■ 艾春曉 孫曉穎 袁建敏

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

淀粉是肉雞飼糧中的主要能量來(lái)源，幼齡肉雞因消化器官發(fā)育不完善導(dǎo)致淀粉利用率低，提高幼齡肉雞淀粉的利用對(duì)于肉雞的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。研究認(rèn)為，添加淀粉酶能顯著提高肉雞的淀粉和能量消化率，促進(jìn)葡萄糖吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌，從而改善肉雞生長(zhǎng)性能[1-2]。但淀粉酶的添加效果受肉雞日齡、玉米粒硬度及干燥溫度和淀粉酶來(lái)源及添加水平等影響[3-6]。日糧中支鏈淀粉包含α-1,4糖苷鍵和α-1,6 糖苷鍵。α-1,4 淀粉酶僅能夠水解直鏈淀粉和支鏈淀粉中的α-1,4 糖苷鍵；糖化酶既可以水解α-1,4 糖苷鍵，也可以水解α-1,6 糖苷鍵；普魯蘭酶能水解支鏈淀粉α-1,6 糖苷鍵[7]。此外，產(chǎn)淀粉酶乳酸菌能分泌淀粉酶水解淀粉[8]。因此，本研究通過(guò)在肉雞日糧中分別添加α-淀粉酶、糖化酶和普魯蘭酶以及產(chǎn)α-淀粉酶乳酸菌來(lái)比較不同種類(lèi)淀粉酶和產(chǎn)酶乳酸菌對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、淀粉消化率、內(nèi)源酶活性、血清生化指標(biāo)等的影響效果，以期為肉雞日糧淀粉酶的合理設(shè)計(jì)和應(yīng)用提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及材料

AA 肉仔雞公雛購(gòu)買(mǎi)于北京家禽育種有限公司；α-淀粉酶（4 000 U/g，水解α-1,4 糖苷鍵）、普魯蘭酶（2 000 U/g，水解α-1,6 糖苷鍵）、糖化酶（27×105U/g，水解α-1,4 糖苷鍵和α-1,6 糖苷鍵）來(lái)源于某公司；乳酸菌（LAB1）（產(chǎn)α-淀粉酶，淀粉酶活性153.16 U/mL）為實(shí)驗(yàn)室前期篩選[9]。

1.2 試驗(yàn)分組與飼糧

本試驗(yàn)采用完全隨機(jī)分組，選取4 日齡健康A(chǔ)A肉雞公雛560 只，試驗(yàn)共分為5 個(gè)處理，每個(gè)處理8 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)14 只雞。試驗(yàn)期為18 d，對(duì)照組為基礎(chǔ)飼糧，不添加酶制劑；試驗(yàn)組為在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上分別添加600 U/kgα-淀粉酶、100 U/kg普魯蘭酶、1 000 U/kg糖化酶和2×109CFU/L產(chǎn)淀粉酶乳酸菌（LAB1，飲水添加）。

試驗(yàn)采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧（見(jiàn)表1），參照中國(guó)雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 33—2004）配制，每組淀粉酶加入預(yù)混料中逐級(jí)混合后，與玉米豆粕等大料混合，蒸汽制粒。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理

采用網(wǎng)上平養(yǎng)方式進(jìn)行飼養(yǎng)，飲水器為乳頭式供水，每天08：00、17：00 各飼喂一次，保證肉雞自由采食。在7 日齡和21 日齡進(jìn)行新城疫疫苗和傳支二聯(lián)疫苗免疫，7 日齡采用滴鼻點(diǎn)眼，21 日齡采用加倍量飲水免疫。環(huán)境溫度、相對(duì)濕度和光照嚴(yán)格執(zhí)行飼養(yǎng)手冊(cè)要求。

1.4 樣品采集

在21 日齡時(shí)，對(duì)肉雞進(jìn)行8 h 饑餓處理，稱(chēng)取每組雞體重和剩余料重，每個(gè)重復(fù)選取三只接近平均體重的肉雞并繼續(xù)飼喂，3 h 后對(duì)其中一只肉雞進(jìn)行翅靜脈采血，靜置析出血清后，離心，分離血清于-20 ℃冰箱冷凍保存；對(duì)另兩只肉雞進(jìn)行戊巴比妥鈉麻醉屠宰，采集空腸及回腸食糜，于-80 ℃冰箱冷凍保存，用于淀粉消化率的測(cè)定。取胰腺組織，于-80 ℃冰箱冷凍保存，用于內(nèi)源消化酶基因表達(dá)的測(cè)定。取空腸、回腸組織，于-80 ℃冰箱冷凍保存，用于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的測(cè)定。取空腸、回腸黏膜，于-80 ℃冰箱冷凍保存，用于黏膜二糖酶活性的測(cè)定。稱(chēng)取肝臟、胰腺、肌胃的重量，用于器官相對(duì)重量的計(jì)算。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 生長(zhǎng)性能

分別在于試驗(yàn)第1、11、18天時(shí)，空腹8 h后以重復(fù)為單位稱(chēng)重，并稱(chēng)量剩余飼料量，計(jì)算4～14 日齡、15～21日齡和4～21日齡的體增重、采食量、料重比（F/G）。

1.5.2 淀粉消化率

將空腸食糜和回腸食糜冷凍干燥，粉碎過(guò)40 目篩，測(cè)定酸不溶灰分、總淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、抗性淀粉含量，并以酸不溶灰分作內(nèi)源指示劑，計(jì)算其消化率。酸不溶灰分測(cè)定方法參考張麗英主編《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》[10]。總淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、抗性淀粉采用試劑盒（試劑盒編號(hào)為K-TSTA、K-AMYL、K-RSTAR，Megazyme 公司）測(cè)定。同時(shí)，也采取同樣方法測(cè)定飼料中相關(guān)物質(zhì)含量。

式中：IDC——飼料養(yǎng)分消化率（%）；

IF——飼料中指示劑含量（%）；

If——回腸食糜中指示劑含量（%）；

NF——飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量（%）；

Nf——回腸食糜中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量（%）。

1.5.3 器官相對(duì)重量

計(jì)算胰腺、肌胃和肝臟相對(duì)重量。

器官相對(duì)重量（%）=器官絕對(duì)重量（g）/活體重（g）×100

1.5.4 血清生化指標(biāo)

血清甲狀腺素（T4）、三碘甲狀原氨素（T3）、胰島素（INS）、胰高血糖素（GCG）含量由北京北方生科醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司采用放免法測(cè)定；血清葡萄糖（GLU）、三酰甘油（TG）含量采用試劑盒（試劑盒編號(hào)為F006、A110-1，南京建成生物工程研究所有限公司）測(cè)定。

1.5.5 消化道酶活性

腸道二糖酶（蔗糖酶、麥芽糖酶）活性均采用試劑盒（試劑盒編號(hào)為A082-2、A082-3，南京建成生物工程研究所有限公司）測(cè)定。樣品的預(yù)處理、試劑的配制和實(shí)驗(yàn)操作均按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.5.6 mRNA表達(dá)量

胰腺淀粉酶和蛋白酶基因以及腸道葡萄糖和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因引物序列見(jiàn)表2。采用Trizol一步抽提法提取胰腺、空腸及回腸組織樣的總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建立各樣品RNA 的cDNA，以β-actin管家基因作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)胰腺淀粉酶（AMY2A）和蛋白酶（PRSS2 與PRSS3）以及腸道SGLT1、GLUT2、B0AT1、EAAT3、ATB、CAT1、y+LAT1和LAT1基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表2 引物序列號(hào)

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用Duncan’s法多重比較，結(jié)果以平均數(shù)表示，以P＜0.05表示差異顯著?！癙”表示5個(gè)處理組之間的差異，“P酶”表示對(duì)照組與添加淀粉酶（α-淀粉酶、普魯蘭酶、糖化酶）處理組的差異，“P菌”表示對(duì)照組與添加乳酸菌組的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)性能

由表3 可知，與其他添加劑相比，外源添加產(chǎn)淀粉酶乳酸菌LAB1 會(huì)顯著降低肉雞4～14 日齡的采食量以及料重比（P＜0.05），并降低4～21 日齡料重比（P＜0.05），對(duì)肉雞各個(gè)階段的體重和體增重沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。

表3 不同種類(lèi)淀粉酶和產(chǎn)淀粉酶乳酸菌對(duì)肉雞4～21 日齡生長(zhǎng)性能的影響

2.2 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率

由表4 可知，與無(wú)添加劑相比，添加普魯蘭酶和糖化酶顯著降低了21 日齡肉雞空腸總淀粉消化率和支鏈淀粉消化率（P＜0.05），二者之間沒(méi)有顯著差異；普魯蘭酶顯著降低回腸抗性淀粉消化率（P＜0.05）；糖化酶會(huì)顯著降低肉雞回腸直鏈淀粉消化率（P＜0.05），但顯著提高回腸抗性淀粉消化率（P＜0.05）。與無(wú)添加劑相比，添加LAB1 除顯著提高肉雞回腸抗性淀粉消化率（P＜0.05）外，對(duì)其他腸段淀粉消化率沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。

表4 不同種類(lèi)淀粉酶和產(chǎn)淀粉酶乳酸菌對(duì)21日齡肉雞腸道淀粉消化率的影響(%)

2.3 消化酶活性與基因表達(dá)

由表5可知，與無(wú)添加劑相比，α-淀粉酶、糖化酶和LAB1 能夠顯著降低肉雞空腸黏膜麥芽糖酶活性（P＜0.05），且添加糖化酶能顯著提高回腸黏膜麥芽糖酶活性（P＜0.05）。除此以外，添加不同種類(lèi)淀粉酶及LAB1對(duì)空腸食糜和胰腺中的淀粉酶、胰蛋白酶、蔗糖酶活性均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表5 不同種類(lèi)淀粉酶和產(chǎn)淀粉酶乳酸菌對(duì)21日齡肉雞腸道消化酶活性的影響(U/mg prot.)

由表6 可知，與無(wú)添加劑相比，添加LAB1 對(duì)肉雞內(nèi)源消化酶基因表達(dá)量無(wú)顯著性影響（P＞0.05），但添加不同種類(lèi)的淀粉酶使肉雞胰腺淀粉酶（AMY2A）和蛋白酶Ⅰ（PRSS2）的基因表達(dá)量呈降低趨勢(shì)（0.05＜P＜0.1），對(duì)胰腺蛋白酶Ⅱ（PRSS3）的基因表達(dá)量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表6 不同種類(lèi)淀粉酶和產(chǎn)淀粉酶乳酸菌對(duì)21日齡肉雞內(nèi)源消化酶基因表達(dá)量的影響

2.4 消化器官相對(duì)重量

由表7可知，與無(wú)添加劑相比，添加淀粉酶并沒(méi)有對(duì)消化器官相對(duì)重量產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）；而添加LAB1能夠顯著提高21日齡肉雞肌胃和肝臟的相對(duì)重量（P＜0.05）（表7）。

表7 不同種類(lèi)淀粉酶和產(chǎn)淀粉酶乳酸菌對(duì)21日齡肉雞消化器官相對(duì)重量的影響(%)

2.5 血清生化指標(biāo)

由表8可知，與無(wú)添加劑相比，添加α-淀粉酶、糖化酶和LAB1 會(huì)顯著提高肉雞血清中T4 的含量（P＜0.05），而對(duì)肉雞血清中葡萄糖、三酰甘油、T3、胰島素和胰高血糖素的含量均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表8 不同種類(lèi)淀粉酶和產(chǎn)淀粉酶乳酸菌對(duì)21日齡肉雞血清生化指標(biāo)的影響

2.6 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)

由表9 可知，與無(wú)添加劑相比，肉雞飼料中添加α-淀粉酶會(huì)顯著降低21日齡肉雞回腸LAT1的基因表達(dá)量（P＜0.05）；添加普魯蘭酶能夠顯著提高回腸SGLT1基因表達(dá)量，并顯著降低空腸SGLT1基因以及回腸LAT1基因表達(dá)量（P＜0.05）；添加糖化酶能夠顯著降低空腸GLUT2基因表達(dá)量（P＜0.05），并顯著提高空腸和回腸SGLT1基因以及回腸B0AT1、EAAT3和y+LAT1的基因表達(dá)量（P＜0.05）；而添加LAB1能夠顯著降低空腸和回腸的GLUT2基因表達(dá)量（P＜0.05），顯著提高空腸SGLT1基因表達(dá)量及回腸B0AT1和EAAT3基因表達(dá)量。而添加不同種類(lèi)淀粉酶和LAB1乳酸菌對(duì)ATB0，+和CAT1的基因表達(dá)量無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。

表9 不同種類(lèi)淀粉酶和產(chǎn)淀粉酶乳酸菌對(duì)21日齡肉雞腸道葡萄糖、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

3 討論

3.1 不同種類(lèi)淀粉酶和產(chǎn)淀粉酶乳酸菌對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能及養(yǎng)分消化率的影響

外源淀粉酶能在一定程度上彌補(bǔ)幼齡家禽因消化器官發(fā)育不完善導(dǎo)致的淀粉酶分泌不足。本研究結(jié)果表明與無(wú)添加劑相比，添加α-淀粉酶對(duì)21 日齡肉雞淀粉消化率以及生長(zhǎng)性能均無(wú)顯著影響，而添加普魯蘭酶和糖化酶會(huì)顯著降低21 日齡肉雞淀粉消化率，對(duì)生長(zhǎng)性能也無(wú)顯著影響，與郭玉光[11]等研究結(jié)果一致。對(duì)于本試驗(yàn)中α-淀粉酶的效果，可能與淀粉酶添加水平過(guò)高有關(guān)。Zhou 等[3]研究表明補(bǔ)充600 U/kg 以上α-淀粉酶會(huì)抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，不同程度地降低小腸中淀粉和有機(jī)物消化率的系數(shù)，從而限制了肉雞的生長(zhǎng)性能。而本試驗(yàn)所添加α-淀粉酶劑量為600 U/kg，因此可能限制了淀粉酶對(duì)淀粉消化率以及生長(zhǎng)性能的有利影響。也可能與不同試驗(yàn)中所用玉米的蛋白質(zhì)溶解度不同有關(guān)。Liu 等[12]研究表明玉米蛋白質(zhì)溶解度越低，α-淀粉酶效果越好。對(duì)于普魯蘭酶和糖化酶而言，淀粉消化率下降的原因可能是因?yàn)檫@兩種酶均能隨機(jī)作用于支鏈淀粉上的α-1,6 糖苷鍵，將支鏈淀粉水解為直鏈淀粉。而直鏈淀粉由于葡萄糖分子的氫基和甲基聚集于螺旋中心因此具有疏水性，而這樣的疏水結(jié)構(gòu)更有利于脂肪酸的甲基末端進(jìn)入并與之結(jié)合，生成的復(fù)合物會(huì)加強(qiáng)直鏈淀粉的疏水結(jié)構(gòu)而對(duì)內(nèi)源α-淀粉酶產(chǎn)生抗性[13]，從而降低淀粉消化率并限制生長(zhǎng)性能。

研究表明，飼喂肉雞產(chǎn)α-淀粉酶的微生物能提高肉雞的干物質(zhì)消化率[14]。而本研究中與無(wú)添加劑相比，產(chǎn)淀粉酶乳酸菌LAB1 會(huì)顯著提高21 日齡肉雞回腸抗性淀粉消化率并會(huì)降低肉雞前期的采食量和料重比。說(shuō)明乳酸菌LAB1 能有效降解抗性淀粉，改善飼料轉(zhuǎn)化效率。

3.2 不同種類(lèi)淀粉酶和產(chǎn)淀粉酶乳酸菌對(duì)肉雞葡萄糖消化吸收的影響

機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)主要是通過(guò)感受營(yíng)養(yǎng)素和激素信號(hào)的胞內(nèi)傳導(dǎo)機(jī)制來(lái)調(diào)控，這一機(jī)制可以控制不同組織產(chǎn)生或消耗葡萄糖的速率。肝臟是葡萄糖與糖原相互轉(zhuǎn)化的主要場(chǎng)所，在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起主要作用。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示與無(wú)添加劑相比，添加乳酸菌LAB1 會(huì)顯著提高肌胃和肝臟的相對(duì)重量，這可能是其導(dǎo)致淀粉消化率提升的原因之一。

外源淀粉酶可與內(nèi)源酶協(xié)同作用共同分解日糧中的淀粉，改變淀粉結(jié)構(gòu)并增加消化道中底物濃度，這一信號(hào)通過(guò)消化道傳遞給胰腺后，胰腺調(diào)節(jié)內(nèi)源酶的分泌；另一方面，外源淀粉酶的添加使葡萄糖釋放速度加快，影響體內(nèi)血糖和胰島素濃度的變化，從而刺激胰腺調(diào)節(jié)消化酶mRNA 的表達(dá)[13]。本研究結(jié)果表明，與無(wú)添加劑相比，添加外源淀粉酶對(duì)肉雞血清葡萄糖、胰島素及胰高血糖素的水平以及空腸和胰腺淀粉酶和蛋白酶活性沒(méi)有顯著性影響，但胰淀粉酶和胰蛋白酶基因表達(dá)量有下降趨勢(shì)，與Yuan 等[15]研究結(jié)果相似，說(shuō)明本研究添加的外源淀粉酶可能劑量偏高，對(duì)胰淀粉酶和胰蛋白酶的分泌有抑制的趨勢(shì)。T4 激素能夠促進(jìn)細(xì)胞代謝，刺激機(jī)體生長(zhǎng)與發(fā)育，同時(shí)T4 還具有促進(jìn)腸道吸收葡萄糖的功能。本研究中發(fā)現(xiàn)與無(wú)添加劑相比，添加α-淀粉酶、糖化酶及乳酸菌LAB1能夠顯著提高T4含量，但未發(fā)現(xiàn)血液中T4激素水平與生長(zhǎng)性能的相關(guān)性。黏膜二糖酶在徹底分解糖類(lèi)過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，其活性會(huì)影響單糖的吸收及利用。而本試驗(yàn)中添加α-淀粉酶、糖化酶和乳酸菌LAB1 能夠顯著降低肉雞空腸黏膜麥芽糖酶活性，且糖化酶能顯著提高回腸黏膜麥芽糖酶活性。說(shuō)明糖化酶可能在回腸中發(fā)揮更大作用，分解產(chǎn)生更多麥芽糖。蔣正宇等[16]發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)矸勖杆綖? 000 U/kg和3 000 U/kg時(shí)，蔗糖酶、麥芽糖酶活性未受影響，但高劑量（9 000 U/kg）降低了蔗糖酶和麥芽糖酶活性。因此推測(cè)添加α-淀粉酶和LAB1導(dǎo)致麥芽糖酶活性下降也可能與劑量偏高有關(guān)。

轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)影響著小分子物質(zhì)的吸收速率，對(duì)動(dòng)物腸道中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收利用起著至關(guān)重要的作用。腸道吸收葡萄糖的能力可以通過(guò)改變SGLT1的表達(dá)量來(lái)調(diào)節(jié)。有研究表明腸腔中高濃度的α-淀粉酶能夠與SGLT1結(jié)合而抑制其對(duì)葡萄糖進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[17]，而腸腔內(nèi)的高濃度葡萄糖則會(huì)刺激SGLT1的表達(dá)[18]。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，添加普魯蘭酶能夠顯著降低空腸SGLT1基因表達(dá)量，并顯著提高回腸SGLT1基因表達(dá)量。說(shuō)明普魯蘭酶可能在回腸中更能發(fā)揮作用。添加糖化酶與乳酸菌LAB1均能顯著降低腸道GLUT2基因表達(dá)量，并提高腸道SGLT1以及B0AT1、EAAT3和y+LAT1等氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因表達(dá)量，可能與T4的水平升高有關(guān)。其中乳酸菌LAB1也可能是通過(guò)促進(jìn)淀粉的利用，從而生成更多的葡萄糖，刺激腸道對(duì)葡萄糖的主動(dòng)吸收。

4 結(jié)論

產(chǎn)淀粉酶乳酸菌LAB1 能改善21 日齡肉雞的料重比，其機(jī)制可能是通過(guò)增加肌胃和肝臟的相對(duì)重量，上調(diào)腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，提高了回腸抗性淀粉消化率，在肉雞產(chǎn)業(yè)有一定的應(yīng)用前途。此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖化酶和普魯蘭酶會(huì)降低空腸淀粉消化率，所添加外源α-淀粉酶可能均劑量偏高，限制了其所能發(fā)揮的作用。肉雞飼料中糖化酶和普魯蘭酶，α-淀粉酶適宜的添加劑量需要繼續(xù)摸索。