馮翠珍 郭亞萍 鄭巨云 鄭凱 陳全家 陳琴 曲延英

摘要：棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。為創(chuàng)制和改良棉花抗旱新品種提供種質(zhì)資源及遺傳育種研究提供理論依據(jù)，通過(guò)染色體步移技術(shù)明確外源基因在棉花染色體上的插入位點(diǎn)、序列及染色體信息，研究了轉(zhuǎn)梭梭HaNAC基因的棉花材料對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)能力，確定了HaNAC基因的物理位置，鑒定了其遺傳穩(wěn)定性。研究結(jié)果如下：（1）本研究對(duì)轉(zhuǎn)HaNAC38轉(zhuǎn)錄因子基因棉花材料進(jìn)行了分子鑒定，通過(guò)PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)及測(cè)序證實(shí)了轉(zhuǎn)基因植株中分別存在標(biāo)記基因和目的基因序列。應(yīng)用半定量PCR，證明了HaNAC38基因在棉花受干旱脅迫后表達(dá)量上調(diào)。這些結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)HaNAC38基因T6代棉花植株的遺傳穩(wěn)定性。（2）通過(guò)標(biāo)記基因的初步篩選獲得陽(yáng)性植株后，對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行外源基因的檢測(cè)鑒定，利用獲得的序列設(shè)計(jì)染色體步移引物，通過(guò)巢式PCR方法獲得轉(zhuǎn)HaNAC38基因棉花的 T-DNA 序列在基因組中的插入位置，結(jié)果定位到棉花基因組A11染色體第26 202 323 bp處。根據(jù)已知的棉花基因組信息，通過(guò)鑒定，共篩選轉(zhuǎn)HaNAC38基因的棉花材料5個(gè)株系，為創(chuàng)制和改良棉花抗旱新品種提供了親本材料。

關(guān)鍵詞：棉花；轉(zhuǎn)基因；HaNAC38基因；染色體步移；分子鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S562.032 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）15-0029-06

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)重大科技專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：2021A02001-4）。

作者簡(jiǎn)介：馮翠珍（1996—），女，山東菏澤人，碩士，研究方向?yàn)樽魑锓肿舆z傳育種。E-mail：1953857188@qq.com。

通信作者：曲延英，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槊藁ㄟz傳育種及改良，E-mail：xjyyq5322@126.com；陳 琴，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槊藁鼓娣肿佑N，E-mail：cqq0777@163.com。

近年來(lái)，隨著干旱土地面積的擴(kuò)大與氣候影響，作物由于干旱的影響而產(chǎn)生不同程度的減產(chǎn)和品質(zhì)的下降［1］?；蚬こ毯椭参镛D(zhuǎn)化通過(guò)在作物中導(dǎo)入有益的外源基因或沉默內(nèi)源基因的表達(dá)，在作物改良中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。由于性狀的復(fù)雜性，與除草劑、昆蟲(chóng)和抗病等性狀相比，具有非生物抗逆性的作物較少被商業(yè)化。為了推進(jìn)轉(zhuǎn)基因棉花的商業(yè)化進(jìn)程，豐富抗旱性種質(zhì)資源，開(kāi)展抗旱性研究對(duì)于我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的社會(huì)效益、生態(tài)環(huán)境作用及巨大的經(jīng)濟(jì)效益［2］。

NAC（NAM，ATAF，CUC1）轉(zhuǎn)錄因子家族是較大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物中廣泛存在。它可以調(diào)控目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，識(shí)別和結(jié)合啟動(dòng)子中的相關(guān)核苷酸序列，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著作用［3］。從梭梭中克隆出NAC轉(zhuǎn)錄因子基因并進(jìn)行一定功能分析具有重要意義。HaNAC38轉(zhuǎn)錄因子基因含有NAC家族的A、B、C、D、E保守結(jié)構(gòu)域，讀碼框長(zhǎng)879 bp，編碼292個(gè)氨基酸［3］，研究發(fā)現(xiàn)其在干旱脅迫條件下表達(dá)量較高，發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

酵母單雜交技術(shù)證明了GhNAC79基因參與干旱調(diào)控通路并發(fā)揮正調(diào)控作用［4］；研究表明，HaNAC2、HaNAC3基因提高了煙草對(duì)模擬干旱、高溫脅迫的抵抗能力［5］；有試驗(yàn)證實(shí)了HaNAC3轉(zhuǎn)錄因子基因可以提高植物在干旱條件下的生存能力［6］；有試驗(yàn)結(jié)果表明，HaNAC3基因主要通過(guò)改變煙草根部代謝來(lái)抵御干旱脅迫［7］；有研究通過(guò)啟動(dòng)子克隆和分析指出HaNAC38含有20個(gè)TATA-box啟動(dòng)子元件［8］，且具有高轉(zhuǎn)錄水平的順式元件 5′UTR Py-rich stretch，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，HaNAC38基因的表達(dá)量顯著高于梭梭的其他NAC基因。因此認(rèn)為HaNAC38受到干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，響應(yīng)梭梭應(yīng)答干旱脅迫的過(guò)程。

研究指出，外源基因在轉(zhuǎn)基因后代中整合到受體植物基因組中并穩(wěn)定表達(dá)是穩(wěn)定遺傳的主要標(biāo)準(zhǔn)［8］，以及持續(xù)表現(xiàn)出其目標(biāo)性狀。轉(zhuǎn)基因植物在后續(xù)生產(chǎn)中具有實(shí)用價(jià)值的關(guān)鍵是目標(biāo)性狀在后代中穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)。明確轉(zhuǎn)基因棉花的遺傳穩(wěn)定性和抗旱性可為抗旱種質(zhì)資源的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)［9］。本研究通過(guò)染色體步移對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花材料轉(zhuǎn)HaNAC38基因插入序列位置鑒定及檢測(cè)方法進(jìn)行初步探究，為研究外源基因整合到染色體位置對(duì)表型的影響提供理論基礎(chǔ)，以期為抗逆轉(zhuǎn)基因棉花的更好發(fā)展提供材料來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因棉花材料為筆者所在課題組前期獲得的轉(zhuǎn)梭梭HaNAC38基因的T6代株系與受體材料D5，其他轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N轉(zhuǎn)NHX基因等材料均由筆者所在試驗(yàn)室保存。供試材料于2021年春季正常播種于新疆塔城地區(qū)沙灣市144團(tuán)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花育種基地轉(zhuǎn)基因區(qū)。采用人工點(diǎn)播模式進(jìn)行播種，1膜3行，株距為10 cm。

植物組織RNA快速提取試劑盒與DH5α大腸感受態(tài)購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，染色體步移試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。引物的合成由北京博邁德基因技術(shù)有限公司完成，測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，其他試劑購(gòu)自國(guó)內(nèi)外各廠家均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 試驗(yàn)方法與步驟

1.2.1 植株基因組DNA的提取

在棉花3葉期從轉(zhuǎn)HaNAC38株系中隨機(jī)選6株，掛牌標(biāo)記，取幼葉分別放入2 mL離心管中，裝入硅膠使其干燥，以十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）改良法提取葉片基因組DNA。從棉花葉片中獲得的基因組 DNA 進(jìn)一步純化后用于交錯(cuò)式熱不對(duì)稱(chēng)（TAIL）-PCR［10］，利用超微量分光光度計(jì)法檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，將DNA稀釋成50～100 ng/μL備用。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因棉花植株標(biāo)記基因的PCR檢測(cè)

以改造后的pCAMBIA1304載體上的標(biāo)記基因NPTII序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行標(biāo)記基因PCR檢測(cè)［11］，PCR反應(yīng)體系為：含模板DNA 1 μL、上下游引物各1 μL、普通mix 12.5 μL、最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)足 25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；90 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；最后4 ℃保溫。將顯示陽(yáng)性條帶的植株進(jìn)行下一步目的基因的PCR檢測(cè)。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因棉花目的基因的PCR檢測(cè)

以目的基因設(shè)計(jì)特異性引物，將標(biāo)記基因顯示陽(yáng)性條帶的植株，進(jìn)行目的基因PCR檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將顯示陽(yáng)性條帶的植株用染色體步移技術(shù)進(jìn)行T-DNA插入位置鑒定。

1.2.4 染色體步移（巢式PCR）擴(kuò)增檢測(cè)

特異性引物設(shè)計(jì)見(jiàn)圖1（以獲取 5′序列為例）。

根據(jù)已知序列區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物（引物序列見(jiàn)表1），本研究經(jīng)過(guò)多輪篩選得出染色體步移試劑盒內(nèi)隨機(jī)引物AP3的擴(kuò)增效果較好。

本試驗(yàn)使用染色體步移試劑盒中的AP3作為兼并引物，以外源基因?yàn)橐阎卧O(shè)計(jì)引物，命名為SP1、SP2、SP3，巢式反應(yīng)體系見(jiàn)表2，PCR擴(kuò)增過(guò)程見(jiàn)表3。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序

利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收的PCR產(chǎn)物用過(guò)線(xiàn)性化載體試劑盒（pEASY-T5 Zero Cloning Kit）進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化并涂抹于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與參考序列比對(duì)，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.6 植物組織總RNA的提取

當(dāng)棉花幼苗處于3葉期時(shí)進(jìn)行干旱處理，用電子秤測(cè)定土樣和幼苗總質(zhì)量，確定樣品含水量，使其自然干旱。鮮質(zhì)量含水量=（mf-md）/mf×100%。其中，mf代表鮮質(zhì)量，g；md代表干質(zhì)量，g。當(dāng)含水量每下降20%時(shí)取樣，分別取含水量為80%、60%、40%、20%的新鮮葉片組織并做好標(biāo)記。用錫箔紙包裹放于液氮罐中，在液氮中取出樣品，通過(guò)試劑盒進(jìn)行RNA提取。

1.2.7 反轉(zhuǎn)錄cDNA

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)提取的植物基因組RNA的完整性，同時(shí)利用超微量分光光度計(jì)法測(cè)定其質(zhì)量和濃度。按照測(cè)定的RNA濃度，選擇合適的量做反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。反轉(zhuǎn)錄體系見(jiàn)表4。

1.2.8 半定量PCR

半定量PCR是介于定量和定性之間的一種判定基因是否差異表達(dá)的方式。在控制其他變量相同的情況下，比較電泳條帶亮度，對(duì)基因表達(dá)量的情況進(jìn)行判斷。半定量PCR反應(yīng)體系為：含模板DNA 1 μL、半定量引物1 μL、普通mix 12.5 μL、最后用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；90 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；最后放 4 ℃ 冰箱保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株標(biāo)記基因PCR檢測(cè)結(jié)果

試驗(yàn)從種植的轉(zhuǎn)HaNAC38基因的T6代1個(gè)株系中隨機(jī)抽檢6株材料，提取材料嫩葉基因組DNA，用標(biāo)記基因NPT[QX（Y15]Ⅱ[QX）]的引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系均擴(kuò)增出795 bp片段，轉(zhuǎn)基因植株陰性對(duì)照無(wú)條帶（圖2）。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖3，除序列兩端外，其他序列均與NPT[QX（Y15]Ⅱ[QX）]序列比對(duì)結(jié)果完全相同。通過(guò)電泳及測(cè)序結(jié)果可以看出，所選取的6株轉(zhuǎn)基因單株均為陽(yáng)性植株。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株目的基因PCR檢測(cè)結(jié)果

用目的基因引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果（圖4）顯示轉(zhuǎn)基因植株能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，轉(zhuǎn)基因陰性植株無(wú)條帶。PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與目的基因HaNAC38的部分序列相似性為100%（圖5）。通過(guò)電泳和測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證了外源基因仍存在于轉(zhuǎn)基因植株。

2.3 染色體步移（巢式PCR）擴(kuò)增檢測(cè)

通過(guò)目的基因HaNAC38序列設(shè)計(jì)染色體步移特異性引物，通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增T-DNA與基因組DNA連接的片段以確定外源DNA插入的邊界［12-13］。取上述各步PCR反應(yīng)液8 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果（圖6）顯示，所取轉(zhuǎn)HaNAC38基因植株在3輪PCR反應(yīng)中均擴(kuò)增出條帶。將第3輪PCR擴(kuò)增出的條帶回收并測(cè)序，結(jié)果如圖7所示。對(duì)載體序列以及測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步比對(duì)發(fā)現(xiàn)， 上區(qū)段的序列與棉花基因組序列具有100％的同源性。NCBI比對(duì)序列定位到棉花基因組A11染色體上第 26 202 323 bp 處（圖8）。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

測(cè)序結(jié)果表明外源基因HaNAC38整合在棉花基因組中， 其與載體都位于棉花A11染色體上，確定了其精確插入位點(diǎn)，但其插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列的功能研究還沒(méi)有相關(guān)的解釋?zhuān)?4-17］。驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果（圖9）顯示，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株擴(kuò)增出了條帶。經(jīng)驗(yàn)證，預(yù)期結(jié)果正確。

2.4 半定量PCR檢測(cè)結(jié)果

提取轉(zhuǎn)HaNAC38基因材料T6代植株總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，做半定量PCR檢測(cè)試驗(yàn)，其中內(nèi)參基因?yàn)槊藁▋?nèi)源基因UBQ7。由圖10可以看出，內(nèi)參基因的擴(kuò)增條帶在不同旱脅迫處理中亮度基本一致。由圖11可以看出，由于旱脅迫處理含水量的不同，目的基因的條帶亮度明暗強(qiáng)弱有所變化。由半定量PCR擴(kuò)增結(jié)果可以看出，隨著干旱脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，含水量越低，條帶越亮，目的基因的表達(dá)量增強(qiáng)，由此初步判斷目的基因在抗旱表達(dá)中發(fā)揮了作用［18-19］。

3 討論與結(jié)論

染色體步移過(guò)程中，由于簡(jiǎn)并引物具有隨機(jī)性，為達(dá)試驗(yàn)?zāi)康?，本試?yàn)設(shè)計(jì)多對(duì)簡(jiǎn)并引物才擴(kuò)增到陽(yáng)性結(jié)果。這也是前人對(duì)于染色體步移擴(kuò)增特點(diǎn)的印證［20］。半定量PCR不但可以比較不同基因表達(dá)量的高低，也可以比較相同基因在不同材料中表達(dá)量的高低。本試驗(yàn)要驗(yàn)證HaNAC38基因是否受到干旱脅迫的影響，控制其他變量相同，改變模板（經(jīng)過(guò)干旱脅迫處理材料的cDNA），看HaNAC38基因表達(dá)是否有變化，即相同基因在不同模板下的半定量PCR。

研究表明，外源基因在轉(zhuǎn)基因后代植株中大多數(shù)能穩(wěn)定遺傳，但也有一些外源基因遺傳是不規(guī)則的，可能是由外源基因拷貝數(shù)不同和整合方式所引起的，甚至?xí)?dǎo)致基因沉默或基因丟失等［21］。通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果可以推斷，外源基因與棉花基因組的整合遵循一定的整合模式，有選擇地切割或插入某些序列，但這些序列是隨機(jī)插入的。這與前人的研究結(jié)論［22］相一致。本研究證明染色體步移技術(shù)可以作為轉(zhuǎn)基因棉花插入位置檢測(cè)有效方法。

前人的研究證明梭梭HaNAC38基因在抗旱中發(fā)揮著重要作用［23］，但關(guān)于轉(zhuǎn)HaNAC38基因后代植株的遺傳穩(wěn)定性卻鮮有研究。為驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)轉(zhuǎn)基因高代植株中外源基因的遺傳、表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，本研究對(duì)轉(zhuǎn)HaNAC38基因棉花材料進(jìn)行了分子鑒定，通過(guò)PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)及測(cè)序證實(shí)了T6代轉(zhuǎn)基因植株中存在標(biāo)記基因PCR、目的基因PCR。又通過(guò)染色體步移檢測(cè)T-DNA插入到轉(zhuǎn)基因植株染色體的具體位置。同時(shí)應(yīng)用半定量PCR［24-28］，證明了HaNAC38基因在棉花受干旱脅迫后表達(dá)量上調(diào)。這些結(jié)果說(shuō)明了轉(zhuǎn)HaNAC38基因T6代棉花的遺傳穩(wěn)定性。[JP+1]以上研究結(jié)果為轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)一步應(yīng)用提供了理論依據(jù)，轉(zhuǎn)HaNAC38基因棉花豐富了抗旱棉花的種質(zhì)資源，為轉(zhuǎn)基因抗旱棉花新品種的培育奠定了基礎(chǔ)［29］。

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