楊慶華 葛斌杰 張大生

（1.南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，南京 210037；2.上海世博文化公園建設(shè)管理有限公司，上海 200126；3.上海辰山植物園華東野生瀕危資源植物保育中心，上海 201602；4.上海辰山植物園，上海市資源植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院分子植物卓越中心辰山研究中心，上海 201602）

觀察發(fā)現(xiàn)，自然界中植物的花粉大多呈淡黃色，具有其他顏色花粉的現(xiàn)象非常罕見。植物的色素成分一般可以分為四大類：葉綠素、黃酮類、類胡蘿卜素和甜菜苷［7］。已有研究表明，花粉的顏色主要是因?yàn)楹胸S富的類胡蘿卜素或黃酮類成分，故使花粉呈現(xiàn)出不同程度的淡黃色［7-8］。1968年，HESLOP-Harrison［9］首次發(fā)現(xiàn)百合（Lilium longiflorum）花粉中含有類胡蘿卜素成分，但不確定類胡蘿卜素如何形成以及與花粉外壁上孢粉素的形成是否存在關(guān)系。后來，在向日葵（Helianthus annuus）和金盞菊（Calendula officinalis）等植物的花粉中均陸續(xù)發(fā)現(xiàn)存在類胡蘿卜素成分的現(xiàn)象［10-11］。金盞菊的花粉成分分析結(jié)果表明，毛莨黃素、花藥黃質(zhì)、葉黃素、玉米黃質(zhì)、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素是其花粉外壁的主要成分［11］。Wakelin 等［12］發(fā)現(xiàn)花菱草（Eschscholzia californica）存在橙色和白色花藥（突變型）品種，橙色花藥中的類胡蘿卜素含量要比白色的高，并且認(rèn)為類胡蘿卜素成分與花粉參與有性生殖的過程無明顯關(guān)系。Fambrini等［13］年研究了向日葵（Helianthus annuus）的橙色、黃色和乳白色的花粉時(shí)發(fā)現(xiàn)，橙色花粉顏色的主要成分是由類胡蘿卜素和葉黃素構(gòu)成，當(dāng)把橙色花粉的品種分別和黃色、乳白色的花粉的品種進(jìn)行雜交時(shí)，發(fā)現(xiàn)F2代都是3∶1的性狀分離比，提示橙色是一個(gè)受單基因控制的性狀，但類胡蘿卜素的形成機(jī)制及突變?cè)虿]有深入研究。黃酮類物質(zhì)在花粉中干質(zhì)量比為2%～5%，主要是3 號(hào)位雙糖基化或三糖基化的堪菲醇，斛皮黃酮、異鼠李素［10］，但遺憾的是，對(duì)花粉黃酮類顏色產(chǎn)生的機(jī)制研究目前還很欠缺。筆者在進(jìn)行蘭香草（Caryopteris incana）花色調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)其中一種蘭香草的成熟花粉呈現(xiàn)藍(lán)紫色，這為研究花粉表面色素的形成提供了一個(gè)很好的研究材料。蘭香草是唇形科（Lamiaceae）蕕屬多年生草本植物，花葉并美，具有較長觀賞期，且全株具迷人芳香，是一種優(yōu)良的園林綠化、美化、香化植物［14］。除了觀賞價(jià)值以外，蘭香草還包含黃酮類、萜類、苷類、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用［15］。野生蘭香草資源十分豐富，適應(yīng)性極強(qiáng)，存在大量的變異類型，主要分布于我國華東、廣東、廣西、湖南、湖北等地，在日本與朝鮮半島亦有分布。

由于彩色花粉的形成機(jī)制目前研究還鮮見報(bào)道，本研究擬通過顯微觀察方法對(duì)蘭香草不同發(fā)育時(shí)期的花粉色素積累情況進(jìn)行觀察，并利用質(zhì)譜檢測(cè)花粉表面色素的成分，以期對(duì)植物花粉表面色素的形成和發(fā)生機(jī)制提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

本試驗(yàn)中所用蘭香草活植物于2015 年9 月引自浙江省舟山市桃花島（GBJ04972，29.840 670N，122.237 275E），種植于上海辰山植物園（31.075 001N，121.183 037E）隔離苗圃至今，每年可正常開花結(jié)實(shí)，在6～9 月花期觀察花形態(tài)特征，收集不同時(shí)期的新鮮花藥和花粉用于試驗(yàn)。

質(zhì)譜所用試劑：甲醇（色譜純，Merck公司）；甲酸（色譜純，Sigma-Aldrich 公司）、鹽酸（優(yōu)級(jí)純，信陽市化學(xué)試劑廠）、花青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99%，isoReag公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同時(shí)期花蕾、花藥和花粉的觀察

取不同發(fā)育時(shí)期的新鮮花蕾各3個(gè)，在體視鏡（OLYMPUSLG-PS2，日本）下觀察花藥和花粉的顏色，取成熟花藥解離花粉制成涂片，徒手切片制作花藥橫切面切片，在顯微鏡（OLYMPUSBX43，日本）下觀察花粉顏色和結(jié)構(gòu)。

1.2.2 花粉中花青素成分的靶向檢測(cè)

2）從行業(yè)分布來看，以戶外運(yùn)動(dòng)為主。由于戶外運(yùn)動(dòng)參與人數(shù)眾多，消費(fèi)群體廣，像足球、滑雪、自行車等有著充足的參與力量，使戶外運(yùn)動(dòng)在小鎮(zhèn)建設(shè)中有良好的資源基礎(chǔ)；

1.2.2.1 儀器與設(shè)備

質(zhì)譜檢測(cè)委托嘉興邁維代謝生物科技有限公司進(jìn)行。超高效液相色譜儀（ExionLC? AD，美國）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）（QTRAP? 6500+，美國）。質(zhì)譜數(shù)據(jù)用軟件Analyst 1.6.3 處理。真空冷凍干燥儀（FreezeZone 6 L-84，美國）；高速離心機(jī)（5424R，德國）；電子天平（AS 60/220.R2，波蘭）；球磨儀（MM400，德國）、超聲波提取儀（KQ5200E，昆山舒美）、多管渦旋振蕩器（MIX-200，上海）。

1.2.2.2 樣品前處理

收集成熟時(shí)期的花粉進(jìn)行真空冷凍干燥并研磨至粉末狀，稱取50 mg 的粉末溶解于500 μL 提取液（80%的甲醇水溶液，含0.1%鹽酸）中；渦旋10 min，超聲10 min，離心（轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1，3 min），吸取上清液，重復(fù)操作1 次；合并2 次上清液，用微孔濾膜（孔徑0.22 μm）過濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.2.2.3 儀器條件

液相條件包括：（1）色譜柱：ACQUITY BEH C18 1.7 μm，2.1 mm×100 mm；（2）流動(dòng)相：A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B 相為甲醇（加入0.1%的甲酸）；（3）洗脫梯度：0 min B 相比例為5%，6 min增至50%，12 min增至95%，保持2 min，14 min降至5%，并平衡2 min；流速0.35 mL·min-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件主要包括：電噴霧離子源溫度550 ℃，正離子模式下質(zhì)譜電壓5 500 V，氣簾氣35 psi。在QTRAP? 6500+中，每個(gè)離子對(duì)是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能進(jìn)行掃描檢測(cè)。

1.2.2.4 花青素的定性和定量分析

基于標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建MWDB（Metware Database）數(shù)據(jù)庫，對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析。利用軟件Analyst 1.6.3 處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間與峰型的信息，對(duì)每種物質(zhì)在不同樣本中檢測(cè)到的質(zhì)譜峰進(jìn)行校正，以確保定性定量的準(zhǔn)確。分別配制0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、50.00、100.00、500.00、1 000.00、2 000.00、50 000.00 mg·L-1不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，獲取各個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)應(yīng)定量信號(hào)的質(zhì)譜峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制不同物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將檢測(cè)到的所有樣本的積分峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程進(jìn)一步帶入計(jì)算公式計(jì)算后，最終得到實(shí)際樣本中該物質(zhì)的絕對(duì)含量數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘭香草藍(lán)色花藥的形態(tài)觀察

本研究使用的蘭香草高約50 cm，基部稍木質(zhì)化。葉對(duì)生，葉片厚紙質(zhì)，披針形、卵形或長圓形，兩面被短柔毛。頂生和腋生聚傘花序緊密（圖1A～B）?；ㄝ啾瓲?，外面密被短柔毛；花冠淡紫色或淡藍(lán)色（圖1C），二唇形，外被短柔毛，花冠管喉部有毛環(huán)，花冠5裂，下唇中裂片較大，邊緣呈流蘇狀；雄蕊4枚，花開時(shí)與花柱均伸出花冠筒外，花藥藍(lán)紫色，藥室縱裂，可見藍(lán)紫色花粉粒（圖1D，箭頭所示處），花絲淺紫色。柱頭2 裂，呈線形分叉，淺紫色?；ü?～10 月。為了排除花粉囊中其他雜質(zhì)顏色的影響，將成熟花粉抖落在載玻片下進(jìn)一步顯微觀察，可以看到花粉表面的確呈現(xiàn)為藍(lán)色（圖1E）。

圖1 蘭香草花期，花序、花、花藥及花粉形態(tài)特征A.聚傘花序生于枝干上部，兼具腋生和頂生；B.開花時(shí)的花序形態(tài)，示花瓣、花藥和花絲均為藍(lán)紫色；C.開放花的結(jié)構(gòu)，由外至內(nèi)為：花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊；D.花藥2室，縱裂后，露出藍(lán)紫色花粉粒（箭頭所指）；E.成熟時(shí)期的花粉形態(tài)Fig.1 Morphological characteristics of inflorescence，flower，anther and pollen in C.incana A.Cymose morphology of C.incana inflorescence；B.Morphology of inflorescence at mature stage，the petals，anthers and filaments were all blue-purple；C.Morphology of floret at mature stage，from outside to inside：sepals，petals，stamens and pistils；D.Dehiscent anther at mature stage，the anther had two locules，arrow indicated the blue pollen；E.Morphology of pollen at mature stage

2.2 蘭香草花粉顏色的變化及存在位置

為確定不同發(fā)育階段花藥和花粉顏色變化特征，觀察了4 個(gè)時(shí)期的花藥和花粉的形態(tài)特征，結(jié)果如下：現(xiàn)蕾期（Ⅰ）、生長期（Ⅱ）、蓓蕾期（Ⅲ）、開花期（Ⅳ）的花蕾觀察。結(jié)果顯示，蘭香草早期花蕾是一簇綠色球狀小花苞，花瓣被緊緊包裹于花萼之內(nèi)（圖2A：Ⅰ）。隨著花蕾繼續(xù)發(fā)育，花萼部位出現(xiàn)淺藍(lán)色色素（圖2A：Ⅱ），花瓣頂端也逐漸變藍(lán)（圖2B）；剝開花蕾，此時(shí)內(nèi)部的花藥呈現(xiàn)淡黃色（圖2B，箭頭處），花粉囊里面的花粉也呈現(xiàn)為淡黃色（圖2C）?；ò觌S著發(fā)育逐漸變大，突出于花萼，花瓣顏色也逐漸全部轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，此時(shí)花蕾仍然全部包裹著花藥和雌蕊（圖2A：Ⅲ）；剝開花瓣，內(nèi)部可以看到彎曲蜷縮的花藥，但此時(shí)的花藥和花絲已經(jīng)開始逐步轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色（圖2D），顯微鏡下觀察可以看到花粉也轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色（圖2E）。最后，花絲進(jìn)一步延長伸出花瓣，花瓣顏色進(jìn)一步加深呈藍(lán)紫色（圖2F），成熟的花藥開裂露出里面藍(lán)色的花粉（圖2G）。

圖2 蘭香草4個(gè)發(fā)育階段的花藥和花粉顏色的變化A.4個(gè)發(fā)育時(shí)期的花蕾形態(tài)；B～C.花蕾生長期（Ⅱ）的花形態(tài)和花藥形態(tài)，示花絲和花藥為淺黃色；D～E.蓓蕾初綻期（Ⅲ）的花形態(tài)（D）和花藥（E），示花藥深紫色，花絲為淺紫色；F～H.開花期（Ⅳ）的形態(tài)（F）、成熟花藥（G）和花藥徒手橫切面（H），示花絲淺紫色，開裂花藥和花粉均為深藍(lán)紫色；花藥橫切面顯示花粉囊含有兩個(gè)藥室，花藥壁為淺黃色，而花粉粒為淺藍(lán)色，箭頭所示的絨氈層部位也為藍(lán)紫色Fig.2 The pigment formation of anther and pollen at four different stages of C.incana A.Phenotype of flower buds at four different stages；B-C.The filament and anther morphology at stage Ⅱ of flower bud and arrow indicated that the filaments and anthers were light yellow；D-E.The filament and anther morphology at stage Ⅲ of flower bud and arrow showed that the anthers were dark purple and the filaments were light purple；F-H.The filamen（tF），mature anthe（rG）morphology and cross section of anthe（rH）at stage Ⅳ of flower bud showed that the filament was light purple，the dehiscent anther and pollen were dark purple；The cross section of the anther showed that the anther sac contained two locules，the anther wall was light yellow，the pollen grain was light blue，and the tapetum shown by the arrow was also blue-purple

為了分析花藥藍(lán)色存在的具體部位，筆者對(duì)蓓蕾期（第III 期）的藍(lán)色花藥進(jìn)行徒手切片觀察。結(jié)果顯示，蘭香草的花粉囊由2 個(gè)藥室組成，每個(gè)藥室中都充滿了淺藍(lán)色的花粉顆粒（圖2H），藍(lán)色花藥的形成主要是由于花粉的藍(lán)色導(dǎo)致。被子植物典型的藥室結(jié)構(gòu)一般由由外而內(nèi)的外層、內(nèi)層、中層和絨氈層4 層壁細(xì)胞組成［14］。通過蘭香草的花藥橫切面可以看出，外層、內(nèi)層、中層并沒有色素存在，但在藥室內(nèi)側(cè)，也就是絨氈層部位觀察到有淺藍(lán)色的色素形成（圖2H，黑色箭頭處），尤其是靠近花絲和花粉囊連接處的絨氈層，更有較深的藍(lán)色色素（圖2H，紅色箭頭處）。提示花粉藍(lán)色的形成可能是由絨氈層或小孢子共同產(chǎn)生顏色的結(jié)果。

2.3 蘭香草藍(lán)色花粉色素成分分析

植物中能夠形成藍(lán)色的色素主要是黃酮類的花青素成分［7］，結(jié)合上述觀察到的蘭香草花藥和花粉顏色的變化趨勢(shì)，推測(cè)藍(lán)色花粉的形成也許與花青素成分的存在有關(guān)。據(jù)此，選取了蘭香草的花粉進(jìn)行了花青素成分的靶向質(zhì)譜定量檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在花粉中總共檢測(cè)到6 大類花青素的14種成分（表1），包括矢車菊素、飛燕草素、錦葵色素、芍藥花色素、天竺葵色素和矮牽?；ㄉ?。其中含量最高的是飛燕草素 3-O-葡萄糖苷，為（1.720±0.260）μg·g-1，其次是錦葵花色素3，5-O-二葡萄糖苷，為（1.071±0.3t81）μg·g-1，而天竺葵類色素含量最低（表1，圖3）。從這個(gè)結(jié)果可以推測(cè)，蘭香草花粉的藍(lán)色應(yīng)該是由含量豐富的飛燕草素和錦葵花色素導(dǎo)致顏色的產(chǎn)生。

表1 蘭香草花粉中花青素成分Table 1 Analysis of anthocyanin composition and content in pollen of C.incana

圖3 蘭香草花粉花青素成分分析A.矢車菊素-3，5-O-二葡糖苷；B.矢車菊素-3-O-葡糖苷；C.飛燕草素-3-O-半乳糖苷；D.飛燕草素-3-O-葡糖苷；E.錦葵色素-3，5-O-二葡糖苷；F.錦葵色素-3-O-葡糖苷；G.天竺葵色素-3，5-O-二葡糖苷；H.天竺葵色素-3-O-丙二酰葡糖苷；I.天竺葵色素-3-O-葡糖苷；J.芍藥花色素-3，5-O-二葡萄糖苷；K.芍藥花色素-3-O-葡糖苷；L.矮牽?；ㄉ?3，5-O-二葡糖苷；M.矮牽牛花色素-3-O-丙二酰葡糖苷；N.矮牽牛素-3-O-葡糖苷Fig.3 Analysis of anthocyanin composition and content in pollen of C.incana A.Cya-3，5-O-diglu；B.Cya-3-O-glu；C.Del-3-O-gal；D.Del-3-O-glu；E.Mal-3，5-O-diglu；F.Mal-3-O-glu；G.Pel-3，5-O-diglu；H.Pel-3-O（-6-O-malonyl）-glu；I.Pel-3-O-glu；J.Peo-3，5-O-diglu；K.Peo-3-O-glu；L.Pet-3，5-O-diglu；M.Pet-3-O（-6-O-malonyl）-glu；N.Pet-3-O-glu

3 討論

花青素廣泛分布于花瓣、果實(shí)、葉片和莖等組織中，是構(gòu)成花瓣和果實(shí)的主要色素之一，一般存在于表皮層或皮下的一層薄壁細(xì)胞中，具有吸引昆蟲傳粉、抵抗紫外線、保護(hù)植物內(nèi)部結(jié)構(gòu)的功能。迄今為止還沒有發(fā)現(xiàn)在植物花器官內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)中存在花青素分布的情況。研究表明，大多數(shù)植物中的花青素的形成是一個(gè)受光誘導(dǎo)的過程，強(qiáng)光可以同時(shí)誘導(dǎo)花青素合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，而黑暗或弱光處理下，結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量會(huì)下調(diào)甚至不表達(dá)，從而抑制花青素的合成［15-16］。而花粉在發(fā)育早期，一直被包裹在密閉黑暗的花粉囊中，并不可能接收到光信號(hào)的刺激，因此花粉表面和絨氈層內(nèi)的花青素如何形成是一個(gè)很有意思的科學(xué)問題，其合成方式可能是一個(gè)區(qū)別于經(jīng)典花青素合成途徑的新的機(jī)制，具有較高的理論研究價(jià)值。

目前所有發(fā)現(xiàn)的花青素類型都是在植物細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成并修飾，通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)儲(chǔ)存于細(xì)胞的液泡中，才能形成有顏色的花青素［17］。迄今為止還沒有發(fā)現(xiàn)花青素能獨(dú)立存在于細(xì)胞之外，并在細(xì)胞表面積累的現(xiàn)象?；ǚ凼且粋€(gè)獨(dú)立的細(xì)胞單元，在其成熟的階段，花粉內(nèi)充滿了淀粉、蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)，并無液泡存在的物理空間，因此花粉細(xì)胞內(nèi)一般沒有花青素的存在，顏色應(yīng)該是在花粉表面積累形成，我們?cè)陲@微鏡下也觀察到蘭香草花粉的藍(lán)色的確是分布于花粉表面（圖1E）。花青素究竟是小孢子發(fā)育過程中積累產(chǎn)生還是從絨氈層細(xì)胞分泌目前尚不清楚，但無論哪種形式的積累，由于存在小孢子細(xì)胞膜或者絨氈層細(xì)胞膜的緣故，花青素都存在一個(gè)跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)倪^程。目前對(duì)花青素的跨膜運(yùn)輸機(jī)制了解還十分有限，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行液泡膜跨膜運(yùn)輸時(shí)，主要通過谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的介導(dǎo)來進(jìn)行［18-21］。花青素如何在小孢子或絨氈層細(xì)胞內(nèi)合成并進(jìn)行細(xì)胞間的運(yùn)輸，是一個(gè)全新的運(yùn)輸機(jī)制。根據(jù)蘭香草花藥和花粉發(fā)育的變化規(guī)律來看，在早期花粉并沒有顏色出現(xiàn)，只是后期隨著花絲變藍(lán)，內(nèi)部的花粉也開始逐漸變藍(lán)，而花絲是和絨氈層緊密連接的結(jié)構(gòu)，提示可能花粉上的花青素是從絨氈層部位最先產(chǎn)生，然后經(jīng)過后期絨氈層細(xì)胞的分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)聚集于小孢子表面，當(dāng)然這個(gè)推測(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)模式需要進(jìn)一步的試驗(yàn)去證實(shí)。

自然界中花粉顏色的變化對(duì)植物的傳粉和進(jìn)化方式究竟有何重要的影響，目前這方面的研究報(bào)道還很少，并且不同的研究的結(jié)論也存在差異。毛茛科黑種草屬（Nigella）不同亞屬之間存在紫羅蘭或黃色的花粉，但觀察發(fā)現(xiàn)傳粉者對(duì)兩者花粉的顏色并沒有選擇性［22］。但是在北美風(fēng)鈴花（Campanula americana）中，喜食蜂卻對(duì)不同顏色的花粉傳粉具有選擇性［23］。近年來，有研究認(rèn)為北美風(fēng)鈴花的不同花粉顏色的形成可能跟緯度、天氣、紫外線的強(qiáng)度差異有關(guān)，深顏色花粉的存在可能是對(duì)高溫和強(qiáng)紫外環(huán)境的一種適應(yīng)［24］。因此，蘭花草的藍(lán)色花粉對(duì)植物的有性繁殖、對(duì)傳粉者的吸引力究竟有何影響，是否也是對(duì)自然生境的一種適應(yīng)還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)來證實(shí)。

總之，本研究通過對(duì)蘭香草藍(lán)色花粉色素發(fā)育變化的觀察，發(fā)現(xiàn)其花粉表面存在一種新的類黃酮成分——花青素，藍(lán)色色素主要在花粉表面和絨氈層細(xì)胞中積累，并證實(shí)藍(lán)色是由飛燕草素和錦葵花素的存在導(dǎo)致，其合成和運(yùn)輸方式還有待于進(jìn)一步深入研究，該發(fā)現(xiàn)對(duì)今后研究花粉花青素的合成、調(diào)控以及花青素的跨膜運(yùn)輸機(jī)制具有重要的生物學(xué)意義。

致謝感謝上海辰山植物園園藝發(fā)展部蔣云工程師提供蘭香草的栽培管理，科研平臺(tái)部邵文高級(jí)工程師提供切片觀察。