徐子昕，胡寶，李東曉，郭金英，王春霞，鄭素月

（河北工程大學(xué) 園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038）

中國美味蘑菇又稱紅柳菇[1]、地層菇、沙菇等，屬擔(dān)子菌綱（Homobasidiomycetidae）傘菌目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）蘑菇屬（Agaricus）[2-3]，其生長地區(qū)較為狹窄，高適生區(qū)位于我國西北部及中亞地區(qū)。國內(nèi)主要分布在新疆天山山脈南北兩側(cè)區(qū)域、西藏西南部、青海海西州、甘肅西北部和內(nèi)蒙古西部地區(qū)[4]。中國美味蘑菇是一種抗旱性強(qiáng)和耐低溫的珍貴野生菌，生長環(huán)境具有諸多特殊性，如晝夜溫差大、光照時(shí)間較長、多生長在荒漠鹽堿草原等[5]。Wang 等[6]于2015年通過形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)遺傳學(xué)的比較鑒定后，將采集于中國新疆維吾爾自治區(qū)艾比湖附近的樣本命名為中國美味蘑菇。據(jù)調(diào)查，位于新疆的博斯騰湖曾是美味蘑菇的主產(chǎn)區(qū)，但在2016 年后，由于湖水上漲、適生區(qū)域狹窄等自然原因使其數(shù)量日趨減少，菌種瀕臨滅絕[4]。

中國美味蘑菇子實(shí)體肥大，菌肉肥厚，味道鮮美，是一種高蛋白、高礦物質(zhì)、低脂肪的食用菌，含有大量對人體有益的礦質(zhì)元素（鈣、鐵、鎂、鈉、鉀、硫、磷）以及維生素B2、維生素B3，子實(shí)體中的8 種必需氨基酸含量占其氨基酸總量的40.5%，對調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能具有重要作用[7-9]。研究表明，美味蘑菇對Hela 細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用，其中的活性成分有可能發(fā)展成為抗宮頸癌治療的化療藥物[10]。中國美味蘑菇在親緣關(guān)系上與世界廣泛栽培的雙孢蘑菇較為接近[11]，是一個(gè)在生產(chǎn)上很有潛力的食用菌新品種。近年來，在野生食用菌資源開發(fā)力度不斷加大和生態(tài)環(huán)境的雙重壓力下，越來越多的野生菌種瀕臨滅絕。為了避免這一情況的發(fā)生，野生菌的人工馴化栽培工作迫在眉睫。中華美味蘑菇作為狹域種，野生資源十分有限，雖已實(shí)現(xiàn)人工實(shí)驗(yàn)室馴化，但大面積栽培的技術(shù)尚不成熟，總體產(chǎn)量較低，生長周期較長，并且不能進(jìn)行商業(yè)化栽培[12]。野生食用菌的鑒定和分類是人們認(rèn)識、開發(fā)和掌握野生食用菌的重要手段。對于野生食用菌的鑒定是學(xué)者了解研究和開發(fā)利用它們的前提。如有毒的野生菌被誤食會給人們的健康帶來巨大傷害。同時(shí)，由于食用菌引種頻繁現(xiàn)象的出現(xiàn)，再加上其無性繁殖導(dǎo)致的外觀形態(tài)的分化不明確，嚴(yán)重影響了我國食用菌資源的管理和開發(fā)利用[13]。本研究以采自青海1 株野生口蘑菌株為研究對象，進(jìn)行真菌種屬（internally transcribed spacer，ITS）鑒定測序及同源序列比對，鑒定其種屬，確定分類學(xué)地位，進(jìn)而對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在為其后續(xù)商業(yè)化栽培提供參考依據(jù)。同時(shí)，對野生食用菌馴化栽培工作及后續(xù)的開發(fā)利用也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

1.1.1 供試菌株與培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)

野生口蘑子實(shí)體采自青海牧民區(qū)，采集于廢棄的羊圈內(nèi)，由河北工程大學(xué)食用菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌種分離和保藏，菌株編號為ZX。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

培養(yǎng)基Ⅰ：馬鈴薯（去皮）200 g，羊糞100 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

培養(yǎng)基Ⅱ：馬鈴薯（去皮）200 g，酵母粉5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

培養(yǎng)基Ⅲ：羊糞200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

1.1.2 材料與試劑

馬鈴薯（去皮）：市售；瓊脂、酵母浸粉（均為分析純）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、蔗糖、乳糖、硫酸鎂（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、蛋白胨、硝酸鉀、尿素、硫酸銨、氯化鉀、氯化鈉、無水碳酸鈣、無水磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鉀、0.25%溴酚藍(lán)（均為分析純）、50×三羥甲基氨基甲烷、乙酸-乙二胺四乙酸（tris acetate-EDTA，TAE）緩沖液：生工生物工程（上海）股份有限公司；VB1、VB2、VB6、VC：華中藥業(yè)股份有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技北京有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-22 臺式高速冷凍離心機(jī)：鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）循環(huán)擴(kuò)增儀：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；DYC2-24EN 型雙垂直電泳儀：北京市六一儀器廠；JY04-3E 凝膠成像分析系統(tǒng)：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離

在超凈工作臺內(nèi)，使用酒精棉球擦拭供試菌株子實(shí)體表面進(jìn)行消毒；將子實(shí)體縱向掰開，用無菌的鑷子在菌蓋與菌柄相連接的部分取下約4 mm 的子實(shí)體塊，并將其接種到PDA 綜合培養(yǎng)基試管斜面中央，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)14 d 后，使用滅菌的接種針挑取菌絲生長狀況良好的菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)接純化，將新的平板置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗條件培養(yǎng)后，放到4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆肹14]。

1.3.2 形態(tài)學(xué)鑒定

觀察子實(shí)體的菌蓋、菌褶、菌柄、菌環(huán)等主要部分，菌落的形狀和顏色，以及菌絲的形態(tài)，參照比對《中國食用菌百科》、《中國真菌志》[15]中對口蘑的描述進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3.3 ITS 鑒定

將供試菌種活化后，采用PDA 固體培養(yǎng)基平板，鋪玻璃紙隔膜培養(yǎng)菌絲體，菌絲長滿平板后刮取菌絲，采用DNA 試劑盒提取菌絲體DNA，并利用ITS 通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATTGATATGC-3'）對其進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延伸50 s，共33 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；終止溫度為4 ℃。之后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，將得到的序列在NCBI 庫中進(jìn)行BLAST 比對，之后采用MEGA 6.0 軟件對該序列以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行同源關(guān)系比較后作圖[16-17]。

1.3.4 適宜母種培養(yǎng)基配方確定

用打孔器取活化好的平板邊緣菌絲，分別接種1.1.1 中4 種設(shè)計(jì)好的培養(yǎng)基中，以PDA 培養(yǎng)基為對照（CK），25 ℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)，各處理重復(fù)3 次，十字劃線法測量菌絲長速[18]。

1.3.5 最適碳源確定

以PDA 綜合培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加麥芽糖、甘露醇、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖代替葡萄糖，添加量為20 g/L，以不添加碳源的處理為空白對照（CK），各處理重復(fù)3 次。定期觀察菌絲長勢，并使用十字劃線法測量菌絲長速。

1.3.6 最適氮源確定

以PDA 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加酵母浸粉、尿素、硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨，添加量為2 g/L，以不添加氮源的處理為空白對照（CK），各處理重復(fù)3 次。定期觀察菌絲長勢，并使用十字劃線法測量菌絲長速。

1.3.7 最適無機(jī)鹽確定

以PDA 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加硫酸鎂、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀6 種無機(jī)鹽，添加量為2 g/L，以不添加無機(jī)鹽的處理為空白對照（CK），各處理重復(fù)3 次。定期觀察菌絲長勢，并使用十字劃線法測量菌絲長速。

1.3.8 最適生長因子確定

以PDA 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加50 mg/L 的VB1、VB2、VB6、VC，以不添加生長因子的處理為空白對照（CK），各處理重復(fù)3 次。定期觀察菌絲長勢，并使用十字劃線法測量菌絲長速。

1.3.9 最適溫度確定

將菌種活化后接種于PDA 綜合培養(yǎng)基平板上，分別設(shè)置21、23、25、27、29 ℃5 個(gè)溫度處理，各處理重復(fù)3 次。定期觀察菌絲長勢，并使用十字劃線法測量菌絲長速。

1.3.10 最適pH 值確定

將PDA 綜合培養(yǎng)基pH 值分別設(shè)置為5、6、7、8、9，25 ℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)，各處理重復(fù)3 次。定期觀察菌絲長勢，并使用十字劃線法測量菌絲長速。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

野生口蘑子實(shí)體、菌落形態(tài)及菌絲體顯微形態(tài)見圖1。

圖1 菌株形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of the strain

由圖1 可知，子實(shí)體菌蓋光滑，邊緣內(nèi)卷；菌肉呈白色，質(zhì)地較為緊密；菌柄中生粗壯；菌褶稠密，黑色，不等長；菌環(huán)雙層，生于菌柄中部。菌絲呈純白色，氣生菌絲較發(fā)達(dá)。鏡檢可見其菌絲不具有明顯的鎖狀聯(lián)合。

2.2 ITS 鑒定結(jié)果

ITS-PCR 擴(kuò)增后測序獲得該菌株的ITS 序列，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 ITS 序列電泳圖Fig.2 Electrophoresis of ITS sequences

由圖2 可知，擴(kuò)增片段約為744 bp，條帶清晰，特異性較強(qiáng)。將該序列在NCBI 的Genbank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對。當(dāng)菌株的rDNA-ITS 序列相似性達(dá)到99% 時(shí)，即可認(rèn)為它們是相同種；當(dāng)相似性為95%～99%，即可認(rèn)為是相同屬；當(dāng)相似性小于95%時(shí)，即可認(rèn)為它們是相同科[19]。該菌株與中國美味蘑菇（MG-551853.1）的相似性大于99%，同時(shí)參考《中國大型菌物資源圖鑒》[20]比對后，確定該野生菌株為中國美味蘑菇（Agaricus sinodeliciosus）。利用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行同源關(guān)系比較后構(gòu)建Neighbor-joining 系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3 所示。

圖3 菌株基于r-DNA ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the strain based on r-DNA ITS sequences

2.3 適宜母種培養(yǎng)基配方

不同母種培養(yǎng)基對菌絲生長的影響如表1 和圖4所示。

表1 不同母種培養(yǎng)基對菌絲生長的影響Table 1 Effect of different parent culture media on mycelial growth

圖4 不同母種培養(yǎng)基對菌絲生長的影響Fig.4 Mycelial growth in different parent cultures media

由表1 和圖4 可知，PDA 綜合培養(yǎng)基長速和長勢均顯著優(yōu)于其他幾種配方。

2.4 最適碳源

不同碳源對菌絲生長的影響如表2 和圖5 所示。

表2 不同碳源對菌絲生長的影響Table 2 Effect of different carbon sources on mycelial growth

圖5 不同碳源對菌絲生長的影響Fig.5 Effects of different carbon sources on mycelial growth

由表2 和圖5 可知，麥芽糖與葡萄糖長速無顯著差異，二者均顯著優(yōu)于其他碳源?？扇苄缘矸邸⒄崽?、甘露醇和對照長速無顯著差異，甘露醇長勢更佳，乳糖長速最差。因此，最適碳源為麥芽糖和葡萄糖。

2.5 最適氮源

不同氮源對菌絲生長的影響如表3 和圖6 所示。

表3 不同氮源對菌絲生長的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources on mycelial growth

圖6 不同氮源對菌絲生長的影響Fig.6 Effect of different nitrogen sources on mycelial growth

由表3 和圖6 可知，不添加氮源的對照培養(yǎng)基長速和長勢均顯著優(yōu)于其他5 種添加氮源的培養(yǎng)基。因此，不添加氮源更利于其生長。

2.6 最適無機(jī)鹽

不同無機(jī)鹽對菌絲生長的影響如表4 和圖7 所示。

表4 不同無機(jī)鹽對菌絲生長的影響Table 4 Effect of different inorganic salts on mycelial growth

圖7 不同無機(jī)鹽對菌絲生長的影響Fig.7 Effect of different inorganic salts on mycelial growth

由表4 和圖7 可知，添加硫酸鎂、磷酸二氫鉀、碳酸鈣和氯化鈉與不添加無機(jī)鹽對照組相比無顯著差異，添加氯化鉀長速和長勢最差。綜合考慮，最適添加無機(jī)鹽為硫酸鎂。

2.7 最適生長因子

不同生長因子對菌絲生長的影響如表5 和圖8所示。

表5 不同生長因子對菌絲生長的影響Table 5 Effect of different growth factors on mycelial growth

圖8 不同生長因子對菌絲生長的影響Fig.8 Effect of different growth factors on mycelial growth

由表5 和圖8 可知，添加VB2、VC、VB1與不添加生長因子對照組長速無顯著差異，長勢對照組更佳，添加VB6長速和長勢最差。因此，添加微生素未顯著促進(jìn)菌絲的生長。

2.8 最適溫度

不同溫度對菌絲生長的影響如表6 和圖9 所示。

表6 不同溫度對菌絲生長的影響Table 6 Effect of different temperatures on mycelial growth

圖9 不同溫度對菌絲生長的影響Fig.9 Effect of different temperatures on mycelial growth

由表6 和圖9 可知，25 ℃長速和長勢均顯著優(yōu)于其他幾種溫度。

2.9 最適pH 值

不同pH 值對菌絲生長的影響如表7 和圖10 所示。

圖10 不同pH 值對菌絲生長的影響Fig.10 Effect of different pH values on mycelial growth

由表7 和圖10 可知，pH7 與pH8、pH9 的生長速度無顯著差異，但菌絲長勢更佳，三者長速和長勢均明顯優(yōu)于pH5 和pH6 條件下的菌株。

3 討論與結(jié)論

食用菌鑒定作為食用菌研究中的一個(gè)重要組成部分，主要用于區(qū)分和確定其種屬。食用菌的鑒定方法主要有兩種，包括形態(tài)學(xué)鑒定方法和分子水平鑒定方法[21]。傳統(tǒng)食用菌鑒定通常采用形態(tài)觀察法，但由于其受環(huán)境等因素影響較大且僅憑子實(shí)體形態(tài)并不能準(zhǔn)確有效地認(rèn)定其種屬，因而，穩(wěn)定性更強(qiáng)的分子鑒定技術(shù)被越發(fā)廣泛地應(yīng)用到食用菌鑒定中。形態(tài)觀察法和分子鑒定法的結(jié)合大大地提高了野生食用菌鑒定的效率，同時(shí)也為今后的菌種鑒定工作奠定了基礎(chǔ)[22]。

本研究一方面通過形態(tài)學(xué)觀察，即對子實(shí)體形態(tài)、菌絲形態(tài)、菌絲的顯微觀察等；一方面運(yùn)用分子水平鑒定方法進(jìn)行DNA 提取，PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物測序，再通過BLAST 系統(tǒng)比對，使用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)同源關(guān)系進(jìn)行作圖，最終確定這株采自青海的野生菌株為中國美味蘑菇（Agaricus sinodeliciosus），屬擔(dān)子菌綱，傘菌目，蘑菇科，蘑菇屬。它與大肥蘑菇、姬松茸等蘑菇的同源關(guān)系較近。

對不同配方上菌絲生長情況進(jìn)行觀察記錄后得出最佳母種培養(yǎng)基配方為PDA 綜合培養(yǎng)基配方，即馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。通過對美味蘑菇的生物學(xué)特性研究分析得出：最適合其菌絲生長的溫度為25 ℃，10 ℃以下和30 ℃以上均不生長；最適pH7；最佳碳源為葡萄糖和麥芽糖；在PDA 培養(yǎng)基中添加不同無機(jī)鹽和生長因子對菌絲長速影響均不大，綜合考慮最佳無機(jī)鹽為硫酸鎂，不另添加生長因子；添加不同氮源對于菌絲生長速度的影響差異較大，不添加時(shí)菌絲長速最快且長勢最好，因此認(rèn)為中國美味蘑菇是一種高碳低氮需求的食用菌，這與梁倩倩等[23]對絮緣蘑菇的生物學(xué)特性報(bào)道相似。同時(shí)，在美味蘑菇菌絲培養(yǎng)過程中添加氮源可能會抑制其生長。

中國美味蘑菇肉質(zhì)肥厚、味道鮮美。但其生長大多以野生為主，菌絲生長較慢，栽培周期過長，尚不能大規(guī)模馴化栽培。提高中國美味蘑菇菌絲長速，加快栽培周期將為后期研究的重點(diǎn)。