霍清清 夏雨新 李佳樂(lè) 韓 薇 張書(shū)雅 張哲 夏美玲 郭雯華 由香玲

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

龍牙楤木（Aralia elata（Miq.）Seem），又名遼東楤木，屬五加科（Araliaceae）楤木屬落葉小喬木或灌木。龍牙楤木主要分布在我國(guó)東北地區(qū)，以及俄羅斯、朝鮮和日本等地［1］。龍牙楤木具有較高的藥、食兩用價(jià)值，在保肝［2］、抗腫瘤［3-4］、抗炎［5］、降血糖［6-7］等方面有不同程度的藥理作用。近年來(lái)已從龍牙楤木的根、莖、葉、芽等部位中分離出大量活性成分，其中研究最多的為楤木皂苷［8］，其結(jié)構(gòu)主要為齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷。

齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷主要是通過(guò)甲羥戊酸（MVA）途徑合成［9-12］，而β-香樹(shù)素合成酶（β-AS）是皂苷合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵限速酶，其作用位點(diǎn)為三萜皂苷生物合成途徑的下游階段［13］，是生物合成三萜皂苷的第一步，將2，3-氧化鯊烯催化合成β-香樹(shù)素?，F(xiàn)已從人參（Panax ginsengC.A.Mey）［14］、擬南芥（Arabidopsis thaliana）［15］、甘草（Glycyrrhiza uralensis）［16］、竹節(jié)參（Pana japonica）［17］等植物中克隆得到編碼β-香樹(shù)素合成酶基因的cDNA 序列。Wu等［18］首次從遼東楤木中克隆得到Aeβ-AS基因，并在酵母中成功表達(dá)，但Aeβ-AS在植物中的表達(dá)尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以龍牙楤木體胚苗為材料，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆齊墩果烷型皂苷生物合成途徑中一個(gè)關(guān)鍵限速酶β-AS基因，并構(gòu)建植物表達(dá)載體對(duì)煙草進(jìn)行異源轉(zhuǎn)化。該研究為進(jìn)一步解析龍牙楤木中三萜代謝合成途徑，利用基因工程手段來(lái)提高齊墩果烷型三萜皂苷的產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料

本研究所用材料為龍牙楤木（Aralia elata）體胚苗，由東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室龍牙楤木愈傷組織接種在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到，培養(yǎng)基配方為SH+3.0 mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖；野生型煙草（Nicotiana tabacum）組培苗。

1.2 試劑

通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自北京BioFlux 公司；DNA marker、PCR 相關(guān)試劑、限制性內(nèi)切酶、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 均購(gòu)自大連寶生物科技公司；TransStart?FastPfuDNA Polymerase，Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell，TransStart? Green qPCR SuperMix 均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌（Agrobacterium）GV3101 由東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；植物表達(dá)載體pROKⅡ質(zhì)粒由山東師范大學(xué)張慧教授惠贈(zèng)；試驗(yàn)所用引物合成、測(cè)序服務(wù)由北京擎科生物科技有限哈爾濱分公司完成。

2 方法

2.1 目的基因的克隆

參照BioTeKe 公司RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取龍牙楤木體胚苗的總RNA，檢測(cè)純度和濃度后，以0.5 μg 總RNA 為材料，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。根據(jù)龍牙楤木Aeβ-AS基因序列［19］（GenBank：HM219225）并結(jié)合植物表達(dá)載體pROKⅡ序列的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增目的片段，所用引物見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)體系為模板2 μL，引 物Aeβ-AS-F 1 μL、Aeβ-AS-R 1 μL、5×buffer 10 μL、FastPfu1 μL、dNTP 4 μL，用ddH2O 補(bǔ)足至50 μL，反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，58 ℃20 s，72 ℃ 2 min 40 s，共40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 試驗(yàn)中所用的引物Table 1 Primer sequences used in this study

2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

利用同源重組的方法將質(zhì)粒與pROKⅡ載體按一定比例混合，在重組酶的催化下，37 ℃反應(yīng)30 min，完成表達(dá)載體的構(gòu)建，具體方法參照說(shuō)明書(shū)。利用液氮凍融法將pROKⅡ-Aeβ-AS質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PCR 檢測(cè)，擴(kuò)增引物pROKⅡ-F 和pROKⅡ-R序列見(jiàn)表1。

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草獲得及PCR檢測(cè)

參照李爽等的煙草遺傳轉(zhuǎn)化方法，并進(jìn)行修改。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的無(wú)菌野生型煙草葉片切成長(zhǎng)寬1.0 cm 大小的葉片，浸泡到制備好的菌液中（OD 值為0.2～0.3）侵染10 min，共培養(yǎng)2 d 后，轉(zhuǎn)移到含有40 mg·L-1卡那霉素和200 mg·L-1特美汀的分化培養(yǎng)基中，每隔1 d更換1次培養(yǎng)基直至無(wú)菌。待長(zhǎng)出不定芽后，將不定芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到再生植株。

對(duì)抗性植株進(jìn)行分子檢測(cè)，用CTAB法提取煙草葉片DNA，以pROKⅡ-F 和pROKⅡ-R 為引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系。

2.4 Aeβ-AS 基因在煙草中不同組織器官的表達(dá)模式分析

利用通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）提取煙草轉(zhuǎn)基因株系的T0 代純合體葉片、莖和根的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板，以Ntactin基因?yàn)閮?nèi)參基因，利用北京全式金生物技術(shù)有限公司的熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系：模板cDNA 2 μL，2×Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，Dye 0.4 μL，用ddH2O補(bǔ)足至總體積為20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃34 s，40 個(gè)循環(huán)。利用2-ΔΔCt法對(duì)Aeβ-AS基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Aeβ-AS基因表達(dá)量

提取轉(zhuǎn)基因株系的T0 代純合體及野生型煙草葉片的總RNA。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板，以Ntactin基因?yàn)閮?nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。具體步驟參照2.4。利用2ΔCt法分析定量數(shù)據(jù)，計(jì)算不同株系中Aeβ-AS基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 總?cè)坪糠治?/h3>

以香草醛-冰醋酸法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草總?cè)频暮浚?9-20］。將收獲的T1 代純合體煙草植株烘干并研磨，稱取0.05 g 樣品，以4 mL 95%乙醇浸泡24 h 后超聲40 min，70 ℃水浴萃取1 h，精密移取100 μL 上清，70 ℃水浴蒸干，加入200 μL 新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液及800 μL 高氯酸，搖勻，70 ℃水浴15 min，流水冷卻至室溫，加入4 mL乙酸乙酯，于551 nm 處測(cè)量吸光值。以齊墩果酸為對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=4.9235X-0.002 3，R2=0.990 3（Y表示三萜含量，X表示A值），線性范圍為0.002 5～0.080 0 mg。

2.7 轉(zhuǎn)基因煙草關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析

根據(jù)煙草FPS基因序列（GenBank：GQ410573.1）、SS基因序列（GenBank：MG770310.1）、SE基因序列（GenBank：XM016579303.1），并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR 引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)煙草關(guān)鍵酶FPS、SS、SE基因的引物（表1），Actin為內(nèi)參基因。

利用qRT-PCR 的方法檢測(cè)煙草野生型與轉(zhuǎn)基因煙草關(guān)鍵酶基因FPS、SS、SE的表達(dá)情況，其反應(yīng)體系參照2.4，在調(diào)整計(jì)算域值和調(diào)整基線循環(huán)后，與Aeβ-AS基因一同進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)的分析。

2.8 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22.0 對(duì)Aeβ-AS基因在轉(zhuǎn)基因煙草中不同部位之間的表達(dá)量、各個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系中Aeβ-AS基因及其上下游的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量以及各個(gè)株系中的三萜含量進(jìn)行差異顯著性分析（Duncan），用Excel 2019作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 龍牙楤木Aeβ-AS基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

基于NCBI 已知的龍牙楤木Aeβ-AS基因序列（GenBank：HM219225），以龍牙楤木體胚苗cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到2 300 bp 左右的產(chǎn)物，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。

圖1 龍牙楤木Aeβ-AS基因的克隆M.Marker；1～3.PCR產(chǎn)物；4.陰性對(duì)照Fig.1 Cloning of DNA of Aeβ-AS gene from A.elata M.Marker；1-3.PCR product；4.Negative control

3.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

利用同源重組的方法將上述PCR 產(chǎn)物與pROKⅡ載體按一定比例混合，在重組酶的催化下，37 ℃反應(yīng)30 min，將其轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，在抗性板上挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證（圖2A），并提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒送測(cè)序。最終結(jié)果表明，Aeβ-AS基因成功整合到植物表達(dá)載體pROKⅡ中，至此植物表達(dá)載體構(gòu)建完成。

圖2 植物表達(dá)載體pROKⅡ-Aeβ-AS的構(gòu)建A.pROKⅡ-Aeβ-AS菌液PCR 檢測(cè)（M.Marker；1～6.pROKⅡ-Aeβ-AS單菌落；7.陰性對(duì)照）；B.農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化子的菌液PCR檢測(cè)（M.Marker；1～6.GV3101農(nóng)桿菌菌液PCR檢測(cè)；7.陰性對(duì)照）Fig.2 Construction of plant expressional vector pROKⅡ-Aeβ-AS A.PCR identification of pROKⅡ-Aeβ-AS bacterial solution（M.Marker；1-6.pROKⅡ-Aeβ-AS single colony；7.Negative control）；B.PCR identification of Agrobacterium GV3101 transforman（tM.Marker；1-6.PCR detection of GV3101 Agrobacterium；7.Negative control）

將測(cè)序正確的植物表達(dá)載體pROKⅡ-Aeβ-AS質(zhì)粒，以凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，涂含相應(yīng)抗性的平板，隨機(jī)挑選6 個(gè)單克隆經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證，得到6個(gè)目的條帶（圖2B），表明pROKⅡ-Aeβ-AS質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

3.3 pROKⅡ-Aeβ-AS 載體在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化及PCR檢測(cè)

用含有pROKⅡ-Aeβ-AS的農(nóng)桿菌GV3101 侵染煙草葉片，共培養(yǎng)2 d（圖3A）后，將其放于選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 周左右，選擇從葉片周圍長(zhǎng)出的抗性芽（圖3B），切割分離后，接入含有卡那的生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)4周（圖3C）。非轉(zhuǎn)基因的煙草會(huì)受到卡那霉素的抑制而生長(zhǎng)緩慢，逐漸死亡，轉(zhuǎn)基因煙草則會(huì)有抗性而正常生長(zhǎng)。提取野生型和7個(gè)已獲得抗性的轉(zhuǎn)基因株系的基因組DNA，利用表1 中pROKⅡ-F 和pROKⅡ-R 為引物對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測(cè)（圖3D），結(jié)果顯示抗性植株中均含有目的基因，說(shuō)明外源基因已經(jīng)整合入煙草基因組中。

圖3 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得A.共培養(yǎng)煙草；B.篩選培養(yǎng)20 d；C.轉(zhuǎn)基因植株；D.轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測(cè)（M.Marker；P.陽(yáng)性對(duì)照；WT.野生型；2、8、14、21、25、27、30.轉(zhuǎn)基因株系；CK-.陰性對(duì)照）Fig.3 Identification of transgenic tobacco A.Co-cultured tobacco；B.Selected cultured for 20 d；C.Transgenic plant；D.PCR identification of different transgenic plants（M.Marker；P.Positive control；WT.Wild type；2，8，14，21，25，27，30.The transgenic plants with target gene；CK-.Negative control）

3.4 Aeβ-AS 基因在煙草不同組織器官表達(dá)差異分析

為了探究Aeβ-AS基因在煙草不同組織的表達(dá)差異，分別提取葉片、莖和根的總RNA，利用qRTPCR 檢測(cè)Aeβ-AS基因的表達(dá)水平，同時(shí)以煙草Ntactin基因作為內(nèi)參。結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明Aeβ-AS基因在檢測(cè)的不同組織中均有表達(dá)，且在葉片部位具有高表達(dá)，在根和莖部表達(dá)較低，存在明顯的組織特異性。

圖4 Aeβ-AS基因在轉(zhuǎn)基因煙草中不同器官中的表達(dá)分析采用Duncan多重比較，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P＜0.05）；下同F(xiàn)ig.4 Expressional analysis of Aeβ-As gene in different organs of transgenic tobacco Duncan multiple comparison was used，and different lowercase letters indicated significant difference（sP＜0.05）；The same as below

3.4 轉(zhuǎn)基因煙草Aeβ-AS 基因表達(dá)量及三萜含量檢測(cè)

為了研究Aeβ-AS基因在不同轉(zhuǎn)基因煙草株系中的表達(dá)情況，提取煙草葉片總RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。結(jié)果如圖5 所示：與野生型煙草相比，7 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中均有Aeβ-AS基因的表達(dá)，基因相對(duì)表達(dá)量從高到低排序依次為：L30、L2、L8、L14、L25、L21、L27。隨機(jī)選取4 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系及野生型煙草，并檢測(cè)總?cè)坪浚▓D6），轉(zhuǎn)Aeβ-AS基因煙草中三萜含量顯著高于野生型煙草。

圖5 Aeβ-AS基因在煙草中的相對(duì)表達(dá)量*表示與同期對(duì)照相比達(dá)顯著水平（P＜0.05）；下同F(xiàn)ig.5 Relative expression level of Aeβ-AS gene in tobacco* Referred to a significant level compared with control group（P＜0.05）；The same as below

圖6 煙草中三萜含量Fig.6 Triterpenoid content of tobacco lines

3.5 轉(zhuǎn)基因煙草中關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析

利用qRT-PCR 的方法檢測(cè)了野生型與轉(zhuǎn)基因煙草Aeβ-AS、NtFPS、NtSS、NtSE基因相對(duì)表達(dá)量，結(jié) 果 如 圖7 所 示：轉(zhuǎn) 基 因 煙 草Aeβ-AS、NtFPS、NtSS、NtSE基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型，其中株系L21 和L30 相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他株系及對(duì)照，株系L21 的NtFPS、NtSS基因的相對(duì)表達(dá)量最高；株系L30 的NtSE、Aeβ-AS基因的相對(duì)表達(dá)量最高。

圖7 煙草關(guān)鍵酶基因相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of key enzyme genes in tobacco

4 討論

β-香樹(shù)素合成酶（β-AS）為齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵限速酶，催化2，3-氧化角鯊烯合成β-香樹(shù)素，進(jìn)而影響植物體中三萜的含量。本研究旨在探討龍牙楤木中Aeβ-AS基因?qū)θ圃碥蘸铣傻挠绊?。查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)：張玉文等［21］通過(guò)RT-PCR 方法從藤茶（AmpeLopsis grossedentata）葉片cRNA 中擴(kuò)增到香樹(shù)脂醇合成酶基因，發(fā)現(xiàn)其在不同部位表達(dá)量不同。Jo 等［22］克隆得到了刺五加（Acanthopanax senticosus）Esβ-AS基因，并將其轉(zhuǎn)入煙草中得到了β-香樹(shù)素。本研究也將該基因轉(zhuǎn)入煙草中，得到的轉(zhuǎn)基因煙草也體現(xiàn)出了不同部位的表達(dá)差異，其中葉片中的表達(dá)量最高。將甘草和桔梗（Platycodon grandiflorus）β-AS基因分別轉(zhuǎn)入酵母中，也可得到β-香樹(shù)素［23-24］，為提高三萜皂苷產(chǎn)量提供了新思路和參考。孫化鵬等［25］利用RACE 克隆技術(shù)克隆得到了洋常春藤（Hedera helix）中的β-AS基因，并通過(guò)qRT-PCR 技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)了Hhβ-AS基因與常春藤皂苷含量之間存在明顯的正相關(guān)性。部分研究發(fā)現(xiàn)，β-AS基因的表達(dá)量可以影響植物中三萜皂苷的含量。Zhao 等［26］對(duì)人參中Pgβ-AS基因進(jìn)行干擾，發(fā)現(xiàn)β-香樹(shù)素和齊墩果烷型皂苷的含量降低。陳勤等［27］在珠子參（Panax japonicus）細(xì)胞中同時(shí)過(guò)表達(dá)PjFPS和Pjβ-AS基因，發(fā)現(xiàn)了過(guò)表達(dá)PjFPS和Pjβ-AS的細(xì)胞系中，PJS 合成途徑相關(guān)的多個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平有不同程度的提高，且PJS的含量最高為普通細(xì)胞系的2.4 倍。雖然單獨(dú)過(guò)表達(dá)PjFPS也可增加PJS的合成，但雙基因（PjFPS和Pjβ-AS）協(xié)同調(diào)控PJS 合成的效果更好。本研究中獲得的轉(zhuǎn)基因煙草也可在β-AS基因的作用下利用其自身含有的β-香樹(shù)素合成酶的前體物質(zhì)2，3-氧化角鯊烯，合成相應(yīng)的產(chǎn)物。對(duì)煙草總?cè)坪窟M(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草的總?cè)坪匡@著升高，證明了合成Aeβ-AS基因并在煙草中進(jìn)行異源轉(zhuǎn)化，可以使轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)的總?cè)坪匡@著升高。此結(jié)果為進(jìn)一步將Aeβ-AS基因在龍牙楤木中過(guò)表達(dá)，研究其對(duì)產(chǎn)物含量的影響奠定基礎(chǔ)。