曾 梅,王朝暉,2,王志輝,2,龍雨青,曾 娟,周新茹,周日寶,2,3*,劉湘丹,2,3*

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;2湘產(chǎn)大宗道地藥材種質(zhì)資源及規(guī)范化種植重點研究室;3湖南省普通高等學(xué)校中藥現(xiàn)代化研究重點實驗室,長沙 410208

杜仲(EucommiaulmoidesOliv)為杜仲科(Eucommiaceae)杜仲屬(Eucommia)植物,單屬單種,主產(chǎn)陜西省、四川省、河南省、湖南省、湖北省、重慶市、貴州省、山東省、甘肅省、江蘇省和山西省等地,其中湖南慈利為杜仲之鄉(xiāng),杜仲資源豐富。杜仲傳統(tǒng)以樹皮入藥,在我國有兩千多年的用藥歷史,其味甘、性溫,有補肝腎、強筋骨、安胎等功效[1]。杜仲葉于2015年新收錄入《中華人民共和國藥典》,現(xiàn)為藥食同源試點品種,市場常見有杜仲茶等產(chǎn)品。杜仲雄花在杜仲產(chǎn)地也常作茶用;杜仲果莢一般作為膠的提取原料。

市場杜仲產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊,2020年版《中華人民共和國藥典》中杜仲皮、葉含量測定項下僅對松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸進行控制,杜仲化學(xué)成分種類較為復(fù)雜,制定合理的杜仲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、保障杜仲質(zhì)量,是亟待解決的問題。

劉昌孝院士于2016年提出了中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-Marker)概念[2],后有專家將質(zhì)量標(biāo)志物歸納為“五原則”[3],為中藥質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論,借助統(tǒng)計學(xué)、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)等數(shù)學(xué)手段,強調(diào)對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析以及反映中藥藥效成分的理化和生物學(xué)性質(zhì),在分子水平上詮釋中藥多成分與機體的網(wǎng)絡(luò)作用關(guān)系,為探索中藥復(fù)雜作用模式提供了新的視角[4];指紋圖譜是目前較為成熟的發(fā)現(xiàn)不同批次產(chǎn)品共有成分的方法。

基于此,本研究采用高效液相色譜(HPLC)法建立杜仲(皮、葉、果莢、雄花)的指紋圖譜,再利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對杜仲成分、靶點、通路進行整理分析方法預(yù)測杜仲不同部位潛在的Q-Marker,從而建立杜仲(皮、葉、果莢、雄花)的質(zhì)量控制研究方法,以期為杜仲(皮、葉、果莢、雄花)的質(zhì)量控制以及作用機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent1260二極管陣列檢測器,德國安捷倫公司);ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。

1.2 材料

對照品桃葉珊瑚苷(批號19122404,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、京尼平苷酸(批號19101402,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、綠原酸(批號19101402,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、京尼平苷(批號21092708,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、松脂醇二葡萄糖苷(批號20011401,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、蘆丁(批號18071907,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、紫云英苷(批號20121602,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、槲皮素(批號21032401,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%),均購于成都普菲德生物科技公司;磷酸(天津市恒心化學(xué)試劑制造有限公司,分析純);甲醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,分析純);乙腈(色譜純)。

28批不同品種、不同產(chǎn)地杜仲葉樣品、15批不同產(chǎn)地及采收期杜仲皮樣品、10批不同產(chǎn)地杜仲果莢樣品、10批不同產(chǎn)地及采收時間杜仲雄花樣品,經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)周日寶教授鑒定為杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)的不同部位。樣品具體信息見表1。

表1 杜仲不同部位樣品信息表Table 1 Sample information of different parts of E.ulmoides

1.3 杜仲不同部位指紋圖譜研究

1.3.1 對照品溶液制備

精密稱取對照品適量,用甲醇溶解分別制得濃度為0.024 0 mg/mL桃葉珊瑚苷溶液,0.075 0 mg/mL京尼平苷酸溶液,0.205 0 mg/mL綠原酸溶液,0.002 4 mg/mL京尼平苷溶液,0.010 6 mg/mL松脂醇二葡萄糖苷溶液,0.013 9 mg/mL蘆丁溶液,0.005 5 mg/mL紫云英苷溶液,0.003 0 mg/mL槲皮素溶液,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,密封,低溫避光保存,備用。

1.3.2 供試品溶液的制備

收集新鮮杜仲葉、皮、果莢、雄花樣品,烘干,粉碎,精密稱取樣品粉末(過80目篩)0.5 g置100 mL錐形瓶中,精密加入甲醇12 mL后稱重,超聲提取30 min后取出,冷卻、稱重,損失的質(zhì)量用甲醇補足后搖勻,濾過。取濾液在離心機中以4 000 r/min離心5 min,取上清液過0.45 μm濾膜,密封,低溫避光保存,備用。

1.3.3 指紋圖譜色譜條件

采用Supersil ODS-B100A色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),采用梯度洗脫(0～12 min,5% A→8% A;12～17 min,8% A→11% A;17～25 min,11% A→13% A;25～28 min,13% A→14% A;28～40 min,14% A→14.5% A;40～41 min,85.5% A→14.5% A;41～56 min,20% A→30% A;56～65 min,30% A→24% A;65～66 min,76% A→95% A;66～67 min,5% A→5% A);體積流量為1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量10 μL;檢測波長(0～8 min,207 nm;9～30 min,237 nm;31～40 min,207 nm;41～57min,320 nm;58～67 min,360 nm)。

1.4 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測杜仲不同部位潛在Q-Marker

1.4.1 杜仲不同部位潛在質(zhì)量標(biāo)志物來源定位

通過文獻查閱,定位杜仲不同部位潛在質(zhì)量標(biāo)志物。

1.4.2 候選化合物靶點預(yù)測

通過數(shù)據(jù)庫對8個目標(biāo)化合物篩選,合并篩選出的靶點蛋白并去除重復(fù)靶點,得到與8個化合物相關(guān)的173個靶點蛋白。

1.4.3 靶點蛋白與蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

將篩選出的靶點導(dǎo)入STRING11.0(https://string-db.org/cgi/input.pl)數(shù)據(jù)庫后做PPI分析,設(shè)置物種為“Homo sapiens”,隱藏網(wǎng)絡(luò)中無聯(lián)系的節(jié)點,其余參數(shù)設(shè)置不變,獲得核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖,并將得出的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,然后用Network Analyze進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析,計算度值(degree)、介數(shù)中心性(betweenness centrality)和接近中心性(closeness centrality)等參數(shù)對蛋白相互作用進行可視化處理。

1.4.4 功能富集分析與通路分析

基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析主要用于描述基因靶點的功能,包括分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cellular component,CC)三個部分。京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析可以得到潛在靶點所富集的信號通路。將篩選得到的靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/)進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,P<0.01表示具有統(tǒng)計學(xué)意義,按照P值大小對結(jié)果進行排序,并進行可視化。

1.4.5 分子對接驗證

綜合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果及杜仲藥效考慮,選擇核心靶標(biāo)作為分子對接驗證的靶標(biāo)蛋白,將篩選出的潛在質(zhì)量標(biāo)志物與選擇的蛋白進行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 杜仲不同部位指紋圖譜研究

2.1.1 精密度考察

精密稱S12樣品0.5 g,用“1.3.2”提取方法制備供試品溶液,在“1.3.3”液相色譜條件下進樣,連續(xù)6次,記錄色譜圖。以綠原酸為參照峰,測得13個共有峰相對保留時間的RSD在0.02%～0.08%,相對峰面積的RSD在0.05%～2.29%,表明儀器精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性試驗

取S12樣品6份,每份精密稱取0.5 g,用“1.3.2”提取方法制備供試品溶液,在“1.3.3”液相色譜條件下進樣,記錄色譜圖。以綠原酸為參照峰,測得13個共有峰相對保留時間的RSD在0.02%～0.08%,相對峰面積的RSD在0.68%～2.86%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗

精密稱取S12樣品0.5 g,用“1.3.2”提取方法制備供試品溶液,在“1.3.3”液相色譜條件下進樣,分別于0、2、4、8、12、24 h進樣,進行色譜分析,記錄色譜圖。以綠原酸為參照峰,測得13個共有峰相對保留時間的RSD在0.02%～0.07%,相對峰面積的RSD在0.54%～3.01%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 參照峰選擇

在不同部位杜仲色譜圖中綠原酸的峰分離良好,峰形穩(wěn)定,峰面積較大且為所有樣品共有,所以確定綠原酸的峰為參比峰(S)。

2.1.5 杜仲不同部位HPLC指紋圖譜的建立及相似度評價

取杜仲不同部位樣品,用“1.3.2”提取方法制備供試品溶液,在“1.3.3”液相色譜條件下進樣,記錄63批樣品的色譜圖,采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件”(2012版)分別對杜仲不同部位樣品HPLC色譜圖進行多點校正,色譜峰匹配(時間寬度為0.10),用中位數(shù)法生成對照圖譜R,計算相似度,建立杜仲不同部位的特征圖譜,28批杜仲葉樣品標(biāo)定了13個共有峰,15批杜仲皮樣品標(biāo)定了12個共有峰,10批杜仲雄花樣品標(biāo)定了10個共有峰,10批杜仲果莢樣品標(biāo)定了8個共有峰。葉樣品相似度0.922～0.999,皮樣品相似度0.954～0.998,果莢樣品相似度0.928～0.998,雄花樣品相似度0.959～0.999,相似度均>0.9,說明不同部位杜仲樣品之間相似度良好。杜仲不同部位色譜疊加見圖1,杜仲不同部位對照特征圖譜見圖2(標(biāo)出的峰為共有峰),不同部位樣品相似度評價結(jié)果見表2。

圖1 杜仲不同部位HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of different parts of E.ulmoides注:A-葉;B-皮;C-果莢;D-雄花。Note:A-Leaf;B-Bark;C-Fruit pod;D-Male flower.

圖2 杜仲不同部位對照特征圖譜Fig.2 Control fingerprint of different parts of E.ulmoides注:A-葉;B-皮;C-果莢;D-雄花。1-桃葉珊瑚苷;2-京尼平苷酸;3-綠原酸;4-京尼平苷;5-松脂醇二葡萄糖苷;6-蘆丁;7-紫云英苷;8-槲皮素(圖3同)。Note:A-Leaf;B-Bark;C-Fruit pod;D-Male flower.1-Aucubin;2-Geniposidic acid;3-Chlorogenic acid;4-Geniposide;5-Pinoresinol diglucoside;6-Rutin;7-Astragalin;8-Quercetin (Same as Fig.3).

2.1.6 部分特征峰指認

進一步確認杜仲樣品特征峰的化學(xué)信息,采用HPLC對杜仲葉樣品對照特征圖譜中共有峰中的8個色譜峰進行了指認,通過與對照品對照,分別鑒定為桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、紫云英苷、槲皮素,結(jié)果見圖3。

2.1.7 聚類分析(HCA)

以杜仲葉、皮、雄花、果莢共有峰峰面積為變量運用SPSS 22數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件,采用組間聚類方法,歐氏距離平方法測量樣品間距離進行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果表明,以距離小于5為標(biāo)準(zhǔn),將28份杜仲葉樣品分為3類,S4、S9分別聚為一類,其余樣品為一類;15批杜仲皮樣品聚為4類,S29、S31、S34、S35、S36、S41、S42、S43聚為第一類,S30、S32、S39、S40聚為第二類,S33、S38聚為第三類,S37單獨聚為第四類;10批杜仲果莢樣品聚為3類,S45、S50聚為第一類,S44、S46、S51聚為第二類,S47、S48、S49、S52、S53聚為第三類;10批杜仲雄花樣品聚為2類,S55、S57、S58、S60、S62、S63聚為第一類,S59、S61、S54、S56聚為第二類(結(jié)果如圖4)。不同品種杜仲葉、雄花、果莢不聚為一類,說明不同品種的杜仲樣品質(zhì)量有一定差異,不同產(chǎn)地杜仲葉、皮、雄花、果莢聚為一類,說明不同產(chǎn)地的杜仲不同部位樣品質(zhì)量較為均一,沒有明顯地域性。

圖4 杜仲不同部位聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis of different parts of E.ulmoides注:葉;B-皮;C-果莢;D-雄花。Note:A-Leaf;B-Bark;C-Fruit pod;D-Male flower.

2.1.8 主成分分析和正交偏最小二乘判別分析

主成分分析法(principal component analysis,PCA)是一種通過降維技術(shù)把多個變量化為少數(shù)幾個主成分(綜合變量)的統(tǒng)計分析方法。

將杜仲不同共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 22數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件,以特定的特征值與累計貢獻率作為判定依據(jù),對杜仲不同部位樣品進行主成分分析。以特征值>1為提取標(biāo)準(zhǔn),28份杜仲葉樣本有3個主成分,其特征值λ1=6.999,λ2=1.778,λ3=1.344,特征值λ1的貢獻率為53.841%,λ2的貢獻率為13.678%,λ3的貢獻率為10.340%,累積貢獻率為77.859%;15份杜仲皮樣本有4個主成分,其特征值λ1′=6.275,λ2′=1.589,λ3′=1.366,λ4′=1.138,特征值λ1′的貢獻率為52.293%,λ2′的貢獻率為13,239%,λ3′的貢獻率為11.383%,λ4′的貢獻率為9.487%,累積貢獻率為86.401%;10份杜仲果莢樣本篩選出3個主成分,其特征值λ1′′=3.625,λ2′′=1.954,λ3′′=1.268,特征值λ1′′的貢獻率為45.316%,特征值λ2′′的貢獻率為24.425%,特征值λ3′′的貢獻率為15.849%,累積貢獻率為85.59%;10份杜仲雄花樣本篩選出2個主成分,其特征值λ1′′′=7.215,λ2′′′=1.83,特征值λ1′′′的貢獻率為72.151%,特征λ2′′′的貢獻率為18.298%,累積貢獻率90.449%。篩選出的杜仲不同部位的主成分具有良好代表性,可以反映出杜仲不同部位的綜合質(zhì)量。

以選取的主成分方差貢獻率為權(quán)重系數(shù),對杜仲不同部位樣品主成分得分、綜合得分進行分析,并對得分結(jié)果進行排序。得分情況反映各批杜仲樣本質(zhì)量情況,質(zhì)量越好,則分?jǐn)?shù)越高。本研究中,湖南慈利華仲12號杜仲葉藥材、慈利江埡杜仲皮藥材、華仲10號杜仲果莢、華仲12號雄花樣本分別在不同部位樣品仲得分最高,質(zhì)量較好。

將杜仲不同部位樣品中共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA多元變量統(tǒng)計軟件,得到OPLS-DA得分圖和VIP圖,結(jié)果見圖5。R2代表模型的解釋能力,Q2代表模型的預(yù)測能力,模型中R2和Q2均大于0.5。結(jié)果表明,采用PCA-X和OPLS-DA來觀察不同部位杜仲樣品的自然聚集,28份杜仲葉樣品聚為3類,18份杜仲皮樣品聚為4類,10份杜仲果莢樣品聚為3類,10份杜仲雄花樣品聚為兩類,且分離更加顯著,與HCA結(jié)果基本一致。

圖5 杜仲不同部位的重要性變量Fig.5 Importance variables of different parts of E.ulmoides注:葉;B-皮;C-果莢;D-雄花。Note:A-Leaf;B-Bark;C-Fruit pod;D-Male flower.

為明確不同部位杜仲樣品質(zhì)量差異的物質(zhì),結(jié)合變量重要性投影法,以VIP值大于1為標(biāo)準(zhǔn),杜仲葉篩選出貢獻較大的6個變量,杜仲皮篩選出貢獻較大的6個變量,杜仲果莢篩選出貢獻較大的4個變量,杜仲雄花篩選出貢獻較大的5個變量。一般VIP值>1的變量為組間樣本的主要差異變量,且VIP值越大,表明該成分對組間差異的貢獻越大。根據(jù)對照品指認結(jié)果,杜仲葉樣品中共有峰3、4、9號峰,分別對應(yīng)綠原酸、京尼平苷、蘆丁;杜仲皮樣品中共有峰1、2、6號峰,分別對應(yīng)桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷;杜仲果莢樣品中共有峰3、2、1,分別對應(yīng)綠原酸、京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷;杜仲雄花樣品中共有峰2、4、1號峰,分別對應(yīng)京尼平苷酸、京尼平苷、桃葉珊瑚苷。其中杜仲葉7、8、10號峰,杜仲皮7、8、9號峰,杜仲雄花及果莢中5、6號峰VIP值均大于1,但由于未做液質(zhì)實驗,未能識別出,在接下來的實驗中,將會進行該方面研究。說明這些成分在區(qū)分不同批次杜仲不同部位樣品時起到重要作用,是杜仲的主要標(biāo)志性成分。

2.2 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測杜仲不同部位潛在Q-Marker

2.2.1 杜仲不同部位潛在質(zhì)量標(biāo)志物來源定位

多項杜仲現(xiàn)代藥理研究表明,杜仲中的化學(xué)成分主要包括木脂素類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、萜類和甾體類、酚酸類、多糖類等。Ma等[5]在研究中將京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷作為杜仲平壓片質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn);Liu等[6]測定不同部位化學(xué)成分含量時提議將桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷作為杜仲雄花、皮的質(zhì)量控制指標(biāo)成分;Tu等[7]在杜仲葉抗氧化活性研究中以紫云英苷等8種化學(xué)成分作為杜仲葉的加工方式篩選、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合HPLC色譜分析結(jié)果,最終確定桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、紫云英苷、槲皮素8種成分作為杜仲不同部位質(zhì)量標(biāo)志物的潛在來源范圍進行分析。

2.2.2 候選化合物靶點預(yù)測

通過數(shù)據(jù)庫對8個目標(biāo)化合物篩選,合并篩選出的靶點蛋白并去除重復(fù)靶點,得到與8個化合物相關(guān)的173個靶點蛋白。

2.2.3 靶點蛋白與蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

PPI可視化網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果見圖6,將度值大于2倍中位數(shù)值且degree≥10作為篩選條件,篩選得到11個重要核心靶點,具體包括SRC(degree=21)、HRAS(degree=17)、PIK3R1(degree=16)、CDK1(degree=14)、CASP3(degree=13)、CCNB1(degree=12)、AKT1(degree=11)、CCNA2(degree=11)、CCNB2(degree=11)、EGFR(degree=11)、PTK2(degree=10)。

圖6 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可視化圖Fig.6 Visualization of protein-protein interaction network

2.2.4 功能富集分析與通路分析

GO功能分析中一共獲得1 767個條目,其中包括1 487個生物過程(biological process,BP),186個分子功能(molecular function,MF),93個細胞組成(cellular component,CC),GO分析結(jié)果提示BP主要集中在蛋白質(zhì)磷酸化、激酶活性的調(diào)節(jié)、對無機物的反應(yīng)、正向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移酶活性等功能;MF主要富集在碳酸脫水酶的活動、醇基為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、激酶活性等功能;CC主要涉及周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合體、蛋白激酶復(fù)合體等,分析結(jié)果見圖7。

圖7 GO功能注釋柱狀圖Fig.7 Bar chart of GO function annotations

KEGG富集分析得到168條通路,選擇前15條主要的通路進行展示,主要涉及氮代謝、癌癥通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、癌癥蛋白聚糖、PI3K-Akt信號通路、卵巢類固醇生成等,表明這173個靶點可能主要通過調(diào)控這些通路來干預(yù)相關(guān)疾病,結(jié)果見圖8。

圖8 靶標(biāo)信號通路富集分析氣泡圖Fig.8 Bubble map of target signal path enrichment analysis

2.2.5 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選得到的8個成分、173個靶點和15條主要通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件,建立杜仲“成分-靶點-網(wǎng)絡(luò)”網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果見圖9,由圖可知,杜仲作用于多個靶點、多條通路發(fā)揮作用。利用Cytoscape 3.9.1分析可知,參考化合物、靶點蛋白、信號通路的連接度(degree),發(fā)現(xiàn)槲皮素(degree=103)、蘆丁(degree=79)、紫云英苷(degree=77)、桃葉珊瑚苷(degree=60)、京尼平苷(degree=57)、綠原酸(degree=56)、松脂醇二葡萄糖苷(degree=40)、京尼平苷酸(degree=37)均有比較高的連接度,可能是杜仲的活性成分,PIK3R1(degree=15)、HRAS(degree=14)、AKT1(degree=14)、EGFR(degree=13)、SRC(degree=12)這5個靶點的連接度高于其他靶點,表明它們發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

圖9 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.9 Network diagram of "component-target-pathway"注:紅色V形節(jié)點代表化學(xué)成分;藍色方形節(jié)點代表靶點;黃色圓形節(jié)點代表主要通路。Note:Red V-shaped nodes represent chemical components;Blue square nodes represent targets;Yellow circular nodes represent major pathway

2.2.6 分子對接

綜合上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果及杜仲藥效考慮,選擇核心靶標(biāo)AKT1、SRC、HRAS、ERFR作為分子對接驗證的靶標(biāo)蛋白,將篩選出的8個潛在質(zhì)量標(biāo)志物與選擇的蛋白進行分子對接,對接結(jié)果見表3,對接結(jié)合見圖10。由對接結(jié)果可知8個化合物與蛋白質(zhì)對接后對接分?jǐn)?shù)(docking score)均<0,說明潛在的質(zhì)量標(biāo)志物與AKT1、SRC、HRAS、ERFR均表現(xiàn)出良好的結(jié)合作用。

圖10 AKT1蛋白與京尼平苷酸、SRC蛋白與綠原酸的對接結(jié)果Fig.10 Docking results of AKT1 protein with geniposidic acid and SRC protein with chlorogenic acid

表3 成分與關(guān)鍵靶蛋白的分子對接結(jié)果Table 3 Binding result of components with its key targets

2.2.7 Q-Marker的分析

核心靶點HRAS為轉(zhuǎn)化蛋白p21/H-Ras-1,是胃癌通路的靶點之一[8],PIK3R1是多個亞基組成的多聚體,多個研究均證實PIK3R1基因表達與惡性腫瘤疾病存在顯著關(guān)聯(lián)[9],AKT1是PI3K/Akt通路的核心蛋白,可促進成骨分化關(guān)鍵因子Runx2、Osx和OPN的表達,促進骨形成[10],另有研究表明,AKT1基因?qū)Ｄ侠枳甯哐獕盒阅X出血預(yù)警體系的構(gòu)建具有重要價值[11],RAGE廣泛存在于心肌細胞、內(nèi)皮細胞中,可以促進血管的炎癥因子釋放,臨床與冠心病等缺血性心臟疾病有關(guān)[12],Wang[13]研究證實了SRC在人肝癌組織中高表達,在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。核心靶點相應(yīng)的作用,與杜仲不同部位Q-Marker降壓、預(yù)防骨質(zhì)疏松、護肝、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)血脂等作用相關(guān)。

杜仲不同部位成分具有差異性,所對應(yīng)的功效也有一定差異。例如木脂素類成分經(jīng)過多年的實踐研究證明是杜仲皮發(fā)揮降壓作用的主要有效成分,杜仲葉中含量最高的綠原酸具有抗癌、消炎等作用,杜仲雄花中的主要成分黃酮類成分對冠心病、高血壓等疾病有治療作用等。結(jié)合HPLC結(jié)果,可將綠原酸、蘆丁、京尼平苷作為杜仲葉潛在Q-Marker,將桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷作為杜仲皮潛在Q-Marker,將京尼平苷酸、京尼平苷、桃葉珊瑚苷作為杜仲雄花潛在Q-Marker,將綠原酸、京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷作為杜仲果莢潛在Q-Marker。

3 討論與結(jié)論

中藥具有多成分、多靶點、整體性等特點,質(zhì)量是保證其臨床療效的關(guān)鍵[14],但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制研究依然是制約中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。本研究以劉昌孝提出的Q-Marker理念為基礎(chǔ),結(jié)合實驗結(jié)論及文獻研究篩選出杜仲不同部位可能存在的Q-Marker化合物,并對篩選出的化合物進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,結(jié)果表明這8個化合物可通過SRC、HRAS、PIK3R1、CDK1、CASP3、CCNB1等靶點作用于氮代謝、癌癥通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、癌癥蛋白聚糖、PI3K-Akt、卵巢類固醇生成等關(guān)鍵通路起作用,Huo等[15]研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉中的總黃酮能顯著降低高血脂大鼠血清中總膽固醇的含量,達到降低血脂的作用;同樣有學(xué)者發(fā)現(xiàn)杜仲葉中的多糖能夠明顯降低動脈硬化指數(shù)和冠心指數(shù)及肝臟組織中總膽固醇、甘油三酯含量,從而發(fā)揮杜仲調(diào)節(jié)血脂作用[16];杜仲皮通過抑制PI3K/Akt通路來抑制骨關(guān)節(jié)炎的進展[17];Yuan等[18]發(fā)現(xiàn)杜仲葉總黃酮具有很強的體內(nèi)抗腫瘤作用,與本研究結(jié)果一致。因此,所篩選出的桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、紫云英苷、槲皮素可作為杜仲不同部位的質(zhì)量標(biāo)志物。

杜仲皮作為臨床常用的大宗中藥材之一,在我國有兩千多年的歷史,具有較高的藥用價值,杜仲化學(xué)成分較為復(fù)雜,藥理作用廣泛,且不同部位化學(xué)成分及藥理作用具有差異性及相似性,現(xiàn)有相關(guān)研究大多局限于某一特定部位,割裂其整體性。杜仲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中缺少具有整體性成分的含量測定方法,有必要建立科學(xué)、全面的質(zhì)量控制方法。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和指紋圖譜手段,預(yù)測杜仲中潛在的Q-Marker,可為全面建立杜仲質(zhì)量評價方法及質(zhì)量溯源體系提供較為可靠的理論依據(jù),同時也作為含有杜仲的復(fù)方Q-Marker的篩選手段。