宋 煜 林文昊 荊一博 董 懿 金淑梅

（1.東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點實驗室，東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)奧林學(xué)院，哈爾濱150040；3.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040）

在鹽堿等逆境脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生H2O2，而過量的H2O2導(dǎo)致蛋白質(zhì)、膜脂、DNA等細胞組分受到嚴重的損傷，從而對植物產(chǎn)生很強的毒害作用［1-2］，植物中抗氧化防御體系主要由抗氧化酶組成。其中，過氧化氫酶是抗氧化酶中首先被發(fā)現(xiàn)的，Loew［3］將其命名為Catalase（CAT），Sumner 等［4］從牛肝中首次純化并結(jié)晶得到純度較高的過氧化氫酶。CAT 主要作用是清除脅迫中產(chǎn)生的過量過氧化氫，避免植物的過氧化損傷，在逆境條件下維持植物體的氧化平衡［5-8］，在植物中編碼過氧化氫酶CATs 基因家族是一類成員較少的基因家族，并在不同的物種中已有報道，洋蔥（Allium cepa）耐鹽品種比敏鹽品種積累較高的CAT基因轉(zhuǎn)錄水平［9］，Gondim 等［8］發(fā)現(xiàn)，用H2O2噴霧進行預(yù)處理，H2O2誘導(dǎo)CAT 活性提高，從而降低鹽堿對玉米（Zea mays）幼苗生長的有害影響。Nagamiya 等［10］將大腸桿菌（Escherichia coli）的過氧化氫酶基因在水稻（Oryza sativa）中過表達，有效增強了水稻耐鹽堿性。Mittova 等［11］研究表明，鹽堿脅迫下耐鹽番茄（Lycopersicon pennellii）根部的線粒體中CAT的含量及活性大幅升高。因此作為H2O2清除劑的CAT在植物中起著非常重要的作用。

細葉百合（Lilium pumilum）花朵綺麗，花色鮮紅，具有抗鹽堿的特性具有很高的園林應(yīng)用價值。我國東北地區(qū)土地鹽堿化的問題日益嚴重，在一定程度上限制了植物的廣泛種植與應(yīng)用，對細葉百合中CAT基因在植物抗鹽堿功能上的研究，有助于提高商業(yè)百合的應(yīng)用價值。本研究以細葉百合為研究對象，克隆細葉百合與抗逆性有關(guān)的基因CAT，對其進行同源序列比對及進化樹分析，檢測其在不同逆境處理下的表達特性，表達純化其蛋白，并進一步構(gòu)建LpCat過表達基因煙草，研究其在鹽堿脅迫下的表達情況和發(fā)揮的生物學(xué)功能，不僅能為培育耐鹽堿的新品種百合提供可利用的基因資源，還能在一定程度上為改善部分地區(qū)的土地鹽堿化問題提供研究方向。

1 材料與方法

植物材料細葉百合采自松嫩鹽堿草地安達野外試驗站（44°45′N，123°45′E）。采摘后的植株利用組織培養(yǎng)技術(shù)進行植物組織的快繁，產(chǎn)成組培苗，作為試驗材料。本氏煙草（Nicotiana plumbaginifolia）為東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點實驗室保存材料。

1.1 Catalase基因開放閱讀框的克隆

利用植物提取試劑盒（TaKaRa 公司，北京，中國）提取細葉百合葉的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara 公司，北京，中國）對其進行反轉(zhuǎn)錄，獲得細葉百合的cDNA，以細葉百合的cDNA為模板，根據(jù)細葉百合的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫序列，設(shè)計出1對特異性的上、下 游 引 物（上 游 引 物CatalaseF：5′-ATGGATCCCTACAAGTAC-3′，下 游 引 物CatalaseR：5′-TCACATGCTCGGCTTCAC-3′），進行PCR 擴增，電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物的大小正確后，利用膠回收試劑盒（康為世紀公司，泰州，中國）回收目的片段。膠回收的目的片段與pMD18-T 載體在16 ℃過夜進行連接后，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑取長勢良好的陽性單克隆菌落，PCR 擴增反應(yīng)進行鑒定，測序，命名為LpCat（L.pumilumCatalase）。

1.2 同源序列比對及進化樹分析

測序結(jié)果在NCBI 官網(wǎng)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中查詢出對應(yīng)基因的ORF 區(qū)，利用NCBI官網(wǎng)上的BLAST 功能對獲得的氨基酸序列進行分析，得到具有高相似度的其他物種Catalase 氨基酸序列，使用軟件DNAMAN 8進行Catalase蛋白的同源氨基酸序列比對與分析。借助MEGA 7 軟件構(gòu)建細葉百合Catalase 蛋白與其同源蛋白的進化樹，觀察LpCat蛋白與其他物種Catalase蛋白的親緣關(guān)系的遠近。

1.3 LpCAT 基因在逆境處理后細葉百合的表達特性

將利用鱗片作為外植體生長6 個月的狀態(tài)良好、長勢一致的細葉百合組培苗移入到1/2 MS 培養(yǎng)基（對照組）和分別含有 20 mmol·L-1NaHCO3和11 mmol·L-1H2O2的1/2 MS 培養(yǎng)基（各處理組），分別脅迫處理6、12、24、36、48 h。利用Trizol 法提取各處理的細葉百合葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 為模 板，利 用qPCRCATF：5′-CTATTCCCCCTCGCGTTCTC-3′ 和 qPCRCATR：5′-AGCTTCTGACCGAGAGACCT-3′兩對引物，Ultra SYBR mixture 熒光染料對CAT基因的表達量進行qPCR 檢測：反應(yīng)體系為20 μL（2×SYBR Green Mix 10.0 μL；10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL；cDNA 模板1.0 μL；ddH2O 8.0 μL）；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40 個循環(huán)。進qPCR 檢測LpCat基因在鹽堿脅迫及氧化脅迫的表達量變化。細 葉 百 合 內(nèi) 參 基 因 擴 增 引 物［12］Lpactin F：5′-GCATCACACACCTTCTACAACG-3′和Lpactin R：5′-GAAGAGCATAACCCTCATAGA-3′。每 個 樣 品重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0 軟件進行方差統(tǒng)計分析其相對表達量。

1.4 細葉百合中CAT基因的蛋白表達與純化

細葉百合中LpCat基因的蛋白表達：在CAT基因ORF 區(qū)的上游加上BamH I，下游加上Xhol Ⅰ酶切位點（CAT BamHⅠ F：5′-ggatcCATGGGTGACCTTGCAGT-3′，CAT XholⅠ R：5′-gtcgacTTACAGATCAAAGCTGT-3′），結(jié)合到pQE-30 蛋白表達載體BamHⅠ和XholⅠ的酶切位點之間，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌蛋白表達菌株M15 進行蛋白的表達與純化。菌液在37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)至OD600=0.5，加入1 mmol·L-1IPTG 蛋白誘導(dǎo)劑后培養(yǎng)不同時間（0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h），培養(yǎng)后的菌液經(jīng)13 000 r·min-1瞬時離心，沉淀用200 μL PBS 緩沖液重懸，30 Hz 超聲，9 s 使細胞裂解破碎后，20 μL 樣品溶液加20 μL 2×Loading Buffer 緩沖液混勻，煮沸10 min，冰 浴 放 置5 min。4 ℃，13 000 r·min-1，1 min 取20 μL 上清液進行12% SDS-PAGE 蛋白質(zhì)電泳，電泳結(jié)束后經(jīng)染色、脫色至凝膠透明。

細葉百合中LpCat蛋白純化：在純化柱中添加Ni-NTA agarose 純化樹脂，用無菌去離子水清洗。分別在pQE-LpCat的蛋白上清液中加入10 mmol·L-1咪唑，再倒入純化柱中，置于冰上搖晃充分結(jié)合1 h，過濾后保存為復(fù)性蛋白。加入2 mL 蛋白清洗緩沖液，充分混勻后過濾保存純化蛋白加入1 mL 蛋白洗脫緩沖液，充分混勻后過濾保存，重復(fù)一次。將以上pQE-CAT的復(fù)性蛋白、2 次清洗過濾液、2次洗脫過濾液進行SDS-PAGE電泳檢測純化蛋白。

細葉百合中CAT蛋白抗性：利用pQE-LpCat轉(zhuǎn)化M15的蛋白表達菌液，以pQE-30空載體菌株為對照，待菌液OD600均達到0.5 時，測定在50 mmol·L-1NaHCO3處理下，分別誘導(dǎo)不同時間（0、1、2、3、4、5 h）時，測量攜帶pQE-LpCat和pQE-30 的M15 菌液的OD600值。

1.5 細葉百合LpCat 基因在過表達煙草植物中的抗性分析

1.5.1 LpCat基因植物表達載體的構(gòu)建及對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化和鑒定

添加BamHⅠ/XholⅠ雙酶切位點的LpCat質(zhì)粒和改造后的pBI121 植物表達載體，分別回收相應(yīng)的片段，T4 連接酶16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取重組質(zhì)粒pBI121-LpCat，用電擊轉(zhuǎn)化法將雙酶切鑒定成功的pBI121-LpCat質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EH105中，葉盤法侵染煙草的葉片，選取生長狀況良好的Kana 抗性篩選后的轉(zhuǎn)基因煙草葉片提取DNA，使用CatalaseF和CatalaseR進行PCR鑒定。

1.5.2 LpCat 過表達基因煙草的抗鹽性分析（表型測定與生理指標(biāo)）

取長勢大小一致的野生型和LpCAT過表達煙草，觀 察 在 脅 迫（1 mol·L-1NaHCO3、2.5 mol·L-1H2O2）處理下，LpCat過表達煙草分別與野生型相比生長情況的變化。利用葉綠素計SPAD-502 Plus分別測定在一系列脅迫處理下，野生型、LpCat過表達煙草的葉綠素含量；利用小籃子法測定植物呼吸速率［13］；利用過氧化氫試劑盒（南京建成，南京，中國）測定過氧化氫含量；利用硫代巴比妥溶液與紫外風(fēng)光光度計測定丙二醛的含量［14］。便攜式光合作用測定系統(tǒng)（Li-cor 6400XT，美國）被用來測定在一系列的鹽堿脅迫處理下，野生型、LpCat過表達煙草的凈光合速率，氣孔導(dǎo)度，胞間二氧化碳濃度，蒸騰速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 Catalase基因開放閱讀框的克隆

采用改良CTAB 法提取的細葉百合總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，其18S 條帶和28S條帶完整且清晰。使用核酸蛋白分析儀檢測出總RNA 的濃度為1 023 mg·L-1，OD260/280為1.80，說明提取的總RNA 純度好，無蛋白污染，濃度高，可以用于反轉(zhuǎn)錄。以細葉百合的cDNA 為模板進行PCR 擴增反應(yīng)，經(jīng)電泳檢測，得到了1 條明亮清晰的長約1 500 bp 的特異性擴增條帶（圖1），其結(jié)果與預(yù)期基本一致。將鑒定正確的菌液送至金唯智公司測序，得到LpCat基因的測序長度為1 479 bp。

圖1 LpCat基因開放閱讀框的克隆M.DL2000；1.克隆出的LpCat基因Fig.1 Cloning of the open reading frame of LpCat gene M.DL2000；1.Cloned LpCat gene

2.2 生物信息學(xué)分析

在NCBI 官 網(wǎng) 上 使 用Open Reading Frame Finder 在線軟件獲得測序基因序列的ORF 區(qū)，Lp-Cat 蛋白的Blast 分析結(jié)果表明，細葉百合LpCat 蛋白與其他植物Catalase 蛋白的氨基酸序列有較高的相似性，其中與通江百合（L.sargentiae）的Catalase蛋白同源性高達99.39 %。

使用DNAMAN 8 軟件將細葉百合Catalase基因的氨基酸序列與通江百合（L.sargentiaeANH22606.1，99.39%）、菠蘿（Ananas comosusXP_020084722.1，93.09%）、中國蓮（Nelumbo nuciferaOAY65449.1，92.89%）、胡 桃（Juglans regiaXP_018836411.1，91.87%）、油棕（Elaeis guineensisXP_010918244.1，91.87%）、博落回（Macleaya cordataOVA00608.1，92.07%）、西班牙栓皮櫟（Quercus suberXP_023920387.1，91.26%）等植物的Catalase 蛋白的氨基酸序列進行對比（圖1）。細葉百合Catalase蛋白的氨基酸序列與其它植物Catalase蛋白的一致性高達94.94%，據(jù)此推測本試驗成功克隆出了細葉百合的LpCat基因。

2.3 細葉百合LpCat的qPCR表達分析

利 用qPCR 檢 測20 mmol·L-1NaHCO3和11 mmol·L-1H2O2誘導(dǎo)的5 個時間段中細葉百合葉片組織中LpCat基因的表達水平。結(jié)果顯示，LpCat基因在20 mmol·L-1NaHCO3逆境處理條件下，12 h時段達到最高峰4.42 后開始下調(diào)。該基因在11 mmol·L-1H2O2處理中也有一定表達，表現(xiàn)為于24 h達到最高水平2.64（圖2）。

圖2 NaHCO（3A）和H2O（2B）誘導(dǎo)細葉百合葉片組織中LpCat基因的表達水平“*”表示顯著差異，通過Student’s t-test 檢驗（P＜0.05），±SEM，“*”越多表示差異越大；ns表示不顯著差異Fig.2 Expression level of LpCat induced by NaHCO3 and H2O2 in L. pumilum leaf tissues“*”indicated a significant difference，analyzed by Student’s t-tes（tP＜0.05），±SEM，“*”indicated a greater difference；ns indicated no significant difference

2.4 Catalase蛋白與同源蛋白的進化樹分析

借助NCBI 官網(wǎng)的數(shù)據(jù)庫支持，使用軟件MEGA 7構(gòu)建細葉百合LpCat與其同源蛋白的進化樹（圖3），發(fā)現(xiàn)細葉百合Catalase蛋白與通江百合、菠蘿、油棕、擬南芥（Arabidopsis thaliana）等植物的Catalase具有非常相近的親緣關(guān)系。

圖3 LpCat基因開放閱讀框生物信息學(xué)分析A.LpCat蛋白的同源氨基酸序列比對分析；B.LpCat與其同源蛋白的進化樹分析Fig.3 Bioinformatics analysis of the open reading frame of LpCat gene A.Homologous amino acid sequence alignment analysis of LpCat protein；B.Evolutionary tree analysis of Catalase and its homologous proteins

2.5 重組蛋白pQE30-LpCat的原核表達

挑單克隆過夜搖菌，取2 μL 菌液加入到1 mL LB 培養(yǎng)基中，活化2 h，使菌液OD600的值為0.5 左右。在28 ℃條件下，向菌液中添加終濃度為1.0 mmol·L-1的IPTG 分別誘導(dǎo)0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h后收集菌體，利用SDS-PAGE 電泳和考馬斯亮藍染色等方法檢測蛋白表達情況。結(jié)果表明在50 kDa附近有明顯的誘導(dǎo)條帶，s成功誘導(dǎo)表達了細葉百合的LpCat蛋白（圖4）。

圖4 重組蛋白pQE-LpCat蛋白純化及pQE-LpCat和pQE-30轉(zhuǎn)化菌株的生長曲線A.M.雙色預(yù)染蛋白分子質(zhì)量Marker；1～7 分別是誘導(dǎo)0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h；B.M.雙色預(yù)染蛋白分子質(zhì)量Marker；1～3.復(fù)性蛋白1，復(fù)性蛋白2 和復(fù)性蛋白3；4～5.pGEX-LpCat 純化蛋白1 和純化蛋白2；C.對照條件下pQE-LpCat 或pQE-30 蛋白表達的菌液的生長曲線；D.50 mmol·L-1 NaHCO3處理下pQE-LpCat或pQE-30蛋白表達的菌液的生長曲線Fig.4 Purification of recombinant protein pQE-LpCat and growth curves of pQE-LpCat and pQE-30 transformed bacterial strains A.M.Pre-stained broad molecular weight protein Marker；1-7 were induced 0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 h；B.M.Pre-stained broad molecular weight protein Marker；1-3.Recombinant proteins 1-3；4-5.pQEX-LpCat purified proteins 4-5；C.Growth curve of pQE-LpCat or pQE-30 protein expression bacterial solution under control conditions；D.Growth curve of pQE-LpCat or pQE-30 protein expression bacterial solution under 50 mmol·L-1 NaHCO3 treatment

為得到pGEX-LpCat純化蛋白，將裂解后的蛋白置于有Ni-NTA agarose 純化樹脂的純化柱中純化，輕搖1 h 后靜置得過濾液“pGEX-LpCat復(fù)性蛋白”，重復(fù)3次，分別得到復(fù)性蛋白1-3，蛋白清洗緩沖液洗脫2 次，蛋白洗脫液緩沖液洗脫2 次得pQE-LpCat純化蛋白，分別為純化蛋白1 和純化蛋白2。最后經(jīng)SDS-PAGE 電泳后顯示，成G 功純化出目的條帶。

在未處理條件下（CK），pQE-LpCat和pQE-30誘導(dǎo)5 h后的OD600值分別等于1.482和1.510相差無幾；在50 mmol·L-1NaHCO3處理下，pQE-LpCat和pQE-30 誘導(dǎo)5 h后的菌液OD600值分別等于1.325 和1.113（圖4），在50 mmol·L-1NaHCO3脅迫下，LpCAT 蛋白的表達使菌液與對照相比具有較強的耐鹽堿能力。

2.6 pCXSN-CAT植物表達載體的鑒定

為了進一步觀察細葉百合的過表達基因Lp-CAT對于逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，首先要構(gòu)建pBI121-LpCAT植物表達載體，將鑒定成功的植物表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后，提取出質(zhì)粒，之后用XbaI/SalI 雙酶切鑒定，結(jié)果顯示與目的基因片段相吻合，為1 479 bp。將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，浸染煙草植株，以此獲得細葉百合LpCAT基因的過表達植株，經(jīng)共培養(yǎng)及篩選培養(yǎng)后獲得待鑒定的LpCAT過表達細葉百合植株，提取過表達細葉百合植株的總DNA 為模板，進行PCR 后，發(fā)現(xiàn)株系1～6 都有PCR 產(chǎn)物，說明過表達株系轉(zhuǎn)化成功（圖5）。

圖5 pCXSN-CAT植物表達載體PCR鑒定結(jié)果M.DL2000；CK.非轉(zhuǎn)基因植物（陰性對照）；P.質(zhì)粒（陽性對照）；1～6.轉(zhuǎn)基因植物Fig.5 PCR identification of pCXSN-CAT plant expression vector M.DL2000；CK.Non-transgenic plan（tnegative control）；P.Plasmid（spositive control）；1-6.Transgenic plants

2.7 煙草植株在鹽堿脅迫處理下的表型分析

取土壤中長勢相同的野生型和過表達LpCAT基因的煙草植株株系#1-3，使用逆境（1 mol·L-1NaHCO3、2.5 mol·L-1H2O2）溶液對土壤中生長的煙草進行澆灌，48 h 后觀察。結(jié)果表明，在逆境脅迫下，煙草開始萎蔫。與野生型相比，過表達LpCAT基因煙草植株枯萎程度相對較低（圖6）。據(jù)此分析，過表達LpCAT基因煙草植株比野生型煙草植株在表型上更耐逆境。

圖6 Catalase基因?qū)?種逆境脅迫下煙草生長情況的影響#1，#2，#3表示LpCAT基因過表達煙草株系1，2，3Fig.6 Effect of Catalase on the growth of tobacco under two stresses#1，2 and 3 indicated LpCAT gene overexpressing tobacco lines 1，2 and 3 respectively

2.8 鹽堿脅迫下LpCAT 轉(zhuǎn)基因煙草的生理指標(biāo)分析

為了探究LpCAT基因和煙草中葉片氣體交換參數(shù)是否存在關(guān)聯(lián)，使用LI-6400光合儀分別測定對照組 和 經(jīng) 不 同 處 理（1 mol·L-1NaHCO3、2.5 mol·L-1H2O2）處理48 h 的條件下，野生型和LpCAT過表達煙草的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2（Ci）和蒸騰速率（Tr）的變化（圖7）。結(jié)果顯示，在正常條件下野生型和轉(zhuǎn)基因株系的氣體交換參數(shù)沒有顯著區(qū)別。鹽脅迫處理下，野生型和轉(zhuǎn)基因株系煙草葉片中凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2和蒸騰速率均下降，野生型的凈光合速率下降尤為顯著，在H2O2脅迫下下降了72.1%，由圖7 可知與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2和蒸騰速率均高于野生型，這說明Lp-CAT基因過表達能夠有效減緩鹽脅迫誘導(dǎo)的葉片氣體交換功能降低的現(xiàn)象。

圖7 野生型和LpCAT 過表達煙草的凈光合速率（A）、氣孔導(dǎo)度（B）、胞間CO2（C）和蒸騰速率（D）的變化Fig.7 Changes in net photosynthetic rate（A），stomatal conductance（B），intercellular CO2（C）and transpiration rate（D）in wild-type and LpCAT overexpressing tobacco

使用SPAD 葉綠素測量儀測量，得對照組和經(jīng)不同鹽脅迫下的煙草的葉綠素含量（圖8）。結(jié)果顯示，在植株大小相似，從上到下取相同部位葉片測量時空白對照組的野生型與轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量相近，經(jīng)鹽處理后的野生型植株葉綠素下降顯著，且H2O2和NaHCO3脅迫結(jié)果均顯示轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量高于野生型，說明過表達LpCAT植株耐鹽性高于野生型植株。

圖8 鹽脅迫下野生型和LpCAT 過表達煙草的葉綠素SPAD值（A），H2O（2B）及丙二醛（C）質(zhì)量摩爾濃度SPAD 值表示用SPAD 儀得到的葉綠素相關(guān)的讀數(shù)，SPAD 值與提取出的葉綠素含量之間存在線性相關(guān)關(guān)系Fig.8 Chlorophyll SPAD value（sA），H2O（2B）and MDA（C）molality of wild-type and Lp-CAT overexpressing tobacco under salt stress SPAD values represented chlorophyll-related readings obtained by a SPAD meter.There was a linear correlation between SPAD values and extracted chlorophyll content

為確定LpCAT基因?qū)}脅迫下活性氧的積累的影響，使用試劑盒測量得到了野生型和轉(zhuǎn)基因植株在對照和鹽脅迫下的H2O2含量（圖8）。結(jié)果表明，在未經(jīng)鹽脅迫時野生型和轉(zhuǎn)基因株系中的H2O2含量相似；經(jīng)過鹽脅迫后的株系中H2O2含量均有增加，且野生型株系H2O2含量都高于轉(zhuǎn)基因株系，野生型株系在鹽脅迫下H2O2積累量顯著高于轉(zhuǎn)基因株系，對鹽脅迫較為敏感；轉(zhuǎn)基因株系積累了較少的H2O2，對鹽脅迫具有抗性。

為確定高活性氧（ROS）積累是否與細胞損傷有關(guān)，本研究檢測了煙草不同株系在鹽脅迫下產(chǎn)生的丙二醛（MDA）含量（圖8）。結(jié)果表明，ROS水平較高的野生型MDA 顯著積累，而ROS 含量較低的轉(zhuǎn)基因株系MDA 表達量也較低。這表明鹽脅迫可引起植物體內(nèi)活性氧的大量積累，LpCAT基因的存在可降低活性氧的積累，減輕植物損傷。

3 討論

CAT 是清除H2O2的酶中最快且表達最強的，在不同的生理過程和不同的發(fā)育階段參與H2O2的清除［15］。植物過氧化氫酶被分為3類，Ⅰ類過氧化氫酶在光合組織中表達，Ⅱ類過氧化氫酶與維管組織有關(guān)，Ⅲ類過氧化氫酶在種子和生殖組織中顯著表達［16-17］。擬南芥中的過氧化氫酶基因分別為CAT1、CAT2、CAT3，分別對應(yīng)于Ⅲ類、Ⅰ類和Ⅱ類過氧化氫酶［17-18］。通過NCBI 數(shù)據(jù)庫BLAST 的程序，發(fā)現(xiàn)LpCAT蛋白與擬南芥的CAT2親緣關(guān)系較近，說明LpCAT基因?qū)儆冖耦愡^氧化氫酶。

ZmCAT1、ZmCAT2和ZmCAT3在玉米生長發(fā)育階段有較高表達量［19］，CAT2基因在煙草NC89的根、莖、葉、花瓣、花萼和種子中均有表達，其中在花中相對表達量最高，其次為葉、莖、種子和根［20］。LoCAT1基因在長白落葉松（Larix olgensis）的根、莖、葉中均有表達其中在莖部表達量最低，在葉中相對表達量最高［21］。本研究就選擇了觀察細葉百合葉片的LpCAT基因在植物受到脅迫處理后的表達方式。

在NaCl處理后，根和莖中LoCAT1基因均表現(xiàn)為下調(diào)表達，在12 h 時表達量最低，而葉中Lo-CAT1基因表達在24 h 明顯受抑制，隨后被上調(diào)表達，脅迫96 h 時表達量最高。LoCAT1 可參與催化葉片光呼吸中產(chǎn)生的H2O2的分解作用，使機體免受H2O2毒害［21］。大豆（Glycine max）CAT家族成員在葉和開放的花中的表達量較高；熒光定量PCR分析表明，在鹽、干旱及缺氧脅迫后GmCATS基因表達量升高，且鹽和干旱脅迫下根中的響應(yīng)較葉片更顯著［22］。煙草和銀杏（Ginkgo biloba）在高鹽和干旱的脅迫下，CAT1基因表達量上調(diào)，參與植物抵御逆境脅迫［23-24］。高羊茅（Festuca arundinacea）FaCAT1 基因在植株葉片受到高鹽處理4 h 后時，F(xiàn)aCAT1基因的表達量增加到最大，來清除活性氧造成的損害［25］，說明CAT基因會在植物受到鹽脅迫的情況下，表達量有所變化，LpCAT受到鹽脅迫后，表達量會有怎么樣的變化呢，通過研究發(fā)現(xiàn)，LpCAT在受到脅迫12或24 h 后，表達量達到最大值，說明在逆境處理的很短時間，LpCAT就發(fā)揮了作用。

CAT基因的過量表達會提高植物的抗逆性，如過量表達的水稻過氧化氫酶基因OsCATb提高大腸桿菌對不同重金屬逆境脅迫的耐受性［26］。轉(zhuǎn)鹽穗木（Halostrachys caspica）過氧化氫酶基因Hc-CAT1的大腸桿菌，可明顯提高其耐鹽性［27］。本研究過量表達細葉百合LpCAT基因的大腸桿菌相對于對照的菌株，也明顯地提高了菌液的抗鹽性。這初步說明LpCAT基因與鹽堿有一定的應(yīng)答關(guān)系。擬南芥CAT基因中，只有缺少CAT2會導(dǎo)致生長抑制和葉片中H2O2的顯著積累。CAT2突變體的根系生長受到抑制，而CAT1或CAT3的突變則沒有類似的表型［28］。這說明Ⅰ類過氧化氫酶對葉片中的H2O2清除作用相對其他2 類的作用要大些。CAT 作為信號分子介導(dǎo)多種植物的鹽脅迫反應(yīng)［29］，植物受到傷害，會抑制CAT 活力，使植物體內(nèi)過氧化氫的含量升高，此時過氧化氫能夠放大脅迫信號，是植物體對脅迫產(chǎn)生快速反應(yīng)的基礎(chǔ)［30］。藍藻（AnabaenaPCC 7120）CAT基因的過量表達可提高植物的抗高鹽能力［31］。水稻幼苗受到鹽脅迫后促使H2O2積累，而過表達OsCatC可提高其CAT活性，降低體內(nèi)H2O2的含量，從而提高其鹽和氧化脅迫的耐受性［32］。鹽脅迫對桉樹（Eucalyptus robusta）活性氧代謝和CAT基因表達的影響，6個CAT基因在不同鹽脅迫強度下的轉(zhuǎn)錄變化差異顯著，響應(yīng)機制不盡相同［33］。這些研究說明，CAT基因在植物中發(fā)揮重要的作用。為了驗證LpCAT基因同樣對細葉百合的耐鹽堿性發(fā)揮重要的功能，構(gòu)建了過表達植物表達載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化的方法在煙草中過表達LpCAT基因，通過表型觀察和測量生理指標(biāo)，過表LpCAT基因的煙草的逆境耐性要高于野生型煙草，這表示LpCAT基因具有一定的提高植物的耐逆境脅迫能力。本研究將為揭示細葉百合對鹽堿逆境的分子機制及百合抗鹽分子育種奠定一定的理論基礎(chǔ)。

附錄：

細葉百合Catalase基因序列及氨基酸序列Gene Sequence and Amino Acid Sequence of L. pumilum Catalase