莊垚雪,林事成,劉殿娜,高磊,孫靜宜,魏佳,李泉旺

1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029; 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院,北京 100078

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高的一類疾病,其死亡率位居各類癌癥的第一名,非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌的85%[1-2]。NSCLC早期治療以根治性手術(shù)聯(lián)合放化療為主,中晚期治療以放化療為主,復(fù)發(fā)率較高,生存期不佳[3]。多項(xiàng)國內(nèi)外研究證明,中醫(yī)藥具有較好的抗腫瘤輔助治療及對癥支持治療療效,能夠顯著提高腫瘤患者的總生存期[4-6]。首都名醫(yī)王沛教授認(rèn)為肺癌的主要病機(jī)是正氣內(nèi)虛,從而導(dǎo)致肺絡(luò)受損、痰瘀毒聚,故以益氣養(yǎng)陰為法,以“扶正”作為治療之本,以沙參麥冬湯為基礎(chǔ),自擬養(yǎng)肺方以滋陰扶正、解毒散結(jié),臨床觀察表明具有較高的安全性及較好的臨床療效[7-8]。本文首先通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted correlation network analysis,WGCNA)初步探究養(yǎng)肺方治療非小細(xì)胞肺癌的核心靶點(diǎn)、關(guān)鍵通路,然后基于非小細(xì)胞肺癌PC9細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,以期為臨床養(yǎng)肺方抗肺癌的應(yīng)用及中醫(yī)藥防癌治癌機(jī)制的闡明提供參考。

1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析探究養(yǎng)肺方治療非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制

1.1 資料與方法

1.1.1 養(yǎng)肺方活性成分、靶點(diǎn)的篩選在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)[9-10]查找養(yǎng)肺方組方中藥的化學(xué)成分,篩選條件為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性指數(shù)(drug-likeness,DL)≥0.18,確定養(yǎng)肺方的活性成分。利用中醫(yī)藥百科全書(the encyclopedia of traditional Chinese medicine,ETCM)預(yù)測養(yǎng)肺方活性成分相關(guān)靶點(diǎn)[11],以Tanimoto>0.8作為篩選標(biāo)準(zhǔn),獲得養(yǎng)肺方的總靶點(diǎn)。

1.1.2 差異基因分析運(yùn)用GEO平臺[12]下載基因芯片GSE118370。采用GEO2R歸一化數(shù)據(jù)并分析差異基因,差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn):|logFC|≥1且P<0.05。R包ggplot2[3.3.3版本]繪制PCA圖、熱圖和火山圖。

1.1.3 WGCNA分析WGCNA是用于描述不同樣本之間基因關(guān)聯(lián)模式的生物學(xué)方法[13]。運(yùn)用 WGCNA R studio函數(shù)(R包)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),軟閾值估算運(yùn)用pick Soft Threshold 函數(shù)。根據(jù)基因的內(nèi)部連通性和軟閾值,將mRNA聚集成不同的共表達(dá)模塊,進(jìn)而構(gòu)建拓?fù)渲丿B矩陣(topological overlap matrix,TOM),利用hclust函數(shù)對TOM進(jìn)行層次聚類,并根據(jù)拓?fù)渲丿B異度(1-TOM)對基因進(jìn)行分組,最后利用dynamic tree cut算法來確定基因模塊。Module member ship(MM)是基于基因表達(dá)水平的不同,通過計(jì)算模塊中基因與模塊特征基因的相關(guān)性的高低,從而確定模塊中的關(guān)鍵基因,MM值高說明模塊中的基因關(guān)聯(lián)性越高[11]。

1.1.4 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建利用Cytoscape 3.7.2軟件,導(dǎo)入養(yǎng)肺方組方中藥、有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)基因和NSCLC差異基因構(gòu)建的“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)文件,進(jìn)而構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點(diǎn)(node)分別為藥物、活性成分、靶點(diǎn)。各節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系以邊(edge)表示。利用 CytoNCA 插件對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析,設(shè)置“節(jié)度值(Dgree DC)>2倍中位數(shù)”,篩選養(yǎng)肺方治療NSCLC的有效藥效成分。

1.1.5 蛋白相互作用(protein-protein interaction networks,PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將WGCNA中篩選出的Hub基因與藥物靶點(diǎn)取交集得到治療靶點(diǎn),導(dǎo)入STRING11.15平臺[11,14]進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,通過Cytoscape 3.7.2中的CytoHubba[15]篩選出核心治療靶點(diǎn)。

1.1.6 富集分析利用ClusterProfiler R包[16]進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析,Org.Hs.eg.db包用于ID轉(zhuǎn)換。GO分析主要包括生物過程(biological process,BP)和分子功能(molecular function,MF)及細(xì)胞組分(cellular component,CC),以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn),選取前20條GO條目及KEGG信號通路進(jìn)行可視化,并采用ggplot2包進(jìn)行氣泡圖繪制。

1.2 結(jié)果

1.2.1 養(yǎng)肺方活性成分及靶點(diǎn)在TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選出65個(gè)養(yǎng)肺方活性成分;通過ETCM數(shù)據(jù)庫對活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步預(yù)測,共獲得283個(gè)藥物靶點(diǎn)。

表1 養(yǎng)肺方治療NSCLC有效藥效成分信息

1.2.2 NSCLC差異基因分析運(yùn)用GEO平臺下載基因芯片GSE118370后,利用GEO2R歸一化數(shù)據(jù)并分析差異基因,以|logFC|≥1且P<0.05為條件進(jìn)行篩選,共獲得差異基因1 192個(gè),其中上調(diào)基因314個(gè),下調(diào)基因878個(gè)。采用R包ggplot2[3.3.3版本]繪制差異基因的火山圖、PCA圖及熱圖。見圖1。

注:A:基因歸一化圖;B:差異基因火山圖;C:差異基因PCA圖;D:差異基因熱圖。

1.2.3 WGCNA分析運(yùn)用 WGCNA R studio函數(shù)(R包)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),軟閾值β標(biāo)準(zhǔn)為R2>0.50,β=9,最終獲得14個(gè)不同表達(dá)類型歸納的模塊,grey模塊被認(rèn)為是無法被分配給任何模塊的基因集合。以模塊特征屬性為基礎(chǔ),計(jì)算其與臨床表型關(guān)聯(lián),發(fā)現(xiàn)darkgreen模塊與吸煙表型的相關(guān)性最大,其中差異基因32個(gè),相關(guān)系數(shù)為 0.94(P<0.01)。darkgreen模塊與吸煙表型的相關(guān)性最大這一結(jié)果可同樣通過模塊-臨床表型聚類分析獲得,以|MM|>0.8及|GS|>0.1為篩選條件,對darkgreen模塊中的32個(gè)核心基因進(jìn)行篩選,共篩選出30個(gè)基因。將283個(gè)藥物靶點(diǎn)與WGCNA篩選出的30個(gè)核心基因取交集,獲得交集靶點(diǎn)基因10個(gè)。見圖2。

注:A:標(biāo)度獨(dú)立性圖;B:平均連通性圖;C:模塊特征向量聚類圖;D:基因聚類圖;E:模塊與表型相關(guān)熱圖;F:樣本聚類圖;G:GS與MM相關(guān)散點(diǎn)圖;H:差異基因圖;I:養(yǎng)肺方靶點(diǎn)及核心差異基因韋恩圖。

1.2.4 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)利用Cytoscape軟件構(gòu)建 “藥物-成分-靶點(diǎn)”相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò),見圖3,該網(wǎng)絡(luò)包括359個(gè)節(jié)點(diǎn)和933條邊,其中靶基因節(jié)點(diǎn)283個(gè),活性成分節(jié)點(diǎn)65個(gè)。

圖3 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

1.2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)將10個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING網(wǎng)絡(luò)平臺構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)共有8個(gè)節(jié)點(diǎn)及19條邊,下載網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化,運(yùn)用CytoHubba計(jì)算核心靶點(diǎn),選取Degree值前5位的靶點(diǎn),得到核心靶點(diǎn)基因?yàn)镮L-6、PPARG、TP53、MAPK14、CASP9。見圖4。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點(diǎn)圖

1.2.6 富集分析將10個(gè)基因利用ClusterProfiler包[17]進(jìn)行KEGG和GO分析,P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn),共篩選出869個(gè)BP條目,70個(gè)MF條目(未能富集出符合標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞組分)及82個(gè)KEGG富集條目,前20個(gè)條目見圖5。BP主要涉及對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用(regulation of inflammatory response)、類固醇激素反應(yīng)(response to steroid hormone)、細(xì)胞對環(huán)境刺激的反應(yīng)(cellular response to environmental stimulus)、白細(xì)胞凋亡過程(leukocyte apoptotic process)等;MF主要涉及磷酸酶結(jié)合(phosphatase binding)、蛋白磷酸酶結(jié)合(protein phosphatase binding)、泛素-樣蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)、泛素蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin protein ligase binding)及RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase II transcription factor binding)等;KEGG富集通路主要為Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、Notch信號通路(Notch signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)等。

注:A:GO富集分析BP條目氣泡圖;B:GO富集分析MF條目氣泡圖;C:KEGG富集分析氣泡圖。

2 基于PI3K/AKT通路研究養(yǎng)肺方對NSCLC PC9細(xì)胞凋亡的影響

2.1 材料

2.1.1 動物與細(xì)胞人肺腺癌PC9細(xì)胞株(浙江美森細(xì)胞科技有限公司,貨號:CTCC-400-0185)。Wistar大鼠,雄性,40只,體質(zhì)量為(200±20)g,購自斯貝福生物技術(shù)有限公司,許可證號為SCXK(京)2019-0010。Wistar大鼠購回后飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物房,飼養(yǎng)條件:溫度(24±2) ℃,濕度50%±10%,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)食水,晝夜12 h交替。本次實(shí)驗(yàn)得到北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn),倫理審查號為202020。

2.1.2 藥物與試劑養(yǎng)肺方(顆粒劑,北京康仁堂藥業(yè)有限公司)。胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素(美國GIBCO公司,貨號:10099141、25200056、15140122);DMEM高糖培養(yǎng)基(美國 Hyclone公司,貨號:SH30022.01);RIPA(強(qiáng))裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號:P0013K);BCA蛋白定量試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,貨號:KGP902);Reveraid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司,貨號:K1622);SYBR qPCR SuPerMixPlus試劑盒(蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司,貨號:E096-01a);NucleoZol RNA提取試劑(基因科技公司,貨號:740404.6);Tunel檢測試劑盒(北京基譜生物科技有限公司公司,貨號:GPB1829);p-蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司,貨號:4060);p-磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)多克隆抗體(美國Abcam公司,貨號:ab182651);山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG(美國Proteintech公司,貨號:30000-0-AP、SA00001-1)。

2.1.3 儀器熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號:ABI7300);小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國 BIO-RAD公司,型號:1658033);多功能酶標(biāo)儀(美國MD公司,型號:MK3)。

2.2 方法

2.2.1 含藥血清制備黨參15 g,天冬12 g,麥冬15 g,五味子6 g,浙貝母12 g,清半夏15 g,細(xì)辛 3 g,干姜6 g,竹茹9 g,三七6 g,桔梗9 g,顆粒沖泡,制成濃度為40 g·mL-1的藥液。適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠3 d,隨機(jī)分為養(yǎng)肺方組和空白組,每組20只。養(yǎng)肺方組大鼠每日灌胃養(yǎng)肺方溶液,空白組大鼠每日灌胃蒸餾水,每日灌胃2次,灌胃體積為10 mL·kg-1,連續(xù)灌胃7 d,最后1次灌胃1 h后腹主動脈取血,末次給藥灌胃前一晚禁食不禁水。腹主動脈取血離心滅菌后獲得含藥血清。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)PC9培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2,根據(jù)實(shí)驗(yàn)安排將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組及養(yǎng)肺方組。完全培養(yǎng)基含10%胎牛血清或不同比例含藥血清及1%青霉素/鏈霉素。待細(xì)胞生長90%～100%時(shí)以13比例傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 細(xì)胞活力測定將PC9細(xì)胞接種到96孔板中,每孔5 000個(gè)細(xì)胞,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔,并設(shè)空孔組。培養(yǎng)12 h后細(xì)胞分別用不同濃度含藥血清(20%空白組大鼠血清、2.5%含藥大鼠血清+17.5%空白組大鼠血清、5%含藥大鼠血清+15%空白組大鼠血清、10%含藥大鼠血清+10%空白組大鼠血清、15%含藥大鼠血清+5%空白組大鼠血清、20%含藥大鼠血清)的培養(yǎng)基處理。在處理24 h后,棄培養(yǎng)基,并向每個(gè)孔中加入含10 μL CCK8試劑的新鮮培養(yǎng)基100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后采用酶標(biāo)儀檢測每組細(xì)胞在450 nm處的光密度(optical density,OD)值,計(jì)算各組細(xì)胞的細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=[(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)]×100%[17]。

2.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡分析細(xì)胞分為對照(20%空白組大鼠血清)組及養(yǎng)肺方組(10%含藥大鼠血清+10%空白組大鼠血清),培養(yǎng)于6孔板中。給藥完畢后,將裂解溶液加入孔中以收集樣品。在12 000×g,4 ℃離心20 min后采用BCA蛋白濃度測定法測定各樣本蛋白濃度,依據(jù)測定結(jié)果將所有樣本總蛋白濃度統(tǒng)一調(diào)至1 g·L-1。100 ℃高溫煮沸10 min使蛋白變性以便于保存。SDS-PAGE電泳,取10 μL樣本上樣,80 V恒壓電泳,條帶至底部時(shí)停止電泳,100 mA恒流電轉(zhuǎn)100 min,已完成電泳電轉(zhuǎn)的PVDF膜加入快速封閉液封閉30 min結(jié)合PVDF膜上無關(guān)蛋白反應(yīng)位點(diǎn),加入11 000、12 000 稀釋的p-PI3K、p-AKT一抗工作液及15 000 稀釋的GAPDH 4 ℃過夜,加入15 000 稀釋的山羊抗兔(鼠)二抗室溫孵育1 h,超敏ECL發(fā)光液孵育后顯影,ImageJ軟件分析條帶灰度值。

2.2.5 實(shí)時(shí)定量熒光PCR分析細(xì)胞分為對照組(20%空白組大鼠血清)及養(yǎng)肺方組(10%含藥大鼠血清+10%空白組大鼠血清)?？俁NA提取及濃度測定依據(jù)NucleoZol RNA提取試劑說明書完成。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增反應(yīng)體系為2×NovoStart?SYBR qPCR SμperMix Plμs 10μL,上下游引物各1 μL,模版cDNA 1 μL,ROX I 0.4 μL,RNase Free Water 6.6 μL。使用ABI 7300 qRT-PCR系統(tǒng)檢測相關(guān)mRNA的表達(dá),反應(yīng)條件:95 ℃ 1 min,95 ℃ 20 s,60 ℃ 1 min,共 40個(gè)循環(huán),最后一步 60 ℃時(shí)記錄熒光信號,依程序設(shè)定溶解曲線,按照 2-ΔΔCt計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。引物序列為:PI3K:上游引物:5′-ACTGAAGCAGATGTTGAACAAC-3′,下游引物:5′-CATCGATCATTTCCAAGTCCAC-3′;AKT:上游引物:5′-TGACCATGAACGAGTTTGAGTA-3′,下游引物:5′-GAGGATCTTCATGGCGTAGTAG-3′。β-ACTIN:上游引物:5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′,下游引物:5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′。

2.2.6 細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞分為對照組(20%空白組大鼠血清)及養(yǎng)肺方組(10%含藥大鼠血清+10%空白組大鼠血清)。分組給藥后,收集細(xì)胞,制備細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛固定,PBS漂洗后加入500 μL 透膜液,室溫水平搖床孵育15 min。PBS漂洗后,滴加50 μL Tunel檢測液37 ℃孵育5 min。棄去檢測液,PBS漂洗,滴加50 μL Tunel試劑于濕盒內(nèi)37 ℃孵育90 min。棄掉Tunel試劑,PBS漂洗,滴加50 μL FITC試劑工作液37 ℃避光孵育30min。PBS漂洗,爬片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑(含DAPI)封片。樣本于熒光顯微鏡下觀察,每個(gè)樣本隨機(jī)挑選3個(gè)視野,計(jì)算細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)。DAPI染出來的細(xì)胞核為藍(lán)色,TUNEL陽性表達(dá)的細(xì)胞為綠色。

2.3 結(jié)果

2.3.1 CCK8結(jié)果各實(shí)驗(yàn)組PC9細(xì)胞經(jīng)過 24 h 不同濃度養(yǎng)肺方含藥血清干預(yù)后,與對照組比較,細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05),且不具有濃度依賴性,養(yǎng)肺方含藥血清濃度為10%時(shí),細(xì)胞活力最差,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選定養(yǎng)肺方組的藥物干預(yù)方式為10%含藥血清。見圖6及表2。

圖6 細(xì)胞活力圖

表2 CCK8法檢測細(xì)胞活力

2.3.2 養(yǎng)肺方降低PC9細(xì)胞PI3K及AKT表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與對照組比較,養(yǎng)肺方組p-PI3K、p-AKT蛋白及PI3K、AKT的mRNA表達(dá)水平均降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)。見圖7、表3及表4。與對照組比較,養(yǎng)肺方組TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)。見圖8及表4。

圖7 PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白條帶圖

圖8 細(xì)胞凋亡圖

表3 PI3K、AKT蛋白及mRNA表達(dá)水平比較

表4 兩組細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

肺癌為難治性、高發(fā)性、高致死性的一類惡性腫瘤,主要治療手段仍為外科手術(shù)聯(lián)合放、化療,然而放化療在殺滅腫瘤細(xì)胞、控制與縮小腫瘤的同時(shí),其嚴(yán)重的毒副反應(yīng)常給患者帶來極大的痛苦,且有效率仍不理想,使患者身心受到嚴(yán)重的打擊。因此,在保證一定生存質(zhì)量的前提下,尋求有效延長生存期的治療方案尤為迫切。前期臨床研究表明,養(yǎng)肺方聯(lián)合治療可延長患者生存期,改善臨床癥狀并有效提高生存質(zhì)量,然其作用機(jī)制尚不明晰。故本研究選用人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9探討?zhàn)B肺方抑制NSCLC發(fā)展的機(jī)制。

肺癌在中醫(yī)中屬于“積病”“癥瘕”等范疇,治療時(shí)可以扶正益氣、化痰散結(jié)、養(yǎng)陰生津?yàn)榛局蝿t,王沛教授以沙參麥冬湯為基礎(chǔ)方進(jìn)行加減化裁,以益氣養(yǎng)陰為基礎(chǔ),佐以扶正化痰之品,最終形成以黨參、麥冬、天冬、五味子、干姜、細(xì)辛、清半夏、浙貝母、竹茹、桔梗、三七粉為主要成分的養(yǎng)肺方。方中黨參味甘、性平,主歸脾、肺二經(jīng),具有補(bǔ)脾益肺、養(yǎng)陰生津之效,補(bǔ)而不燥故為君藥。麥冬、天冬甘寒質(zhì)潤,主入肺經(jīng),與黨參同用增潤肺生津之效、清甘補(bǔ)之燥烈,故為臣藥。五味子酸甘性溫,主入肺、腎、心經(jīng),為補(bǔ)虛強(qiáng)壯收澀之要藥,上可斂肺止咳、下可固腎平喘、內(nèi)能生津安神、外能固表止汗,與黨參、麥冬、天冬相合則津液得生、諸氣得復(fù),正氣存內(nèi)而邪不可干;癌多為痰、瘀互結(jié)而成,故予半夏燥濕化痰、消痞散結(jié),浙貝母清熱化痰、解毒散結(jié),竹茹清熱化痰、止咳平喘以增強(qiáng)化痰散結(jié)之力;然而痰邪久羈最易耗氣傷血,故純用散痰消積之品唯恐耗傷肺氣,取張仲景“病痰飲者,當(dāng)以溫藥和之”的治療原則,以干姜、細(xì)辛溫化痰飲又合五味子以斂肺止咳平喘,則痰飲消、咳喘止、肺氣不傷;三七粉活血而不耗氣、止血而不留瘀;諸藥相合共奏化痰散結(jié)、止咳化瘀之效,共為佐藥。桔梗以其升散之力載諸藥上行,主歸肺經(jīng)引諸藥入肺,又有宣肺化痰之效,故為佐使藥。半夏、貝母、三七均被證明有較好的抗腫瘤療效,然作用機(jī)制繁雜,據(jù)此本研究先以加權(quán)基因共表達(dá)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘養(yǎng)肺方治療NSCLC的機(jī)制,進(jìn)而進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

通過挖掘養(yǎng)肺方活性成分及靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn),除中藥中常見成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、黃芩苷等發(fā)揮作用,薯蕷皂苷元、金合歡素及人參皂苷 Rh2同樣作為主要活性成分發(fā)揮重要藥理作用,可以抗血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移、抗腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,且主要通過PI3K/AKT信號通路發(fā)揮相關(guān)作用[18-23]。核心靶點(diǎn)IL-6、PPARG、TP53、MAPK14、CASP9。IL-6、MAPK14、CASP9的高表達(dá)與NSCLC的不良預(yù)后密切相關(guān)[24-26],PPARG、TP53的高表達(dá)被證明可抑制NSCLC的發(fā)生發(fā)展[27-28]。

通過對交集靶點(diǎn)的KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),主要包括PI3K/AKT、Wnt、Notch、MAPK等通路,其中PI3K/AKT通路不僅對腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡、侵襲遷移起到重要作用,并且可以干預(yù)上下游靶點(diǎn)或通路以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及相關(guān)藥物耐藥,靶向PI3K/AKT通路的藥物部分已被批準(zhǔn)于臨床使用,并取得一定療效[29-31]。在肺腺癌中,IL-6被認(rèn)為可能是PI3K/AKT通路的上游因子,抑制IL-6/PI3K/AKT信號通路可以抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖[32]。劉曉麗等[33]研究發(fā)現(xiàn),沉默TP53基因表達(dá)可介導(dǎo)PI3K/PTEN/AKT信號通路從而抑制腎透明細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移。Verma等[34]研究發(fā)現(xiàn),MAPK/RAS/RAF/MEK/ERK、PI3K/Akt/mTOR及PPARG下游靶點(diǎn)具有相互串?dāng)_的作用。MAPK及PI3K/AKT信號通路在腫瘤中起到協(xié)同作用,PI3K/AKT通路的高表達(dá)可以激活MAPK通路[35]。PI3K/AKT通路可以誘導(dǎo)糖原合成激酶-3β(GSK-3β)磷酸化[36],磷酸化的GSK-3β可以與β-catenin結(jié)合并促進(jìn)Wnt/β-catenin通路的激活,進(jìn)而促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展并誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[37]。在NSCLC中Notch1和Notch3的激活突變會促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移,同時(shí)抑制P53的表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,Notch信號中的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)則可以在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)與AKT、Wnt等途徑相互作用,以調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[38]。由此推斷,PI3K/AKT通路為本研究富集通路中的關(guān)鍵通路,故本研究針對PI3K/AKT通路,應(yīng)用PC9細(xì)胞,初步驗(yàn)證養(yǎng)肺方抗非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制。結(jié)合PI3K/AKT通路可以串?dāng)_其他相關(guān)通路及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,推測養(yǎng)肺方可能通過抑制PI3K/AKT通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述,養(yǎng)肺方治療NSCLC的主要成分分別為槲皮素、山柰酚、木犀草素、黃芩苷、薯蕷皂苷元、金合歡素及人參皂苷 Rh2,主要靶點(diǎn)為IL-6、PPARG、TP53、MAPK14、CASP9,主要通路包括PI3K/AKT、Wnt、Notch、MAPK等通路。體外實(shí)驗(yàn)證明養(yǎng)肺方可以抑制NSCLC PC9細(xì)胞活性,并可能通過抑制PI3K/AKT通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。NSCLC的發(fā)生發(fā)展為多條信號通路的協(xié)同串?dāng)_作用,并涉及多種細(xì)胞因子,本研究初步檢測養(yǎng)肺方發(fā)揮抑癌作用的關(guān)鍵通路,后續(xù)仍需進(jìn)一步檢測養(yǎng)肺方化合物并分析有效成分,并深入探析相關(guān)信號通路間的機(jī)制,進(jìn)一步探究癌細(xì)胞凋亡機(jī)制,依次驗(yàn)證活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)-預(yù)測細(xì)胞通路的分子機(jī)制,并進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證。