■ 林 毅 鄧應(yīng)凱 王銨靜 楊奇慧* 譚北平 遲淑艷 陳宇航 陳嘉聲

（1.廣東海洋大學(xué)，水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料實驗室，廣東湛江 524025；2.廣東德寧水產(chǎn)科技有限公司，廣東佛山 528399；3.廣東省水產(chǎn)動物病害防控與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣東湛江 524088）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）具有繁殖速度快速、抗逆性強、繁殖期長、食性雜、對蛋白養(yǎng)分要求較低等優(yōu)勢，且含肉量高、口感好，是目前全球水產(chǎn)飼養(yǎng)產(chǎn)量最多的三大優(yōu)質(zhì)種類之一[1-2]。從1988年我國引進凡納濱對蝦至今，凡納濱對蝦已經(jīng)成為了中國飼養(yǎng)量最高、分布范圍最廣的養(yǎng)殖對蝦種類。中國2020年海水飼養(yǎng)蝦類總量為145.02萬噸，其中凡納濱對蝦海水飼養(yǎng)總量為111.75萬噸，占我國蝦類海水飼養(yǎng)總量的81%以上，具有極高經(jīng)濟價值[3-4]。

魚粉因其必需氨基酸平衡，適口性極佳，蛋白質(zhì)占比高，水產(chǎn)動物能夠輕易攝取消化等優(yōu)點，成為水產(chǎn)飼料中不可缺少的蛋白質(zhì)來源[5]。魚粉質(zhì)量是影響水產(chǎn)飼料品質(zhì)重要因素之一。對花鱸（Lateolabrax japonicus）[6]和大西洋鱈（Gadus morhua）[7]等研究表明，優(yōu)質(zhì)魚粉比劣質(zhì)魚粉對水產(chǎn)動物促生長效果更好。然而，引起魚粉變質(zhì)因素很多，如魚粉儲藏條件、加工條件、運輸時間等因素，這些因素都會導(dǎo)致魚粉中蛋白質(zhì)腐敗，脂肪氧化，最終造成魚粉品質(zhì)下降[8]。其中，又以儲藏條件對魚粉品質(zhì)影響尤為重要，特別是儲藏溫度與儲藏時間[9]。研究表明，高溫條件下（37 ℃）或魚粉貯藏時間過長均會加重魚粉變質(zhì)[10-11]。因此，為確保養(yǎng)殖動物飼料中的魚粉質(zhì)量，進行魚粉貯藏條件對水產(chǎn)動物生長和飼料利用影響的研究具有重要意義。

目前，國內(nèi)外關(guān)于不同儲存條件下魚粉對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的研究較多。低溫處理后魚粉能夠提高魚的生長和飼料利用率，如金頭鯛（Sparus aurata）[12]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[13]、大西洋比目魚（Hippoglossus hippoglossus）[14]和斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）幼魚[11]等。此外，水分含量低的魚粉能夠提高魚類生長和飼料利用率，如花鱸[6]和大西洋鱈[7]。上述研究表明，高品質(zhì)魚粉對養(yǎng)殖動物生長和飼料利用均有顯著積極作用。在凡納濱對蝦研究中，程傳龍[15]通過對不同儲存時間魚粉進行試驗，結(jié)果表明儲存時間越長，對蝦的生長性能和飼料利用率均顯著下降。但關(guān)于不同溫度儲存下魚粉對凡納濱對蝦影響的相關(guān)研究還鮮有報道。因此，本試驗旨在通過評估4 ℃和室溫下分別貯存45、90 d 及135 d 魚粉對凡納濱對蝦生長性能和抗氧化能力的影響，為凡納濱對蝦飼料中魚粉科學(xué)、合理和高效利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與飼料配制

魚粉為同一批次，魚粉新鮮度使用揮發(fā)性鹽基氮（VBN）、硫代巴比妥酸值（TBA）、組胺（HA）及酸價（AV）指標(biāo)來綜合評判；魚粉放置-4 ℃冰箱和空調(diào)室內(nèi)（實測溫度20.5～22.5 ℃）儲存，新鮮魚粉放置于-20 ℃并于同一時間制粒。

飼料中蛋白質(zhì)源是以白魚粉等為主，脂肪源是以魚油等為主，根據(jù)儲存溫度與儲存時間的不同，配制成7 種等氮等脂試驗飼料分別為FFM（對照組，-20 ℃儲存的新鮮魚粉）、4-FM45（4 ℃儲存45 d）、4-FM90（4 ℃儲存90 d）、4-FM135（4 ℃儲存135 d）、RT-FM45（室溫儲存45 d）、RT-FM90（室溫儲存90 d）及RTFM135（室溫儲存135 d），試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1，魚粉新鮮度指標(biāo)見表2。飼料制作參考梁達智等[16]和Lin 等[17]方法。飼料原料經(jīng)粉碎后通過80 目篩，按照飼料配方進行稱重，原料根據(jù)重量由小到大逐步添加，并置于V型立式攪拌機（浙江正泰電器股份有限公司，JS-14S型）充分攪拌均勻。充分混合后加入大豆卵磷脂和魚油及適當(dāng)（30%～40%）水，混合勻稱后，再采用雙螺桿擠條機（華南理工大學(xué)，F(xiàn)-75型）制作成1.0 mm和1.5 mm的顆粒飼料，干燥至10%的飼料含水量后，將其存進密閉袋子，放在-20 ℃的冰箱中保存。

表1 試驗飼料組成與營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

表2 不同儲存條件對魚粉品質(zhì)的影響

1.2 試驗動物與飼料管理

從湛江市雷州興海蝦苗廠購買試驗蝦苗，在湛江東海島海洋高新科技園進行養(yǎng)殖試驗。蝦苗在室外水泥池中暫養(yǎng)。對蝦苗禁食24 h后分組，按照試驗設(shè)計選取840尾蝦體健康、大小均勻、平均質(zhì)量為（0.40±0.02）g 的幼蝦，隨機分配在0.35 m3的聚乙烯玻璃纖維鋼試驗桶中，每個試驗桶放入40 尾對蝦，向每桶試驗蝦依次投喂相對應(yīng)的7 組試驗飼料，每天投喂4 次（07：00、11：00、17：00 和21：00），飼料投喂量為對凡納濱對蝦總重的8%～10%，在喂食后1 h 內(nèi)，根據(jù)不同的剩料情況，對飼料的攝入量進行相應(yīng)的調(diào)節(jié)。飼養(yǎng)期的頭4 周隔日換水，后4 周每日換水1 次，每次換水量為30%～50%。持續(xù)曝氣，定期檢測水質(zhì)，試驗期間水體溫度為27～32 ℃，溶氧量不低于7 mg/L，鹽度為26～29，氨氮量不高于0.03 mg/L，養(yǎng)殖期8周。

1.3 樣品采集

樣品采集參照何樹青等[18]方法。經(jīng)過8周的養(yǎng)殖試驗后，對試驗蝦進行24 h饑餓處理，然后對每個試驗桶里的凡納濱對蝦進行稱量并計數(shù)，以計算生長指數(shù)。從每個試驗桶里隨機選擇5尾全蝦，先吸干其體表水分后，再放入密封袋內(nèi)，放入-20 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?，用于待測蝦體成分。在每個試驗桶里再隨機選擇5 尾蝦放在冰面，剝開其肝胰腺后將其裝入冷凍存管，以液態(tài)氮保存，然后再放進-80 ℃冰箱，待測酶活性。最后，每桶再隨機選取3 尾對蝦將剝出其肝胰腺，立即置于裝有0.7 mL RNA-later離心管（1.5 mL）中，置于-80 ℃冰箱凍存。

1.4 分析測定方法

1.4.1 飼料及體成分分析

根據(jù)美國食品化學(xué)協(xié)會（AOAC）[19]對飼料及體組分進行了測定。在105 ℃的烤爐中進行水分測量；采用凱氏定氮方法測定粗蛋白的含量（KjeltecTM8400，Sweden）；采用索氏抽提取方法測定粗脂肪的含量（以石油醚為提取液）；采用550 ℃的箱式電阻爐進行粗灰分的測定。

肝胰腺中胰蛋白酶活性（TRS）、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和過氧化氫酶（CAT）活性等抗氧化指標(biāo)檢測根據(jù)試劑盒說明書執(zhí)行操作。另外，對肝胰腺谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活性的測定參照張海濤等[20]方法。

1.4.2 消化酶的測定

所有的消化酶測定均根據(jù)試劑盒說明書執(zhí)行操作。

1.4.3 肝胰腺CAT、GSH-Px和TRS基因的表達量檢測

肝胰腺CAT、GSH-Px和TRS基因表達量參照Gowda 等[21]方法。引物根據(jù)Gene Bank 檢索管家基因和目的基因序列設(shè)計，由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成（表3）。引物按 Gene Bank 檢索，用上海英濰捷基商貿(mào)有限公司SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒（大連）進行熒光定量反應(yīng)。

表3 管家基因和目的基因的引物序列

1.4.4 生長指標(biāo)計算公式

存活率（SR，%）=（Nt/N0）×100

增重率（WGR，%）=（Wt-W0）/W0×100

特定生長率（SGR，%/d）=（lnWt-lnW0）/t×100

飼料系數(shù)（FCR）=Wf/（Wt-W0）

蛋白質(zhì)效率（PER，%）=（Wt/Pi）×100

式中：Nt——終末蝦尾數(shù)；

N0——初始蝦尾數(shù)；

Wt——終末體重均值（g）；

W0——初始體重均值（g）；t——試驗天數(shù)（d）；

Wf--攝食飼料干物質(zhì)總重（g）；

Pi——蛋白質(zhì)攝入量（g）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean+SD）”來表示。試驗數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行單因素分析（one-way ANOVA)，采用Duncan’s法進行多重比較，以表明試驗組之間有無顯著性，P＜0.05 為有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同儲存條件魚粉對凡納濱對蝦生長性能和飼料利用的影響

由表4可知，在4 ℃條件下，隨著魚粉儲存時間增加，WGR、SGR、PER 先上升后下降；4-FM45 組WGR最高，顯著高于其他各組（P＜0.05）；4-FM45組SGR 最高，顯著高于其他各組（P＜0.05）；4-FM45 組PER 最高，顯著高于4-FM90及4-FM135組（P＜0.05）；FCR先下降后上升，4-FM45 組FCR 顯著低于其他各組（P＜0.05）。在室溫條件下，隨著魚粉儲存時間增加，WGR 先上升后下降，RT-FM45 組顯著高于其他各組（P＜0.05）；SGR 和PER 先上升后下降，RT-FM45 組SGR 和PER 最高，且均顯著高于RT-FM135 組（P＜0.05）。FCR 先下降后上升，RT-FM45 組FCR 最低，顯著低于RT-FM135 組（P＜0.05），與其他組無顯著差異（P＞0.05）。不同儲存條件下魚粉對SR 無顯著影響（P＞0.05）。

表4 不同儲存條件魚粉對凡納濱對蝦生長性能和飼料利用的影響（n=3）

2.2 不同儲存條件魚粉對凡納濱對蝦體成分的影響

由表5可知，在4 ℃條件下，隨著魚粉儲存時間增加，凡納濱對蝦體內(nèi)粗蛋白含量增加，4-FM135 組粗蛋白含量達到了最大值，顯著高于4-FM45 組（P＜0.05）。粗脂肪含量先提高后逐漸降低，4-FM135 組粗脂肪含量達到最低值，顯著低于其他所有組別（P＜0.05）。4-FM90 組粗灰分含量顯著低于其他所有組別（P＜0.05）。在室溫下，隨著魚粉儲藏時間的延長，凡納濱對蝦體內(nèi)粗脂肪含量先提高后逐漸下降，RTFM45 組粗脂肪含量達到最高值，顯著高于其他各組（P＜0.05)。粗灰分含量先降低后提高，RT-FM45 組粗灰分含量顯著低于其他所有組別（P＜0.05)。不同儲存條件下魚粉對凡納濱對蝦體內(nèi)水分含量無顯著影響（P＞0.05）。

表5 不同儲存條件魚粉對凡納濱對蝦體成分的影響（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

2.3 不同儲存條件魚粉對凡納濱對蝦肝胰腺抗氧化能力的影響

由表6可知，在4 ℃條件下，隨著魚粉貯存時間增長，T-AOC 以及CAT、GSH-Px 活性先提高后降低，且均在4-FM45 組達到了最大值，顯著高過其他所有組別（P＜0.05）。SOD活性先降低后逐漸提高，4-FM90組顯著低于其他組別（P＜0.05）。TRS 活性先降低后提高，在4-FM45 組達到最低值，顯著低于其他組別（P＜0.05）。在常溫條件下，隨著貯存時間增長，T-AOC 和CAT活性先提高后逐漸降低，T-AOC在RT-FM45組達到最大值，顯著高過其他所有組別（P＜0.05）。SOD、GSH-Px活性隨著時間增加而逐漸降低，SOD活性FFM組顯著高于其他組別（P＜0.05）。TRS活性先降低再增高，RT-FM90組TRS活性顯著高于其他組別（P＜0.05）。

表6 不同儲存條件魚粉對凡納濱對蝦肝胰腺抗氧化能力的影響

2.4 不同儲存條件魚粉對凡納濱對蝦肝胰腺中CAT、GSH-Px和TRS mRNA表達量的影響

由表9 可得，魚粉貯藏時間及貯藏溫度對凡納濱對蝦肝胰腺中CAT、GSH-Px及TRSmRNA 表達量均有顯著影響（P＜0.05），且魚粉儲存時間與儲存溫度間交互作用對凡納濱對蝦肝胰腺中CAT、GSH-Px及TRS mRNA 表達量產(chǎn)生顯著影響（P＜0.05）。由圖1～圖3 可得，在4 ℃條件下，隨著魚粉儲存時間增加，CAT、GSH-Px及TRSmRNA 表達量先上升后下降，都在4-FM45 組達到最高值，顯著高過其他所有組別（P＜0.05）。在室溫條件下，隨著魚粉儲存時間增加，CAT基因表達量逐漸下降再升高，F(xiàn)FM組顯著高過其他所有組別（P＜0.05）。GSH-PxmRNA 表達量先下降后上升，RT-FM135組顯著高過其他所有組別（P＜0.05）。TRSmRNA 表達量先上升后下降，在RT-FM45 組TRSmRNA表達量顯著高于其他各組（P＜0.05）。

圖1 不同儲存條件魚粉凡納濱對蝦肝胰腺中CAT mRNA表達量的影響（n=3）

圖2 不同儲存條件魚粉對凡納濱對蝦肝胰腺中GSH-Px mRNA表達量的影響

圖3 不同儲存條件魚粉對凡納濱對蝦肝胰腺中TRS mRNA表達量的影響

3 討論

3.1 不同儲存條件下魚粉對凡納濱對蝦生長及飼料利用的影響

魚粉品質(zhì)能夠直接影響水產(chǎn)動物的飼料利用效率和生長性能, 蝦類和水產(chǎn)肉食性魚類受其影響極其顯著[22]。對凡納濱對蝦[15]研究表明，魚粉在常溫露空時間越長，對蝦的增重率、飼料利用率及蛋白沉積率均顯著下降；此外，大西洋比目魚[14]和金頭鯛[12]研究結(jié)果同樣表明，隨著魚粉儲存時間增加，魚粉品質(zhì)下降導(dǎo)致水產(chǎn)動物增重率、特定生長率及飼料利用率均顯著下降。在本試驗條件的研究結(jié)果與上述結(jié)論相似，說明隨著儲存時間增加，魚粉其本身營養(yǎng)物質(zhì)的被降解和其品質(zhì)下降，形成一些對飼養(yǎng)動物有害成分，繼而造成飼養(yǎng)動物生長性能下降。在本試驗條件下，隨著魚粉儲存時間增加，低溫儲存魚粉組對蝦的增重率下降程度較慢。研究表明，高溫下會加速魚粉氧化速度，而降低溫度可預(yù)防魚粉發(fā)霉變質(zhì)[23]。低溫組對蝦增重率下降緩慢，原因可能是低溫能夠有效抑制魚粉發(fā)生化學(xué)變化和微生物生長繁殖，防止魚粉品質(zhì)腐敗[24]。

3.2 不同儲存方法下魚粉對凡納濱對蝦體成分的影響

魚粉質(zhì)量直接影響水產(chǎn)動物的營養(yǎng)成分，魚粉中的蛋白質(zhì)品質(zhì)、氨基酸組成都是影響水產(chǎn)動物體成分的關(guān)鍵因素，水產(chǎn)動物體成分也間接體現(xiàn)出魚粉質(zhì)量的優(yōu)劣情況[25]。對凡納濱對蝦[15]研究表明，隨著魚粉儲存時間增加，能夠顯著提升全蝦粗蛋白和粗灰分含量，顯著減少全蝦粗脂肪含量；此外，在大西洋鱈[7]研究結(jié)果同樣表明，低質(zhì)量魚粉會顯著提高魚體灰分含量。本試驗條件下的研究與上述結(jié)論相似，說明隨著魚粉儲存時間增加，魚粉會產(chǎn)生一些對養(yǎng)殖動物有害物質(zhì)，從而導(dǎo)致養(yǎng)殖動物體成分中脂肪顯著降低，灰分顯著升高[15]。

3.3 不同儲存方法下魚粉對凡納濱對蝦肝胰腺抗氧化能力的影響

動物機體中自由基的形成數(shù)量過多時，會與多不飽和脂肪酸進行反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，引起氧化破壞，從而干擾機體的新陳代謝和生命活動[26]。肝胰腺中各種抗氧化酶和抗氧化分子的總抗氧化能力是由肝胰腺T-AOC 代表，其反映了機體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指數(shù)[27-29]。魚粉不同新鮮度對黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）幼魚肝臟T-AOC 活性無顯著影響[30]，與大口黑鱸（Micropterus salmoides）[31]研究結(jié)論相一致。然而，本試驗結(jié)果表明，在兩種儲存溫度條件下，隨著儲存時間的增加，對蝦肝胰腺T-AOC活性降低。這可能是由于所飼喂魚粉來源不同導(dǎo)致結(jié)果不同[30]。此外，研究表明，魚粉儲存過程中生成氧化物質(zhì)能夠影響機體的抗氧化機能活動，從而顯著降低T-AOC活性[15]。

SOD 是人體中一種非常重要的抗氧化酶，它能快速地將游離基歧化為分子氧和過氧化氫，使其在一定的水平上維持其活性[32-34]。對凡納濱對蝦[15]研究發(fā)現(xiàn)，隨著魚粉儲存時間增加，肝胰腺SOD 活性呈現(xiàn)降低趨勢，與斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）的結(jié)論相一致[35]。在本試驗中，兩種儲存溫度條件下，SOD 活性均得到相似的結(jié)論。因此，魚粉隨著貯存時間增加會降低凡納濱對蝦肝胰腺SOD活性。

CAT 是機體內(nèi)的一個特別重要抗氧化酶，可以將具有高氧化活性的過氧化氫快速的分化為水和氧氣，進而維護機體避免遭到氧化破壞，在機體的抗氧化防護體系中具有非常深遠意義[36]。低溫條件下，隨著魚粉儲存時間增加，金頭鯛[12]肝臟中CAT 活性顯著降低；對黃顙魚[30]研究也有相類似發(fā)現(xiàn)，其肝臟中CAT活性隨著魚粉新鮮度降低顯著降低。本試驗條件的研究與上述結(jié)論一致。此外，凡納濱對蝦肝胰腺中CATmRNA 表達量與CAT 活性相一致。這表明儲存時間較短且新鮮度較好的魚粉能夠提高凡納濱對蝦肝胰腺CAT活性。

還原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）是一種重要的抗氧化劑，GSH 能被GSH-Px 催化生成氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione, GSSG），使有毒過氧化物還原成一種無毒的羥基化合物，從而保持細胞膜組織及其功能免遭過氧化物的損害[37]。通過對黃顙魚幼魚的研究發(fā)現(xiàn)，隨著魚粉新鮮程度的下降，肝臟中GSH-Px活性顯著降低[30]。本試驗條件下的研究與上述結(jié)論一致。檢測到凡納濱對蝦肝胰腺中GSH-PxmRNA表達量與GSH-Px 活性一致，這表明低質(zhì)量魚粉會抑制凡納濱對蝦肝胰腺GSH-Px活性。

3.4 不同儲存條件下魚粉對凡納濱對蝦TRS 活性及TRS mRNA表達量的影響

消化酶活性是表現(xiàn)動物對所攝食飼料消化吸收能力的主要指標(biāo)，其優(yōu)劣也決定著動物對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收能力高低。消化酶活性的改變，能夠表現(xiàn)出機體在各種營養(yǎng)情況下的生理反應(yīng)[38]。TRS是凡納濱對蝦中的一種主要消化酶，具有消化蛋白質(zhì)的作用，在機體消化和吸收過程中扮演不可取代的角色[39-40]。對凡納濱對蝦[15]研究中發(fā)現(xiàn)，TRS 活性及TRSmRNA表達水平均隨魚粉品質(zhì)的下降呈現(xiàn)降低趨勢，與本試驗結(jié)果一致。這表明低質(zhì)量魚粉會降低營養(yǎng)物質(zhì)對胰腺細胞的刺激，從而降低了TRS 活性及TRSmRNA表達量。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，在4 ℃和常溫下儲存135 d 的魚粉顯著降低凡納濱對蝦生長性能和飼料利用率；4 ℃條件下儲存的魚粉品質(zhì)要優(yōu)于常溫條件儲存的魚粉。此外，飼喂低質(zhì)量魚粉顯著降低凡納濱對蝦的抗氧化能力。