■ 陶燕子 王秋菊 王紀(jì)元 孟令瀅 李暢洋

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶 163319）

霉菌通過寄生或者腐生的方式在食品和飼料中生存，霉菌可產(chǎn)生毒素，其中，黃曲霉毒素對(duì)人體和動(dòng)物健康的危害最大，除了常見的黃曲霉毒素有危害外，還有雜色曲霉毒素、煙曲霉毒素、玉米赤霉烯酮都是危害畜禽健康的物質(zhì)[1]。有研究表明，雜色曲霉毒素中由二呋喃環(huán)和氧雜蒽酮組成的基本結(jié)構(gòu)與黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)相似，雜色曲霉毒素的毒性不亞于黃曲霉毒素[2]。雜色曲霉毒素普遍存在于谷物類飼料中，在高溫、高濕情況下容易滋生霉菌，若霉菌在禽畜飼料中大量產(chǎn)生，對(duì)禽畜生產(chǎn)性能影響較大。禽畜食用霉變飼料或者吸入發(fā)霉墊料中的霉菌孢子，時(shí)間一長會(huì)導(dǎo)致禽畜患曲霉病。羅伊氏乳桿菌是一種異源發(fā)酵乳桿菌，具有調(diào)節(jié)腸道微生物群，消除炎癥的作用[3]。發(fā)酵乳桿菌作為乳酸菌也能促進(jìn)畜禽生長，改善腸道內(nèi)環(huán)境[4]?，F(xiàn)市面上有許多乳酸菌制劑已經(jīng)成功代替抗生素被使用，菌制劑的應(yīng)用減少了抗生素殘留和動(dòng)物耐藥問題。

如今益生菌防治霉菌受到重視，如何有效地防治霉菌的產(chǎn)生對(duì)人類健康和禽畜健康有著極其重要的意義。本試驗(yàn)從發(fā)霉玉米中分離出雜色曲霉菌，并使用實(shí)驗(yàn)室保存的發(fā)酵乳桿菌和羅伊氏乳桿菌，檢測乳桿菌對(duì)雜色曲霉的抑菌性能，同時(shí)對(duì)分離的雜色曲霉的抗藥性進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）和羅伊氏乳桿菌（L.reuteri）由實(shí)驗(yàn)室在鵝源中分離鑒定保存。雜色曲霉從發(fā)霉玉米中分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）、察氏培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、藥敏試驗(yàn)瓊脂培養(yǎng)基均購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，乳酸酚棉藍(lán)染色液購于北京索萊寶科技有限公司，DL 2000 Marker購于TaKaRaq公司。

1.1.3 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272）購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PCR 基因擴(kuò)增儀（GE9612T-S）購自杭州柏恒科技有限公司；電泳儀（DYY-6C）購自北京市六一儀器廠，光學(xué)顯微鏡購自寧波舜宇儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取發(fā)霉玉米10 g，用100 mL 無菌水?dāng)噭蜃鳛樵?，然后吸? mL 原液放置于離心管中，依次進(jìn)行10、102、103、104、105、106、107、108倍的稀釋。分別取各濃度的稀釋液200 μL 涂布于高壓滅菌后的察氏培養(yǎng)基平板上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d。挑取單一菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，重復(fù)此步驟3～4 次，直到平皿上出現(xiàn)單一菌落為止[5-6]。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

肉眼觀察：通過肉眼觀察菌株的外部形態(tài)，觀察正面以及背面。

顯微鏡下觀察：在無菌操作臺(tái)中，于載玻片中央滴加1～2 滴乳酸酚棉藍(lán)染色，用一次性接種環(huán)，取一小塊菌落，將其放在50%的無水乙醇中浸潤，再用純水輕輕沖洗，隨后將沖洗后的菌絲放于染色液中，將菌絲分散開，加蓋潔凈的蓋玻片，輕輕按壓不要有氣泡，在光學(xué)顯微鏡低倍、高倍或油鏡下觀察菌絲和孢子的形態(tài)。

1.2.3 煮沸法提取霉菌DNA

在1 mL離心管中加200 μL的生理鹽水，取純化好的單個(gè)菌落接到其中，使液體渾濁即可，12 000 r/min離心3 min，棄去上清液，加1 mL 的生理鹽水混勻，12 000 r/min 離心3 min 棄去上清，清洗過程重復(fù)2～3 次。在清洗后的管中加100 μ L 的生理鹽水離心5 min。放入鍋中煮沸20 min或以上，離心12 000 r/min，15 min。取上清液加到新的離心管中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 曲霉分離菌株的PCR鑒定

菌株采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔通用的引物。上游引物序列ITS5：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，下游引物序列ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

PCR 反應(yīng)體系：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL，模板DNA1 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性90 s，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，陽性樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，待結(jié)果返回進(jìn)行分析。

1.2.5 測序及序列分析

將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫上的菌序列進(jìn)行blast比對(duì)分析，找出與其相似性最高的菌株。用MEGA-64軟件對(duì)其序列進(jìn)行分析，構(gòu)建進(jìn)化樹，比較其同源性。將序列分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合進(jìn)行綜合鑒定。

1.3 雜色曲霉孢子懸濁液的制備

將純化后的雜色曲霉接種在PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，待菌株孢子成熟，在培養(yǎng)基中加入適量無菌水，用接種環(huán)輕輕將孢子刮取下來，用8 層無菌紗布過濾菌絲，將過濾后的孢子液收集在離心管中，3 000 r/min 離心5 min，加入無菌磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌，重復(fù)3 次，完成后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，用無菌的PBST 將雜色曲霉孢子液濃度調(diào)整到1×108CFU/mL備用[7-8]。

1.4 雜色曲霉生長抑制試驗(yàn)

將活化好的發(fā)酵乳桿菌和羅伊氏乳桿菌濃度調(diào)整在1×108CFU/mL，將兩種菌按1：1 混合，制成發(fā)酵乳桿菌和羅伊氏乳桿菌的混合菌液[9]，即混合乳桿菌組。將滅菌牛津杯分別放置于涂有雜色曲霉菌的PDA 培養(yǎng)基上，并讓底部與培養(yǎng)基表面貼合。每個(gè)牛津杯內(nèi)加入200 μL 的發(fā)酵乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、混合乳桿菌，每組菌做3 個(gè)重復(fù)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h 后測量抑菌圈，以抑菌圈直徑（DIZ）大小判斷抑菌活性。判定標(biāo)準(zhǔn)：DIZ≥15mm，指示致病菌對(duì)益生菌高度敏感；10 mm≤DIZ＜15 mm，指示致病菌對(duì)益生菌中度敏感；6 mm≤DIZ＜10 mm，指示致病菌對(duì)益生菌低度敏感；DIZ＜6 mm，指示致病菌對(duì)益生菌不敏感[10]。

1.5 雜色曲霉菌藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（Kirby-Bauer disc diffusion method，K-B 法），選擇S1099 成套藥敏片四環(huán)素、新霉素、紅霉素等作為試驗(yàn)藥物。將濃度為1×108CFU/mL的雜色曲霉孢子液取100 μL涂布在瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌鑷子將藥敏片貼到培養(yǎng)基表面，輕輕壓實(shí)，每種藥敏片做3個(gè)重復(fù)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的判定方法，根據(jù)抑菌圈的直徑（Φ）大小判定其藥物敏感性，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)分別為：Φ≥20 mm為敏感（S），15 mm≤Φ＜20 mm為中度耐藥（I），Φ＜15 mm為耐藥（R）[11]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA），用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）”表示，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

肉眼觀察菌落呈淡綠色，外圈呈白色，中圈呈深綠色，內(nèi)圈呈淡綠色，直徑2～3 cm，絨狀，如圖1A。經(jīng)乳酸酚棉藍(lán)染色在40 倍顯微鏡下可看到孢子呈放射狀，如圖1B。

圖1 分離菌株4號(hào)菌形態(tài)

2.2 霉菌rDNA-ITS序列分析結(jié)果

選擇真菌通用引物ITS/ITS4對(duì)分離菌株4號(hào)霉菌的rDNA-ITS 進(jìn)行特異性擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2 所示，4 號(hào)菌的rDNAITS序列PCR產(chǎn)物片段在500～700 bp，產(chǎn)物條帶單一，濃度高，與ITS序列條帶相符。

圖2 4號(hào)霉菌的PCR產(chǎn)物電泳圖

據(jù)圖3所示，分離菌株4號(hào)菌與MH869201.1雜色曲霉菌（Aspergillus versicolor）處于同一分支并且遺傳距離最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)與ITS 結(jié)果進(jìn)行分析，分離菌株4號(hào)菌為雜色曲霉菌。

圖3 分離菌株4號(hào)菌基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 雜色曲霉生長抑制結(jié)果

由表1和圖4可知，在相同條件下培養(yǎng)24 h后，雜色曲霉菌對(duì)羅伊氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、混合乳桿菌高度敏感。羅伊氏乳桿菌和混合乳桿菌組對(duì)雜色曲霉生長菌落抑菌圈直徑均大于發(fā)酵乳桿菌，且差異顯著（P＜0.05）；羅伊氏乳桿菌和混合乳桿菌組對(duì)雜色曲霉菌落生長抑菌圈直徑差異不顯著（P＞0.05）。

表1 不同類型的益生菌對(duì)雜色曲霉菌抑菌圈直徑（n=3）

圖4 三個(gè)處理組對(duì)雜色曲霉的抑菌試驗(yàn)

2.4 雜色曲霉菌藥敏試驗(yàn)

每種藥物進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，根據(jù)CLSI藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如表2 所示，分離的雜色曲霉菌株對(duì)頭孢曲松、米諾環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、頭孢拉定和氨芐西林耐藥，對(duì)其他14種藥物敏感（表2）。

表2 雜色曲霉菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果（n=3)

3 討論

3.1 雜色曲霉的分離鑒定

雜色曲霉屬于一類氧雜蒽酮類化合物，在飼糧的儲(chǔ)存期間易產(chǎn)生，不僅會(huì)引起工業(yè)器材出現(xiàn)霉腐現(xiàn)象，還會(huì)引起動(dòng)物肝臟損傷和癌變發(fā)生[12]。據(jù)14C 示蹤技術(shù)文獻(xiàn)報(bào)道，雜色曲霉毒素在某種情況下會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S曲霉毒素B1[13-14]。它的結(jié)構(gòu)跟黃曲霉毒素相似，它的毒性和致癌性也是不容小覷的[15]。有資料顯示，在1954年，首次從雜色曲霉培養(yǎng)物中分離出一種微黃色針狀晶體有毒化合物，這種物質(zhì)由二呋喃環(huán)和氧雜蒽酮組成。有學(xué)者認(rèn)為，雜色曲霉毒素導(dǎo)致癌癥的原因是二呋喃環(huán)末端的雙鍵與DNA分子的尿嘧啶形成加合物，使DNA結(jié)構(gòu)改變，復(fù)制錯(cuò)誤，損害DNA[16-17]。

本研究中對(duì)發(fā)霉玉米儲(chǔ)存中產(chǎn)生的霉菌進(jìn)行分離純化，通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)基下的真菌形態(tài)特征、顯微鏡下觀察、PCR 擴(kuò)增和rDNA-ITS 序列檢測方法分離出雜色曲霉菌[18-20]。分離的4 號(hào)菌的rDNA-ITS 序列PCR產(chǎn)物片段在500～700 bp，與ITS序列條帶相符，經(jīng)比對(duì)最后判斷為雜色曲霉菌。

3.2 益生菌對(duì)雜色曲霉菌抑制作用

發(fā)酵乳桿菌和羅伊氏乳桿菌都是屬于益生菌，現(xiàn)在許多益生菌都具有抑制有害菌生長的作用。徐丹等[21]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌對(duì)霉菌有較好的抑制作用，全菌液的抑制效果優(yōu)于上清液或沉淀液。劉春娟等[22]研究表明，羅伊氏乳桿菌是具有抑制青霉菌能力的優(yōu)勢菌株。發(fā)酵乳桿菌和羅伊氏乳桿菌對(duì)雜色曲霉的抑制作用，發(fā)酵乳桿菌會(huì)產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)[23]，羅伊氏乳桿菌則是靠其代謝產(chǎn)物羅伊氏菌素發(fā)揮作用，羅伊氏菌素可以抑制多種有害菌如沙門氏菌等[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，通過發(fā)酵乳桿菌和羅伊氏乳桿菌以及混合乳桿菌對(duì)雜色曲霉菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)檢測，發(fā)現(xiàn)3 組的培養(yǎng)基上都有抑菌圈，其中羅伊氏乳桿菌與混合乳桿菌組抑制效果較好，有明顯的抑菌圈。發(fā)酵乳桿菌對(duì)雜色曲霉菌的抑菌圈雖然比較小，但結(jié)果也可以說明發(fā)酵乳桿菌具有抑制霉菌的作用，可以作為抑制飼料霉菌添加劑使用。

3.3 雜色曲霉藥敏試驗(yàn)

關(guān)于雜色曲霉藥敏試驗(yàn)，本試驗(yàn)使用了常用20種抗生素藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，該分離的雜色曲霉菌株對(duì)頭孢曲松、米諾環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、頭孢拉定和氨芐西林耐藥，對(duì)其他14 種藥物敏感，表明雜色曲霉對(duì)14 種抗生素表現(xiàn)出非典型耐藥性。其中，環(huán)丙沙星對(duì)雜色曲霉的抑菌圈最大，紅曲霉、頭孢呋辛、四環(huán)素的抑菌圈較小，可以看出絕大多數(shù)抗生素藥物是可以抑制雜色曲霉的生長，可以為探究抗霉藥物的使用提供一定的參考。

4 結(jié)論

本研究分離了一株雜色曲霉菌，并采用牛津杯法評(píng)估了兩株乳桿菌及混合乳桿菌對(duì)雜色曲霉菌的抑制作用，結(jié)果顯示，3個(gè)處理組對(duì)雜色曲霉均具有抑制作用，并且高度敏感，其中，混合乳桿菌組抑菌效果較好，這可以為抑制飼料發(fā)霉提供數(shù)據(jù)參考。