滕達(dá)，司靜濤，趙進(jìn)，秦玲，康文懷*

（1.河北科技大學(xué) 食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.新疆羅菲特果業(yè)科技有限公司，新疆 庫(kù)爾勒 841000）

果酒是指以新鮮水果為原料，經(jīng)破碎或壓榨取汁，通過(guò)全部或部分發(fā)酵釀制而成的低度發(fā)酵酒，酒精含量一般在7% vol～18% vol[1-2]。梨樹(shù)是我國(guó)栽培面積最廣的果樹(shù)之一[3]，梨果肉質(zhì)脆嫩，酸甜爽口，有清熱消火、潤(rùn)肺止咳的功效，是釀造果酒的良好原料[4]。

由于品種、發(fā)酵條件、釀造酵母等方面的影響，水果發(fā)酵前后有機(jī)酸、氨基酸、風(fēng)味等均會(huì)發(fā)生較大的變化[5]。有機(jī)酸組分與含量是果實(shí)品質(zhì)風(fēng)味的重要影響因素，果酒中有機(jī)酸含量不僅對(duì)果酒風(fēng)味、口感和色澤的平衡有重要作用，更對(duì)果酒中各類化學(xué)物質(zhì)及pH 值有重要影響[6]。研究表明，發(fā)酵前蘋(píng)果、梨、李子主要有機(jī)酸為蘋(píng)果酸和檸檬酸，葡萄為酒石酸及其鹽類，獼猴桃和藍(lán)莓為奎寧酸和檸檬酸，柑橘和菠蘿為檸檬酸[7-11]。發(fā)酵后的蘋(píng)果酒中有機(jī)酸主要是蘋(píng)果酸、乳酸、奎寧酸、檸檬酸和琥珀酸[12]；葡萄酒主要有酒石酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸和琥珀酸[10]；獼猴桃酒主要為檸檬酸、乳酸和奎寧酸[13]?？梢?jiàn)，不同果實(shí)發(fā)酵前后有機(jī)酸組成差異明顯。

李彩林等[14]對(duì)紅香酥梨有機(jī)酸含量的研究顯示，紅香酥梨主要有機(jī)酸為蘋(píng)果酸和檸檬酸，次要有機(jī)酸為琥珀酸和酒石酸。岳英等[15]采用高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定了11 種不同梨汁的有機(jī)酸，證實(shí)梨果主要有機(jī)酸為蘋(píng)果酸和檸檬酸。Wu 等[16]使用超高效液相色譜（ultra perfor mance liquid chromatography，UPLC）法對(duì)193 種梨果實(shí)中的有機(jī)酸進(jìn)行研究，認(rèn)為梨果主要有機(jī)酸為蘋(píng)果酸、檸檬酸、奎尼酸、草酸和莽草酸，并根據(jù)有機(jī)酸含量的高低，將梨分為蘋(píng)果酸優(yōu)勢(shì)型和檸檬酸優(yōu)勢(shì)型。目前，對(duì)梨果實(shí)中的有機(jī)酸研究較多，但是關(guān)于不同品種梨酒中有機(jī)酸的組分與含量研究較少，不同溫度對(duì)發(fā)酵后梨酒有機(jī)酸變化的研究也較少。目前關(guān)于有機(jī)酸檢測(cè)方法有酶法[17]、離子色譜法[18-19]、毛細(xì)管電泳法[17]、高效液相色譜法[20-21]。與其他方法相比，使用HPLC 法測(cè)定有機(jī)酸的方法簡(jiǎn)便、快捷、高效，已被廣泛應(yīng)用于水果及其深加工產(chǎn)品的有機(jī)酸測(cè)定。

因此，本試驗(yàn)采用HPLC 法，對(duì)碭山梨、庫(kù)爾勒香梨和庫(kù)爾勒香梨芽變梨3 種梨發(fā)酵前后有機(jī)酸的變化進(jìn)行詳細(xì)研究，并對(duì)不同發(fā)酵溫度梨酒中有機(jī)酸組分和含量進(jìn)行比較，以期為梨酒的發(fā)酵工藝改良提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

碭山梨、庫(kù)爾勒香梨、庫(kù)爾勒香梨芽變梨：采自新疆庫(kù)爾勒地區(qū)，其含糖量為90～97 g/L。

釀酒酵母（QA23）、果膠酶（60 000 U/mL）：法國(guó)Lallemand 公司；淀粉酶（1 000 U/g）：邢臺(tái)萬(wàn)達(dá)生物工程有限公司；白砂糖：市售；偏重亞硫酸鉀（食用級(jí)）、草酸、酒石酸、甲酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、蘋(píng)果酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、馬來(lái)酸、富馬酸、琥珀酸、丙酸（純度≥98%）、磷酸氫二銨（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

Agilent1260 高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技公司；AL204-IC 分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CNW-C18 色譜柱：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；WBL2531H 打漿機(jī)：美的集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 梨酒釀造工藝流程

工藝流程：梨→去皮去核→破碎打漿→酶解→加SO2→過(guò)濾取汁→調(diào)節(jié)糖度→接種酵母→發(fā)酵→倒罐→灌裝。

操作要點(diǎn)：選取無(wú)病害且完熟的梨果削皮去核，用打漿機(jī)打漿，在梨漿中加入0.5 g/L 果膠酶、1 g/L 淀粉酶，4 ℃低溫靜置24 h 后，添加60 mg/L SO2；使用濾布取得果汁，并添加白砂糖使糖度達(dá)到220 g/L；將QA23 酵母在37 ℃水中活化30 min，將梨果汁平均分裝在2 個(gè)發(fā)酵罐中，接種200 mg/L 活化后的酵母后進(jìn)行發(fā)酵；總糖達(dá)到4 g/L 以下時(shí)停止發(fā)酵。發(fā)酵溫度設(shè)置為15 ℃和25 ℃。

1.2.2 色譜條件建立及優(yōu)化

色譜條件：色譜柱CNW-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為磷酸氫二銨（0.01 mol/L，pH2.45）；流速為1.0 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；洗脫條件為等度洗脫。

色譜條件的優(yōu)化：1）流動(dòng)相的比較：流動(dòng)相分別選擇磷酸氫二銨（0.01 mol/L）和磷酸二氫鉀（0.02 mol/L），其他色譜條件同上。2）pH 值的選擇：以磷酸氫二銨溶液為流動(dòng)相，pH 值分別為2.45、2.50、2.60 和2.70，其它色譜條件同上。3）流速的選擇：流速分別為0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min，其他色譜條件同上，考察各有機(jī)酸的分離情況。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別配制5 mg/mL 草酸、酒石酸、甲酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、乙酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸溶液。用流動(dòng)相將上述有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為不同濃度（2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)混合液，并在最優(yōu)色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，繪制各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信噪比（S/N=3、S/N=10）確定檢出限和定量限。

1.2.4 樣品檢測(cè)

取梨果汁、梨酒于離心機(jī)上以8 000 r/min 離心10 min，取上清液用0.45 μm 針孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。具體色譜條件參考1.2.2 的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，主成分分析采用SPSS 22.0 專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

在檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm、柱溫為30 ℃、進(jìn)樣量為20 μL 的條件下，比較流動(dòng)相磷酸氫二鉀和磷酸氫二銨對(duì)有機(jī)酸分離的影響，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為磷酸氫二銨時(shí)，各有機(jī)酸都能完整分離，其保留時(shí)間短、檢測(cè)時(shí)間短且無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象；不同流速（0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min）下各有機(jī)酸分離度不同，研究發(fā)現(xiàn)流速為1.0 mL/min時(shí)分離較好；不同pH 值（2.45、2.50、2.60 和2.70）對(duì)有機(jī)酸的分離效果結(jié)果表明，pH 值為2.45 時(shí)有機(jī)酸分離較好，保留時(shí)間穩(wěn)定、基線平穩(wěn)且無(wú)拖尾現(xiàn)象。因此，最優(yōu)的色譜條件：流動(dòng)相為磷酸氫二銨，其濃度和pH 值分別為0.01 mol/L 和2.45，流速為1.0 mL/min。

本試驗(yàn)對(duì)10 種有機(jī)酸標(biāo)樣進(jìn)行檢測(cè)，但梨汁與梨酒中檢測(cè)到7 種有機(jī)酸，因此僅對(duì)梨果汁、梨酒中7 種有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)分析。采用優(yōu)化后的色譜條件，測(cè)得的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣、梨果汁、梨酒的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 7 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣、梨果汁和梨酒色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 7 organic acids in pear juice and pear wine

由圖1 可知，其有機(jī)酸分離度較好，色譜峰型好，無(wú)拖尾現(xiàn)象。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及加標(biāo)回收率

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

如圖1 所示，梨果汁和梨酒中常見(jiàn)的有機(jī)酸為草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸，因此，以上述7 種有機(jī)酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 有機(jī)酸組分回歸方程Table 1 Regression equation of organic acid composition

由表1 可知，7 種有機(jī)酸的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)均在0.999 以上，方法的檢出限為0.01～0.05 mg/mL，定量限為0.05～0.17 mg/mL，7 種有機(jī)酸的峰面積均在一定濃度范圍內(nèi)與濃度存在良好的線性關(guān)系。

2.2.2 加標(biāo)回收率

對(duì)草酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、酒石酸5 種有機(jī)酸進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品加標(biāo)回收率（n=3）Table 2 Standard recovery rate of samples（n=3）

由表2 可知，各有機(jī)酸的平均加標(biāo)回收率為75.33%～102.01%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。

2.3 不同品種梨發(fā)酵前后有機(jī)酸含量的變化

2.3.1 有機(jī)酸總含量

梨酒發(fā)酵前后有機(jī)酸含量見(jiàn)表3。由表3 可知，3 種梨果汁中，有機(jī)酸總量為3.3～5.0 mg/mL，其中，庫(kù)爾勒香梨果汁的有機(jī)酸總量最高（4.951 mg/mL），庫(kù)爾勒香梨芽變梨果汁最低（3.390 mg/mL）。發(fā)酵后梨酒中有機(jī)酸含量大幅增加，庫(kù)爾勒香梨芽變梨酒中的有機(jī)酸總含量為10.543 mg/mL，在3 種梨酒中含量最高。經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，3 種梨酒中酒石酸、檸檬酸、乳酸、莽草酸和琥珀酸含量均提高，而草酸含量降低，蘋(píng)果酸在碭山梨酒中含量下降，在其他2 種梨酒中含量升高。

表3 梨酒發(fā)酵前后有機(jī)酸含量Table 3 Organic acid content of pear wine before and after fermentation mg/mL

酒石酸的酸味強(qiáng)烈，對(duì)酒體穩(wěn)定性、pH 值和口感有顯著影響[22]。3 種梨果汁中酒石酸含量有較大差異，庫(kù)爾勒香梨芽變梨汁中含量最低（0.410 mg/mL），庫(kù)爾勒香梨汁酒石酸含量約為其2.1 倍，碭山梨果汁中含量最高（1.123 mg/mL）。發(fā)酵后梨酒酒石酸含量明顯升高，約占總有機(jī)酸的40%。不同品種梨酒酒石酸含量差異顯著，庫(kù)爾勒香梨芽變梨酒含量最高，顯著高于碭山梨酒和庫(kù)爾勒香梨酒，碭山梨酒酒石酸含量最低，約為庫(kù)爾勒香梨芽變梨酒的67%。

蘋(píng)果酸是梨果汁中含量較高的一種有機(jī)酸，其酸味爽口，略帶刺激性，有略微的苦澀感，呈味時(shí)間較長(zhǎng)。3 種梨果汁中，碭山梨果汁中蘋(píng)果酸含量最低（1.304 mg/mL），庫(kù)爾勒香梨中含量最高（2.061 mg/mL）。在發(fā)酵后，不同品種梨酒蘋(píng)果酸含量變化不一，碭山梨酒中含量降低，而庫(kù)爾勒香梨和庫(kù)爾勒香梨芽變梨酒中含量升高。

乳酸是梨果汁和梨酒中重要的有機(jī)酸，與蘋(píng)果酸相比，口感溫和，略有生澀感。乳酸提高了發(fā)酵果酒的穩(wěn)定性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)也為果酒增加了復(fù)雜性和水果香氣[23]。因此經(jīng)過(guò)蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵，使酒體更加穩(wěn)定、溫和[24]。碭山梨汁中乳酸含量最低（0.374 mg/mL），顯著低于庫(kù)爾勒香梨汁與庫(kù)爾勒香梨芽變梨果汁。發(fā)酵后的梨酒中乳酸含量顯著增加，其中庫(kù)爾勒香梨芽變梨酒中含量最高，為1.568 mg/mL；碭山梨酒次之；庫(kù)爾勒香梨酒的含量最低，僅為0.861 mg/mL。

檸檬酸在果酒中呈現(xiàn)出一種清新的酸味。庫(kù)爾勒香梨芽變梨果汁的檸檬酸含量為0.075 mg/mL，在3 種梨汁里含量最低。庫(kù)爾勒香梨果汁中檸檬酸含量為0.119 mg/mL，碭山梨果汁含量最高，為0.141 mg/mL。發(fā)酵后檸檬酸含量顯著增加，庫(kù)爾勒香梨酒中含量增加到0.544 mg/mL，且顯著高于其他2 種梨酒。

琥珀酸除酸味外還有類似于咸苦味的特殊味道，其參與果酒中酯類物質(zhì)的代謝及酒味的合成[25]。琥珀酸在梨果汁中占比較高，占總有機(jī)酸含量的16.8%～17.6%。庫(kù)爾勒香梨果汁中琥珀酸含量最高（0.856 mg/mL），碭山梨果汁中含量次之，庫(kù)爾勒香梨芽變梨果汁最低。發(fā)酵過(guò)程中，琥珀酸作為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，可由檸檬酸生成α-酮戊二酸，進(jìn)而合成琥珀酸。因此，發(fā)酵后的梨酒中琥珀酸含量顯著增加，其含量由高到低依次為碭山梨酒＞庫(kù)爾勒香梨酒＞庫(kù)爾勒香梨芽變梨酒。

莽草酸作為生物合成代謝的中間產(chǎn)物，存在于大量植物和微生物中，以莽草酸為中間產(chǎn)物可合成分解為其他物質(zhì)[26]。在梨果汁中莽草酸含量較低，其中碭山梨果汁的含量最高（0.138 mg/mL），顯著高于庫(kù)爾勒香梨芽變梨果汁和庫(kù)爾勒香梨果汁。發(fā)酵后梨酒莽草酸含量也顯著增加。

3 種梨果汁中，草酸含量在庫(kù)爾勒香梨果汁中最高（0.521 mg/mL），庫(kù)爾勒香梨芽變梨果汁最低（0.209 mg/mL）。在酒精發(fā)酵過(guò)程中，草酸形成了草酸鹽沉淀，因此梨酒中草酸的含量明顯下降[27]。發(fā)酵后梨酒中草酸含量顯著降低，庫(kù)爾勒香梨酒降至0.100 mg/mL，庫(kù)爾勒香梨芽變梨酒和碭山梨酒分別降至0.086、0.082 mg/mL。

2.3.2 發(fā)酵溫度對(duì)梨酒有機(jī)酸含量的影響

在15 ℃和25 ℃下發(fā)酵后梨酒有機(jī)酸含量見(jiàn)圖2。

圖2 不同溫度發(fā)酵下有機(jī)酸的差異Fig.2 Differences in organic acids after fermentation at different temperatures

有機(jī)酸含量對(duì)果酒的pH 值、風(fēng)味和化學(xué)穩(wěn)定性都有著重要的影響。發(fā)酵溫度的高低影響釀酒酵母生長(zhǎng)速度進(jìn)而影響果酒中的有機(jī)酸含量。由圖2 可以看出，發(fā)酵溫度為25 ℃的碭山梨酒和庫(kù)爾勒香梨酒中有機(jī)酸總量略高于15 ℃。15 ℃的發(fā)酵條件下碭山梨酒中酒石酸含量為3.23 mg/mL，庫(kù)爾勒香梨酒中為4.123 mg/mL，均高于發(fā)酵溫度為25 ℃的梨酒，庫(kù)爾勒香梨芽變梨酒中則相反。釀造溫度15 ℃的碭山梨酒中檸檬酸含量（0.566 mg/mL）高于25 ℃，而庫(kù)爾勒香梨酒和庫(kù)爾勒香梨芽變梨酒在25 ℃下較高。15 ℃的庫(kù)爾勒香梨酒的蘋(píng)果酸（2.468 mg/mL）與庫(kù)爾勒香梨芽變梨酒中琥珀酸（2.325 mg/mL）含量高于25 ℃的梨酒。

2.4 主成分分析

對(duì)3 種梨酒中有機(jī)酸含量進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 主成分分析Fig.3 Principal component analysis

由圖3 可知，根據(jù)特征值大于1 提取主成分，可提取到2 個(gè)主成分，其方差貢獻(xiàn)率分別為62.3%和19.9%，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為82.2%，表明主成分分析結(jié)果可靠，基本可以反映7 種有機(jī)酸指標(biāo)的信息。

第一主成分（PC1）與酒石酸（0.941）、琥珀酸（0.902）、乳酸（0.891）和檸檬酸（0.890）呈正相關(guān)，而草酸（-0.842）與該主成分呈負(fù)相關(guān)。另一方面，在第二主成分顯示出與蘋(píng)果酸（0.936）呈正相關(guān)，與莽草酸呈負(fù)相關(guān)（-0.626）。考慮到梨汁和梨酒在二維象限中的分布，可以清晰地觀察到不同樣品分離情況。在此以用于發(fā)酵的不同品種和不同發(fā)酵溫度進(jìn)行分離。從圖3中可以看出，庫(kù)爾勒香梨芽變梨果汁和庫(kù)爾勒香梨果汁在PC2 的上半部分，碭山梨果汁在PC2 的下半部分，因此，碭山梨果汁中有較高的莽草酸。發(fā)酵后的3 種梨酒都在PC1 的右側(cè)，因此梨酒中的草酸含量降低，在PC2 中，碭山梨酒在下半部分，庫(kù)爾勒香梨芽變梨酒和庫(kù)爾勒香梨酒在上半部分，所以碭山梨酒擁有較少的蘋(píng)果酸和較高的莽草酸。此外，15 ℃下發(fā)酵的庫(kù)爾勒香梨酒與25 ℃發(fā)酵分離明顯，15 ℃發(fā)酵的酒中擁有更高的蘋(píng)果酸，25 ℃發(fā)酵的酒中擁有更高的莽草酸。

3 結(jié)論

以3 種香梨為原料釀造梨酒，利用HPLC 法測(cè)定酒精發(fā)酵階段發(fā)酵溫度對(duì)有機(jī)酸含量的影響。結(jié)果顯示，與梨果汁相比，發(fā)酵后梨酒中酒石酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸含量升高，草酸含量降低，碭山梨酒中蘋(píng)果酸含量減少，庫(kù)爾勒香梨酒和庫(kù)爾勒香梨芽變梨酒中含量增加。發(fā)酵條件為15 ℃下碭山梨酒的酒石酸和檸檬酸含量高于25 ℃，15 ℃的庫(kù)爾勒香梨酒中蘋(píng)果酸和酒石酸高于25 ℃，與釀造條件25 ℃相比，在15 ℃下庫(kù)爾勒香梨芽變梨酒中琥珀酸含量較高。