加入第二抗體TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG (Abcame 貨號:ab6718)35 ℃孵育1 h,PBST洗3次后,滴加DAPI封片劑,熒光顯微鏡觀察,驗(yàn)證轉(zhuǎn)染及蛋白表達(dá)情況。

1.3.6 樣本檢測

將血清樣本1∶10稀釋,腦脊液1∶1,與處理后的細(xì)胞片孵育1 h,PBS緩慢清洗3遍,使用Cy3標(biāo)記的抗人IgG抗體(Jacksonimmuno貨號:109-165-003)與細(xì)胞爬片孵育1 h,PBST洗3遍,取出細(xì)胞爬片,滴加DAPI封片劑,熒光顯微鏡觀察并判讀記錄結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示,年齡平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示,男女組間采用χ2方檢驗(yàn)以(n(%))表示,p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建驗(yàn)證結(jié)果

對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,測序驗(yàn)證,如圖1所示。圖1中酶切后的片段大于6 000 bp左右的為質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)-C-eGFP(6 176 bp),小于1 000 bp的是AQP4的mRNA序列(906 bp)。同時(shí),將質(zhì)粒送檢測序,分析序列結(jié)果與理論序列比對符合率100%。

Lane M: KB Ladder

2.2 一抗驗(yàn)證轉(zhuǎn)染及蛋白表達(dá)結(jié)果

由于質(zhì)粒載體中構(gòu)建有EGFP蛋白,因此轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞會在熒光顯微鏡的藍(lán)色激發(fā)組(420～485 nm)顯示綠色熒光,在熒光顯微鏡下觀測時(shí),可以通過綠色熒光細(xì)胞的比例,分析出轉(zhuǎn)染效率。另外,使用第一抗體與細(xì)胞孵育,加入紅色熒光標(biāo)記的第二抗體,在顯微鏡綠色激發(fā)組(460～550 nm)下會顯示出紅色熒光,且紅綠熒光可以相對應(yīng),如圖2所示。

圖2 AQP4-IgG抗體驗(yàn)證轉(zhuǎn)染細(xì)胞中AQP4蛋白的表達(dá)

2.3 細(xì)胞法間接免疫熒光陽性樣本反應(yīng)結(jié)果

與上述同理,轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞在藍(lán)色激發(fā)組(420～485 nm)顯示綠色熒光,當(dāng)待檢測樣本中含有AQP4-IgG抗體時(shí)(陽性樣本),會與轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的AQP4蛋白結(jié)合,進(jìn)而通過Cy3標(biāo)記的抗human-IgG 第二抗體結(jié)合,在熒光顯微鏡的綠色激發(fā)組(460～550 nm)下顯示出紅色熒光。且綠色熒光與紅色熒光位置相對應(yīng)。當(dāng)待測樣本中不含有AQP4-IgG抗體時(shí)(陰性樣本),僅能看到細(xì)胞表達(dá)的EGFP綠色熒光,無紅色熒光,如圖3所示。

圖3 細(xì)胞片熒光圖(綠色熒光+紅色熒光+疊加)

2.4 不同年齡及性別陽性分布情況

對本實(shí)驗(yàn)室收檢的2 241例樣本進(jìn)行細(xì)胞法間接免疫熒光檢測,總抗體陽性率為16.15%(362例),男性陽性率為5.8%(57例),女性陽性率為24.23%(305例),男女組間比較采用卡方檢驗(yàn),χ2=138.22,p<0.05,組間差異顯著,即女性發(fā)病率明顯高于男性。平均發(fā)病年齡為50.44±14.73。其中男性平均發(fā)病年齡51.35±16.82,女性平均發(fā)病年齡50.28±14.33,詳見表2。

表2 樣本陽性率統(tǒng)計(jì)

3 討論

視神經(jīng)脊髓炎是一種自身免疫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,具有急性或亞急性脫髓鞘癥狀,可侵犯視神經(jīng)與脊髓,單發(fā)或復(fù)發(fā)視神經(jīng)炎和橫貫性脊髓炎。在臨床癥狀上,視神經(jīng)脊髓炎與多發(fā)性硬化有較多相似之處,但治療原則存在較大差異,因此,視神經(jīng)脊髓炎早期且準(zhǔn)確的診斷,對患者的有效治療意義重大。隨著免疫病理學(xué)等學(xué)科的不斷發(fā)展,水通道蛋白4抗體被證實(shí)與視神經(jīng)脊髓炎的發(fā)生和發(fā)展有重要關(guān)系,通過測定患者血清和腦脊液中的抗水通道蛋白4抗體有助于視神經(jīng)脊髓炎的早期發(fā)現(xiàn)及診斷[3]。在2021版的《視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病診斷與治療指南》中提出,AQP4-IgG是具有高度特異性的診斷標(biāo)志物,NMOSD中約70%～80%患者AQP4-IgG表達(dá)陽性[2]。

水通道蛋白4是由Jung等人[4]于1994年利用水通道蛋白家族的同源性克隆分離獲得,結(jié)構(gòu)如圖4所示。該蛋白位于細(xì)胞膜上,其單體由8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)(M1-M8)組成了5個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu),有3個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)(A、C、E)位于細(xì)胞外,兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)(B、D)及羧基、氨基末端位于細(xì)胞內(nèi),其中 B、E 環(huán)含有高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)重復(fù)串聯(lián)序列,2個(gè)NPA環(huán)折返進(jìn)出細(xì)胞膜的雙分子層,構(gòu)成了親水通道[5]。AQP4在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)豐富,尤其在腦實(shí)質(zhì)與腦室、蛛網(wǎng)膜下腔中腦脊液間的界面處表達(dá)水平較高[3]。研究表明,AQP4的功能主要是促進(jìn)水在血液和大腦之間以及腦和腦脊液(腦脊液)隔間之間的轉(zhuǎn)運(yùn)。作為一種雙向通道蛋白,AQP4在缺血或中毒造成的細(xì)胞毒性水腫時(shí),在血腦屏障完整的情況下,可以促進(jìn)水腫的形成,而在血管源性和間質(zhì)性水腫時(shí),在血腦屏障已被破壞的情況下,可以清除過多腦積水[6]。

圖4 水通道蛋白4結(jié)構(gòu)

研究證實(shí),AQP4-IgG主要是IgG1類抗體[7],該抗體在視神經(jīng)脊髓炎患者體內(nèi)的作用機(jī)制是抗體可與星形細(xì)胞足突表面的AQP4蛋白的胞外段以三維構(gòu)象的形式非線性結(jié)合,激活補(bǔ)體,進(jìn)而形成膜攻擊復(fù)合物,損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),視神經(jīng)、脊髓及其他腦組織中AQP4的表達(dá)顯著高于外周組織,并且可聚集形成體積更大的復(fù)合結(jié)構(gòu),更容易被抗體識別[8]。

鑒于AQP4抗體的檢測對于視神經(jīng)脊髓炎的及早診斷具有重要意義,研究者開始重點(diǎn)關(guān)注陽性檢出率高且靈敏度好的檢測方法。現(xiàn)有的抗AQP4抗體檢測方法主要有:基于組織的間接免疫熒光法(TBA)、基于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的間接免疫熒光法(CBA)、酶聯(lián)免疫吸附法 (enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。以上方法在實(shí)際應(yīng)用中,各有利弊,TBA和CBA法保證了蛋白的天然構(gòu)象,但操作相對復(fù)雜。在陽性檢出率方面,三種方法相比,CBA法的陽性檢出率和靈敏度最高。ELISA法較為敏感,但特異度有所降低,指南不推薦作為確立診斷的檢測方法,但在縱向監(jiān)測抗體滴度對疾病進(jìn)展和治療的評估方面有一定的價(jià)值[3]。我國學(xué)者李敏等人[9]研究也發(fā)現(xiàn),在檢測視神經(jīng)脊髓炎患者血清標(biāo)本和腦脊液標(biāo)本中的AQP4-IgG抗體時(shí),CBA法的陽性檢出率分別為73.1%和 85.1%,IIF的陽性檢出率次之,ELISA的陽性檢出率較低。結(jié)果表明,應(yīng)將CBA法作AQP4抗體檢測的優(yōu)選方法。

在本研究中,建立了基于細(xì)胞學(xué)的間接免疫熒光法檢測方案,該方法可通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方式,在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)AQP4蛋白,既保證了蛋白的天然構(gòu)象,又提高了蛋白的表達(dá)量,保證了檢測的靈敏度,在本實(shí)驗(yàn)室的臨床樣本檢測中表現(xiàn)出良好的檢測性能。

綜上,AQP4-IgG抗體的檢測已經(jīng)成為NMOSD的診斷、治療和預(yù)后的重要參考指標(biāo)。不斷提高 AQP4-IgG 檢驗(yàn)方法的靈敏度也成為研究者重點(diǎn)關(guān)注的問題,尤其是在疾病早期,及時(shí)輔助醫(yī)生做出準(zhǔn)確的診斷,為患者提供最佳治療時(shí)機(jī),在臨床應(yīng)用中具有重要意義。