胡嘉嘉 盧惠 黎業(yè)娟 阮海玲 趙立強(qiáng) 王安國(guó) 萬(wàn)邦貝 鐘靜靜 盧偉英

近年中國(guó)育齡人群不孕不育發(fā)生率已上升至10%～15%,男性不育占其中的30%～40%[1]。在輔助生殖技術(shù)治療過(guò)程中,精子的體外優(yōu)化處理是輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,其目的是為了從精液中篩選出活力、形態(tài)、受精潛能最優(yōu)的精子用于體外受精,而精子處理方法的選擇取決于精液標(biāo)本的質(zhì)量。常規(guī)精液處理方法有密度梯度離心法、直接上游法和洗滌法等,各種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)多數(shù)生殖中心實(shí)驗(yàn)室使用密度梯度離心和上游法優(yōu)化精子,其過(guò)程包括數(shù)次的離心與洗滌操作。研究報(bào)道[2]精子離心是機(jī)械性的剪切力,可引起精子蛋白質(zhì)組學(xué)以及基因組水平的改變,甚至?xí)?dǎo)致嚴(yán)重的精子功能障礙。而DNA甲基化的異?？赡軙?huì)影響到后續(xù)胚胎的發(fā)育,從而影響體外受精與胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)的最終臨床結(jié)局[4]。

精子浮游器上游法優(yōu)選精子的過(guò)程是模擬體內(nèi)精子的自然篩選過(guò)程,不經(jīng)歷密度梯度、離心和洗滌等過(guò)程,直接富集最優(yōu)的精子用于體外受精[3]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)該產(chǎn)品的使用報(bào)道較少。因此為了解浮游器上游法與本中心主流使用的密度梯度結(jié)合上游法優(yōu)化精子后對(duì)胚胎發(fā)育的影響,本文比較密度梯度離心結(jié)合上游法和浮游器上游法對(duì)體外受精—胚胎移植中受精及胚胎發(fā)育的影響,旨在為輔助生殖實(shí)驗(yàn)室精液優(yōu)化技術(shù)方法應(yīng)用提供依據(jù)。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2021年3月—2022年2月在海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF/ICSI治療周期的夫婦病例402/157對(duì)。包括男性因素、女性因素、混合因素和發(fā)病原因不明的不孕不育。納入標(biāo)準(zhǔn)：IVF適應(yīng)證：(1)女方包括盆腔及輸卵管因素、排卵障礙、子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征等;(2)男方禁欲3 d ～ 5 d后取卵日手淫采集的精液,精液量≥1 mL,濃度>15×106/mL。ICSI適應(yīng)證：(1)不明原因的前次IVF受精失敗或受精率小于30%等;(2)男方精液量≥1 mL,濃度>15×106/mL或輕度弱精子癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方獲卵數(shù)<5個(gè),年齡40歲以上;排除各種嚴(yán)重的內(nèi)科合并癥的病例;(2)男方重度少弱精子癥患者;(3)附睪、睪丸穿刺取精患者;(4)逆行射精;(5)供精、供卵。

二、研究方法

1.密度梯度離心結(jié)合上游法優(yōu)選精子：精液由患者本人于取卵日手淫法獲取。精液液化后1h之內(nèi)處理精液,記錄精子濃度、精子活力(率)、精液體積和液化時(shí)間等。在錐形離心管底加入0.5 mL 45%的Sperm Grad液,而后在其下0.5 mL 90%的Sperm Grad液,使兩液交界處見(jiàn)明顯分層,然后將精液輕輕加在梯度液的上面,415 g(1 500 r/min)離心20 min后去掉上清。沉淀物用1.5 mL Sperm Rinse懸浮300 g離心5 min后去上清,視精子沉淀情況加入1 mL左右精子洗滌液,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中上游40 min。最后輕輕吸取上游液至新的小試管中用于卵子受精。

2.精子浮游器上游法優(yōu)選精子：待精液完全液化后處理精液,記錄精子濃度、精子活力(率)、精液體積和液化時(shí)間等。吸取1mL左右Sperm Rinse加至已標(biāo)記有夫妻雙方姓名浮游管底部,然后吸取1 mL已吹打均勻液化的精液輕輕加到精子洗滌液底部,上層液面剛好超過(guò)粉紅色的浮游通孔的上緣,使凹槽內(nèi)充滿液體,置于45°傾角的試管架內(nèi),放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中上游40 min。最后輕輕吸取凹槽中的精子至新的試管中用于卵子受精。

3. 控制性超排卵以及卵母細(xì)胞收集：嚴(yán)格按照本科室制定的人類輔助生殖臨床技術(shù)操作規(guī)程進(jìn)行控制性超促排卵,待優(yōu)勢(shì)卵泡直徑超過(guò)18 mm時(shí),予以人絨毛膜促性腺激素肌注,并于34～36 h行陰道超聲引導(dǎo)下取卵術(shù)并收集卵母細(xì)胞。

4. 胚胎培養(yǎng)：取卵后3～5 h(夜針后39～41 h)進(jìn)行IVF/ICSI授精,IVF授精的PR精子的濃度為10萬(wàn)～15萬(wàn)條/mL,ICSI操作為在顯微鏡下挑選活力好、形態(tài)正常的精子進(jìn)行卵子注射。根據(jù)本中心制定的胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胚胎進(jìn)行詳細(xì)評(píng)分,以本院患者實(shí)際情況隨后選取1～2個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植或者選擇全胚冷凍處理。

5. 試劑與耗材：SpermGrad、SpermRinse、G-IVF Plus、G1、G2等胚胎培養(yǎng)液均為瑞典Vitrolife 公司產(chǎn)品;輔助生殖用精子浮游器的制作材料是聚丙烯,由15 mL的圓底試管和內(nèi)部的浮游通孔組成,浮游通孔直徑6 mm,通孔外圍是凹槽。詳見(jiàn)圖1。

1-Upstream pipe lid;2-Upstream pipe;3-Floating through the hole;4-Card position line圖1 輔助生殖用精子浮游管示意圖Figure 1 Schematic of sperm swimming trapper for assisted reproduction

6. 觀察指標(biāo)：受精率=(2PN卵子數(shù)+1PN卵子數(shù)+多PN卵子數(shù)+0PN卵裂卵子數(shù))/加精卵子數(shù)×100%;卵裂率=卵裂胚胎數(shù)/受精卵子數(shù)×100%;優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)×100%;囊胚形成率=II期及II期以上囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)卵裂期胚胎總數(shù)×100%;可利用囊胚率=可利用囊胚數(shù)/II期及II期以上囊胚數(shù)×100%。

結(jié) 果

一、密度梯度離心結(jié)合上游法與浮游器上游法的一般數(shù)據(jù)比較

經(jīng)過(guò)篩選IVF周期共有398對(duì)夫婦,ICSI周期共有157對(duì)夫婦納入研究,根據(jù)不同精子優(yōu)化處理方法分為密度梯度離心結(jié)合上游法(IVF周期：n=276;ICSI周期：n=79)和浮游器上游法(IVF周期：n=126;ICSI周期：n=78)。

IVF/ICSI周期密度梯度離心結(jié)合上游法組和浮游器上游法組在女方平均年齡、男方平均年齡、不孕年限、體質(zhì)指數(shù)、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、基礎(chǔ)E2等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1～2。

表1 兩組患者的基本情況和促排卵情況Table 1 Basic information, ovulation induction and other index of two

表2 兩組患者的基本情況和促排卵情況Table 2 Basic information, ovulation induction and other index of two

二、兩組常規(guī)精液檢查相關(guān)參數(shù)比較

IVF方案精液處理前后密度梯度離心結(jié)合上游法組和浮游器上游法組男方精子濃度、活率、前向運(yùn)動(dòng)精子、回收率的比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ICSI方案因行單精子顯微注射,需選擇形態(tài)正常、活動(dòng)力高的優(yōu)質(zhì)精子進(jìn)行受精,兩組入組的篩選標(biāo)準(zhǔn)中存在弱精子癥的病例,處理前兩組的精子活力之間存在差異,而精液處理后兩組精子濃度、活率、回收率的比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3～4。

表3 兩組精子參數(shù)處理前后比較Table 3 Comparison of sperm parameters before and after treatment in the two

表4 兩組精子參數(shù)處理前后比較Table 4 Comparison of sperm parameters before and after treatment in the two

三、不同精子處理方法對(duì)卵子受精及胚胎發(fā)育結(jié)局的影響

IVF/ICSI周期密度梯度離心結(jié)合上游法組和浮游器上游法組平均獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)、受精率、卵裂率、正常卵裂率、囊胚形成率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在IVF周期,浮游器上游法組的雙原核受精率顯著高于密度梯度離心結(jié)合上游法組(72.2±19.9)% vs(68.0±18.0)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。浮游器上游法組多PN受精率顯著低于密度梯度離心結(jié)合上游法組(5.3±9.1)% vs(7.4±9.9)%,浮游器上游法組優(yōu)質(zhì)囊胚率顯著高于密度梯度離心結(jié)合上游法組(62.6±33.0)% vs(53.2 ±34.0)%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。ICSI周期浮游器上游法組D3優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于密度梯度離心結(jié)合上游法組(38.0±27.7)% vs(28.2±25.3)%,浮游器上游法組優(yōu)質(zhì)囊胚率顯著高于密度梯度離心結(jié)合上游法組(52.6±37.0)% vs(40.2±38.3)%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 兩組之間各種指標(biāo)的比較Table5 Comparison of the various indicators between the two

討 論

本研究采用的精子浮游器上游法優(yōu)選精子的過(guò)程是模擬體內(nèi)精子的自然篩選過(guò)程,與常規(guī)的直接上游法不同,其內(nèi)部結(jié)構(gòu)是一個(gè)特制的塑料管,不經(jīng)歷密度梯度離心和洗滌等步驟,減少對(duì)精子的損害,對(duì)比密度梯度離心法,所需時(shí)間短,篩選精液中既能克服重力又能跨過(guò)浮游通孔的上緣進(jìn)人凹槽的精子用于IVF和ICSI受精。

IVF過(guò)程是人工將大量精子直接與卵母細(xì)胞在體外共同孵育完成體外受精,此過(guò)程對(duì)精子的自然選擇是有限的,而卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(ICSI)則是將單個(gè)精子直接注入卵胞質(zhì)內(nèi),因此該過(guò)程對(duì)精子的選擇尤為重要,通常需要盡量多地選擇形態(tài)正常、活動(dòng)力高的優(yōu)質(zhì)精子進(jìn)行受精[5]。目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)生殖中心的精液優(yōu)化處理方法主要是密度梯度離心法和直接上游法。直接上游法主要用于精液質(zhì)量較好的和相對(duì)正常的精液,依賴于活動(dòng)精子在培養(yǎng)液中的運(yùn)動(dòng)能力。本研究中采用的浮游器上游法與傳統(tǒng)的上游法相似,但是所用耗材及步驟有所不同。傳統(tǒng)的上游法多采用小試管或錐形管加入精液上游后一段時(shí)間收集精子或收集后大多還需經(jīng)過(guò)離心洗滌,精漿與培養(yǎng)液的接觸面積較大,而有些還需經(jīng)過(guò)再沉淀的過(guò)程。本研究采用的精子浮游器,避免了傳統(tǒng)上游法的缺點(diǎn),該浮游器通孔外圍是凹槽,精液中活力好的精子通過(guò)浮游通孔上游到凹槽中,無(wú)需再次沉淀過(guò)程,同時(shí)減少精液液化后的精漿接觸培養(yǎng)液可能引起的精子損傷及污染。

密度梯度離心法能較好地分離精子和其他細(xì)胞及碎片,可以去除精漿、不活動(dòng)精子、畸形精子、細(xì)胞碎片及其他有害的物質(zhì),從而回收更多形態(tài)正常的精子[6],特別適用于少精子癥、畸精子癥、弱精子癥或者冷凍復(fù)蘇后的精液,能提高精子的回收率[7]。但梯度離心法步驟需要經(jīng)過(guò)數(shù)次的離心和洗滌操作,其中難免有可能對(duì)精子產(chǎn)生物理?yè)p傷。浮游法不同于直接上游法和密度梯度法,其處理過(guò)程不需要離心和數(shù)次洗滌。研究發(fā)現(xiàn)精子離心是機(jī)械性的剪切力,多次反復(fù)離心可致脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生,引起的活性氧增強(qiáng)非特異性滲透離子,也抑制膜受體和酶的作用,甚至都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的精子功能障礙,進(jìn)而可能會(huì)影響卵子受精[2]。本研究中兩種精液優(yōu)化方法處理之后精子的回收率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,精子與卵子受精后兩組之間受精率差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示梯度離心和浮游器優(yōu)選的精子對(duì)于卵子的受精能力影響不大,精子仍具有使卵子受精的能力。精子的質(zhì)膜是最容易損傷的部位,功能完整的質(zhì)膜是精子能夠進(jìn)行新陳代謝,完成獲能和頂體反應(yīng)以及與透明帶結(jié)合并穿過(guò)透明帶的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)密度梯度離心法處理后部分精子會(huì)表現(xiàn)為精子質(zhì)膜和頂體外膜的損傷,精子尾部中段的損傷為線粒體和中心粒細(xì)胞器的損傷,但研究并未表現(xiàn)為中段的丟失[3],提示了一定程度的精子質(zhì)膜和頂體外膜的腫脹和破裂。只要頂體內(nèi)膜和尾部中段未丟失,精子仍具有使卵子受精的能力,因此對(duì)受精的影響并不明顯,但可能對(duì)后續(xù)胚胎發(fā)育造成影響[8]。

近年研究認(rèn)為精子DNA碎片是影響胚胎質(zhì)量的重要因素之一。研究報(bào)道梯度離心可能會(huì)損害精子DNA的完整性,尤其是在運(yùn)動(dòng)能力和形態(tài)受損的不育男性的精液樣本中,這些樣本產(chǎn)生高病理活性氧水平(因?yàn)榫有螒B(tài)異常),并且總抗氧化能力低于正常男性的精漿[4,19]。含有DNA碎片的精子可能具有使卵子受精的能力,但當(dāng)精子DNA損傷超過(guò)一定閾值時(shí),會(huì)干擾正常受精和早期胚胎發(fā)育會(huì)造成影響,引起胚胎發(fā)育減慢,導(dǎo)致妊娠丟失[9]。處理過(guò)程中多次的離心操作會(huì)對(duì)精子的細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成損傷,精子的質(zhì)膜是最容易損傷的部位,精子單位膜完整性遭到破壞將會(huì)影響精子正常的新陳代謝、受精、卵裂和后續(xù)胚胎發(fā)育[10-12]。本研究比較在IVF和ICSI周期兩組精子優(yōu)化處理后對(duì)后續(xù)胚胎發(fā)育的情況,結(jié)果顯示在IVF周期浮游器上游法組的雙原核受精率顯著高于密度梯度離心結(jié)合上游法組,浮游器上游法組的多PN受精率極顯著低于密度梯度離心結(jié)合上游法組,浮游器上游法組的優(yōu)質(zhì)囊胚率極顯著高于密度梯度離心結(jié)合上游法組。ICSI周期浮游器上游法組的D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、優(yōu)質(zhì)囊胚率也明顯高于密度梯度離心結(jié)合上游法組。但I(xiàn)VF/ICSI卵裂率、正常卵裂率、囊胚形成率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究與曹曉敏等的研究結(jié)果相符,以上結(jié)果再次驗(yàn)證使用浮游器精子優(yōu)化方法獲得的胚胎具有較好的發(fā)育潛能,明顯提高優(yōu)質(zhì)胚胎率。推測(cè)原因?yàn)閷?duì)比密度梯度離心法,浮游組的精子未經(jīng)過(guò)梯度離心,對(duì)精子的物理?yè)p傷小,降低精子DNA碎片,提高了精子質(zhì)量,最后獲取的高質(zhì)量的精子用于體外受精。過(guò)多的精子DNA損傷被認(rèn)為會(huì)影響IVF受精率以及之后的胚胎發(fā)育[13]。Palini等的研究也顯示浮游法可獲得更高的優(yōu)質(zhì)胚胎率和妊娠率[14]。文獻(xiàn)報(bào)道早期胚胎發(fā)育潛能對(duì)于妊娠的維持至關(guān)重要,胚胎發(fā)育不良會(huì)導(dǎo)致自然流產(chǎn)的增加[15],尤其是早期的妊娠丟失,表現(xiàn)為生化妊娠[13,16]。本研究發(fā)現(xiàn)尤其在囊胚發(fā)育階段,顯著增加優(yōu)質(zhì)囊胚率。精子質(zhì)量對(duì)胚胎基因組的貢獻(xiàn)非常大,尤其影響囊胚的發(fā)育[17]。囊胚移植的高種植率和活產(chǎn)率使得醫(yī)生和患者更愿意選擇單胚胎移植,在累積妊娠率不降低的情況下,極大地降低了多胎率和多胎帶來(lái)的孕期和圍產(chǎn)期的風(fēng)險(xiǎn)[17-18]。

綜上所述,本文對(duì)比了密度梯度離心結(jié)合上游法和采用精子浮游器上游法分選精子后的受精及胚胎發(fā)育的區(qū)別。結(jié)果顯示浮游器上游法可獲得較高的正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和優(yōu)質(zhì)囊胚率。試管嬰兒的最終目的是孕育健康的胎兒,而這個(gè)需要獲得更多高質(zhì)量的正常胚胎,浮游器的使用在一定程度上提高了本中心雙原核來(lái)源的胚胎,降低了多精受精的胚胎以及獲得較高質(zhì)量的胚胎,有助于進(jìn)一步提高試管嬰兒的成功率。同時(shí)通過(guò)使用該方法,還可以減少成本和錯(cuò)配錯(cuò)誤,該方法簡(jiǎn)化了常規(guī)精液處理的操作步驟,處理所需時(shí)間明顯縮短,方便快捷自然。但目前該浮游器的使用數(shù)據(jù)報(bào)道較少,希望后續(xù)有更多的研究總結(jié),尤其浮游器上游法精子DNA的完整性。