樊明月,李昱瑩,王 璨,侯小改,郭麗麗

(河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,洛陽(yáng) 471023)

全球變暖所導(dǎo)致的干旱等氣候問(wèn)題對(duì)植物造成了嚴(yán)重影響[1],降水量不足以及降水模式改變使干旱成為非生物脅迫中最具破壞性及最能影響作物產(chǎn)量的重要因素[2-5],極大限制了植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育[6-8]。 干旱對(duì)植物的影響貫穿植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段,不僅影響植物的生長(zhǎng)形態(tài),還可引起植物體內(nèi)生理生化發(fā)生變化[9-11]。 已有研究證明,干旱脅迫可誘導(dǎo)植物基因組DNA 甲基化狀態(tài)發(fā)生改變[12-13]。DNA 甲基化是植物自身應(yīng)對(duì)干旱脅迫重要的途徑之一,可通過(guò)改變植物基因表達(dá)水平,引起不同生理反應(yīng),從而適應(yīng)干旱[14-15]。

DNA 甲基化作為表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容,其在調(diào)控基因表達(dá)、維持基因組穩(wěn)定性等方面具有重要作用[16-17]。 隨著對(duì)DNA 甲基化的研究日益精進(jìn)和分子研究技術(shù)手段的不斷發(fā)展,DNA 甲基化檢測(cè)的方法和手段日新月異。 其中,甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技術(shù)是利用限制性?xún)?nèi)切酶HpaII 和MspI 對(duì)基因組DNA 進(jìn)行特異性酶切,酶切后獲得不同的DNA切割片段,以此來(lái)揭示植物基因組DNA 的甲基化狀態(tài)[18]。 該方法中的限制性?xún)?nèi)切酶HpaII 和MspI 可識(shí)別相同的5’-CCGG 序列[19],基于其對(duì)胞嘧啶的敏感程度不同,HpaII 選擇性酶切一條鏈被甲基化的位點(diǎn),而MspI 選擇性酶切雙鏈內(nèi)側(cè)被甲基化的位點(diǎn),HpaII 和MspI 均可切割無(wú)甲基化位點(diǎn)[20-21]。

牡丹(Paeonia suffruticosaAndrews)作為中國(guó)傳統(tǒng)名花,在我國(guó)有著悠久的人工栽培應(yīng)用歷史[22],其觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值被廣泛肯定[23]。 油用牡丹‘鳳丹’(P.ostii‘Fengdan’)作為新興的油用作物,籽油品質(zhì)高,且其生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)[24-25],于2011 年被國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品[26-28]。 隨著國(guó)家對(duì)新型油料作物的大力扶持和油用牡丹產(chǎn)業(yè)鏈的不斷完善,人們對(duì)油用牡丹的關(guān)注度越來(lái)越高,不斷深入研究挖掘其潛在價(jià)值。 本試驗(yàn)研究不同干旱處理下‘鳳丹’基因組DNA 的甲基化差異及其變異模式,分析干旱脅迫對(duì)‘鳳丹’基因組DNA 甲基化帶來(lái)的影響,以期為其在培植繁育等方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為河南省洛陽(yáng)市國(guó)際牡丹園內(nèi)4 年生油用牡丹‘鳳丹’。 挑選長(zhǎng)勢(shì)良好且生長(zhǎng)情況一致的4年生‘鳳丹’,移栽于規(guī)格為20 cm×16 cm×13 cm 的花盆中,所有植株的光照條件一致。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組(按80%的日蒸騰量57.4 mL 澆水)、輕度干旱處理組(按40%的日蒸騰量28.7 mL 澆水)及輕度干旱復(fù)水處理組、重度干旱處理組(干旱過(guò)程中不澆水)及重度干旱復(fù)水處理組。 不同處理組植株均在干旱處理14 d 后出現(xiàn)表型;對(duì)出現(xiàn)表型的輕度干旱復(fù)水處理組和重度干旱復(fù)水處理組植株進(jìn)行復(fù)水處理,對(duì)其正常澆水即為復(fù)水,復(fù)水處理3 d 后,輕度干旱處理組植株恢復(fù)至正常狀態(tài)的表型,復(fù)水處理5 d 后,重度干旱處理組植株恢復(fù)至正常狀態(tài)的表型。 隨機(jī)選取同一處理組不同植株上的完整葉片,混合放在錫箔紙上,包裹、標(biāo)記,放入液氮中低溫冷凍保存、待用。

1.2.2 甲基化敏感多態(tài)性分析

(1)采用改良的CTAB 法提取處理后的‘鳳丹’葉片基因組DNA[29]。

(2)采用付勝杰等[30]建立的MSAP 反應(yīng)體系及程序?qū)ΑP丹’基因組DNA 進(jìn)行酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。 選擇EcoRI∕MspI 和EcoRI∕HpaII 作為雙酶切組合,對(duì)‘鳳丹’基因組DNA 進(jìn)行雙酶切,MSAP分析所用接頭和預(yù)擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1。

表1 MSAP 分析的接頭序列和引物序列Table 1 Adapter sequences and primer sequences for MSAP analysis

(3)為方便酶切體系的配制,需將DNA 樣品質(zhì)量濃度保持一致(400 ng∕μL),酶切體系共20 μL,包含1 μL 基因組DNA、1 μLEcoRI、1 μLHpaII∕MspI、2 μL 10 ×EcoRI Buffer、2 μLHpaII∕MspI Buffer,用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)齊。

(4)酶切后應(yīng)立即進(jìn)行連接反應(yīng),連接反應(yīng)體系共20 μL,包含2 μL 10 ×T4 連接酶Buffer、1 μL T4連接酶、0.4 μLHpaII-MspI 接頭、0.4 μLEcoRI 接頭、10 μL 酶切產(chǎn)物,用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)齊,連接產(chǎn)物需16 ℃過(guò)夜;過(guò)夜連接后的產(chǎn)物于65 ℃溫育10 min 后終止反應(yīng)。

(5)以連接產(chǎn)物作為模板進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增,預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系共20 μL,包含10 μL 連接產(chǎn)物、預(yù)擴(kuò)增引物各0.5 μL、0.2 μLTaqDNA 聚合酶、0.4 μL dNTPs、2 μL PCR Buffer,用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)齊。

(6)預(yù)擴(kuò)增完成后,用稀釋40 倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,MSAP 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系共20 μL,包含2 μL 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物、特異性擴(kuò)增引物各1 μL、10 μLTaqDNAMix,用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)齊。

(7)配制濃度為6%(體積比)的變性聚丙烯酰胺凝膠,將選擇性擴(kuò)增獲得的PCR 產(chǎn)物上樣于聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行垂直電泳,電壓220 V,電泳時(shí)間140 min。 電泳結(jié)束后對(duì)凝膠進(jìn)行銀染,觀察條帶。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

染色顯影后,觀察統(tǒng)計(jì)每個(gè)PAGE 膠圖版的條帶,在同一位點(diǎn)處有清晰條帶顯示記為“1”,無(wú)條帶顯示處記為“0”。 通過(guò)Quantity One 軟件讀取MSAP 條帶信息并轉(zhuǎn)化成表型數(shù)據(jù)0∕1 矩陣,統(tǒng)計(jì)結(jié)果制成Excel 表格。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)‘鳳丹’牡丹表型變化的影響

在干旱脅迫下,‘鳳丹’植株的葉片形態(tài)變化顯著,葉片長(zhǎng)勢(shì)明顯變差,具體表現(xiàn)為:輕度干旱時(shí),植株葉片開(kāi)始下垂,并出現(xiàn)萎蔫和發(fā)黃;重度干旱時(shí),葉片出現(xiàn)嚴(yán)重的干枯卷曲,葉片數(shù)量減少,枝條下垂。 對(duì)不同程度干旱處理后的植株進(jìn)行復(fù)水處理,輕度干旱復(fù)水的植株仍能恢復(fù)其生命活力,外觀上基本恢復(fù)正常,葉片皺縮和萎蔫消失,葉片舒展,但與對(duì)照植株相比,仍表現(xiàn)出葉片發(fā)黃、葉片數(shù)量減少的現(xiàn)象;重度干旱的植株復(fù)水后也仍具有生命力,但與對(duì)照植株相比,葉片發(fā)黃且較為皺縮,枝條下垂(圖1)。

圖1 干旱脅迫對(duì)‘鳳丹’表型變化的影響Fig.1 Effects of drought stress on phenotypic changes of P.ostii ‘Fengdan’

2.2 不同干旱脅迫下‘鳳丹’牡丹總甲基化狀態(tài)

使用EcoRI∕MspI 和EcoRI∕HpaII 組合對(duì)樣品DNA 酶切后,檢測(cè)出4 種甲基化類(lèi)型(圖2),分別為I 型(超甲基化):H、M 均無(wú)帶,DNA 雙鏈外部甲基化或雙鏈內(nèi)外部都甲基化,記為(0,0);II 型(全甲基化):H無(wú)帶、M 有帶,DNA 雙鏈內(nèi)部甲基化,記為(0,1);III 型(半甲基化):H 有帶、M 無(wú)帶,DNA 單鏈外部甲基化,記為(1,0);IV 型(非甲基化):H、M 均有帶,即DNA 雙鏈的CCGG 位點(diǎn)無(wú)甲基化發(fā)生,記為(1,1)。

圖2 選擇性擴(kuò)增凝膠電泳圖譜Fig.2 Selectively amplification gel electrophoresis

以30 對(duì)選擇性引物進(jìn)行擴(kuò)增,通過(guò)觀察比對(duì)篩選出多態(tài)性豐富、重復(fù)性較好的26 對(duì)引物組合,使用MSAP 檢測(cè)分析不同處理下‘鳳丹’牡丹基因組DNA 甲基化狀態(tài)(表2)。 結(jié)果顯示,26 對(duì)選擇性引物共擴(kuò)增出932 個(gè)CCGG 位點(diǎn)。 對(duì)照植株半甲基化位點(diǎn)(III 型)有115 個(gè),半甲基化率為12.34%;全甲基化位點(diǎn)(II 型)86 個(gè),全甲基化率為80.90%。 在不同程度干旱處理組中,輕度干旱和重度干旱的‘鳳丹’牡丹半甲基化位點(diǎn)分別為103 個(gè)和101 個(gè),半甲基化率分別為11.05%和10.84%;全甲基化位點(diǎn)分別為140 個(gè)和174 個(gè),全甲基化率均為85.09%。 輕度干旱誘導(dǎo)‘鳳丹’牡丹基因組DNA 的半甲基化率下降了1.2%;重度干旱誘導(dǎo)其半甲基化率下降了1.5%;輕度干旱和重度干旱脅迫下,‘鳳丹’牡丹的全甲基化率均表現(xiàn)為上升趨勢(shì),升幅為4.2%。

表2 不同干旱條件下‘鳳丹’基因組DNA 甲基化水平Table 2 Genomic DNA methylation levels of P.ostii ‘Fengdan’under different drought stress

干旱復(fù)水處理組的‘鳳丹’牡丹基因組DNA 半甲基化位點(diǎn)數(shù)和全甲基化位點(diǎn)數(shù)均發(fā)生改變。 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:輕度干旱復(fù)水后,‘鳳丹’牡丹的半甲基化位點(diǎn)有119 個(gè),半甲基化率為12.8%,全甲基化位點(diǎn)有161 個(gè),全甲基化率為83.4%,與對(duì)照相比,半甲基化率和全甲基化率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì);與輕度干旱處理組相比,半甲基化率升高了1.7%,全甲基化率降低了1.7%。 重度干旱復(fù)水后,‘鳳丹’牡丹的半甲基化位點(diǎn)有68 個(gè),半甲基化率為9.7%,全甲基化位點(diǎn)有174 個(gè),全甲基化率為85.0%,與對(duì)照相比,半甲基化率降低了2.6%,全甲基化率升高了4.1%;與重度干旱處理組相比,半甲基化率降低了1.1%,全甲基化率降低了0.1%。

2.3 干旱誘導(dǎo)的‘鳳丹’牡丹甲基化變化和去甲基化變化

分析不同程度干旱處理后下‘鳳丹’牡丹基因組DNA 甲基化的變異模式,發(fā)現(xiàn)26 對(duì)選擇性引物在不同處理的樣本中擴(kuò)增產(chǎn)生了4 種變異模式,共15 種條帶類(lèi)型(表3 和表4)。

表3 輕度干旱處理下‘鳳丹’基因組DNA 甲基化模式的變化Table 3 Changes in genomic DNA methylation patterns of P.ostii ‘Fengdan’ under slight drought treatment

表4 重度干旱處理下‘鳳丹’基因組DNA 甲基化模式的變化Table 4 Changes in genomic DNA methylation patterns of Paeonia ostii ‘Fengdan’ under severe drought treatment

模式A:對(duì)照和干旱處理組有相同的甲基化CCGG 位點(diǎn),甲基化位點(diǎn)無(wú)變化,該模式包含3 種條帶類(lèi)型A1、A2、A3,在輕度干旱處理組中占14.78%,在重度干旱處理組中占11.69%。 模式B:與對(duì)照相比,處理組DNA 甲基化水平下降,為去甲基化,該模式包含5 種條帶類(lèi)型,B1—B3 為對(duì)照中的甲基化位點(diǎn)變成非甲基化位點(diǎn);B4 表示與對(duì)照相比,超甲基化位點(diǎn)變?yōu)榘爰谆稽c(diǎn),在重度干旱處理組中該變化高于輕度干旱處理組;B5 表示超甲基化位點(diǎn)變?yōu)槿谆稽c(diǎn)。 該模式在輕度干旱處理組中占39.78%,在重度干旱處理組中占46.00%。 模式C 為甲基化模式,包含5 種條帶類(lèi)型C1、C2、C3、C4、C5,其中C1—C3為對(duì)照中的非甲基化位點(diǎn)變成了甲基化位點(diǎn);C4 為半甲基化位點(diǎn)變?yōu)槌谆稽c(diǎn);C5 為全甲基化位點(diǎn)變成了超甲基化位點(diǎn)。 該模式在輕度干旱處理組中占40.00%,在重度干旱處理組中占38.60%。 模式D為特殊模式,在此類(lèi)別下,對(duì)照與處理組之間的甲基化變異水平不是單純的升高或降低。

3 結(jié)論與討論

‘鳳丹’牡丹在遭受干旱脅迫后,其生長(zhǎng)發(fā)育受到顯著影響。 在不同干旱處理下,‘鳳丹’牡丹的表型發(fā)生改變,葉片會(huì)出現(xiàn)失水皺縮,對(duì)其進(jìn)行復(fù)水處理后,可恢復(fù)活力,表明面對(duì)干旱脅迫時(shí)‘鳳丹’牡丹總體趨向于休眠以應(yīng)對(duì)外界的危害。 大部分高等植物基因組DNA 甲基化水平在30%—50%[31-35],本研究表明,‘鳳丹’牡丹基因組DNA 甲基化水平明顯高于其他植物。 干旱脅迫下的‘鳳丹’牡丹基因組DNA 半甲基化率隨著干旱程度的增加呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì),全甲基化率呈現(xiàn)增加的趨勢(shì);在進(jìn)行干旱復(fù)水后,輕度干旱復(fù)水處理組的半甲基化程度和對(duì)照基本相同,出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是原來(lái)某些非甲基化位點(diǎn)發(fā)生了甲基化使半甲基化水平略微增加;而重度干旱復(fù)水處理組與對(duì)照相比,半甲基化水平顯著降低,表明重度干旱對(duì)其影響較大,可能導(dǎo)致牡丹基因組DNA 產(chǎn)生了一些不可逆轉(zhuǎn)的變化。

在長(zhǎng)期進(jìn)化中,植物形成了自身的抗旱機(jī)制[36]。 DNA 甲基化在植物抵抗非生物脅迫的過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,使植物得以在逆境中生存[37]。 DNA 甲基化作為一種潛在的可遺傳的表觀遺傳現(xiàn)象,在防御外源DNA 入侵和阻遏轉(zhuǎn)座子在基因組移動(dòng)以及調(diào)控高等植物基因表達(dá)方面具有雙重作用[38-39]。許多研究表明,DNA 甲基化參與了植物對(duì)抗非生物脅迫的過(guò)程,且已證明DNA 甲基化是植物參與適應(yīng)干旱脅迫的調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的重要一環(huán)。 植物通過(guò)調(diào)節(jié)基因組的甲基化水平,適應(yīng)外界的非生物脅迫,以保證植物自身能夠適應(yīng)外界環(huán)境而正常生長(zhǎng)[40]。

本試驗(yàn)對(duì)干旱脅迫下‘鳳丹’牡丹基因組DNA 甲基化水平變化進(jìn)行了探究,旨在揭示油用牡丹抗逆能力與其DNA 甲基化程度之間的關(guān)系。 ‘鳳丹’牡丹作為多年生木本植物,其基因組龐大而復(fù)雜,甲基化水平與植物自身基因組復(fù)雜程度緊密相關(guān)[34,41],‘鳳丹’牡丹基因組的高甲基化率可能與其自身基因組包含大量轉(zhuǎn)座子及其他重復(fù)序列有關(guān)。 面對(duì)干旱脅迫,‘鳳丹’牡丹改變自身甲基化水平,其基因組甲基化率上調(diào);在解除脅迫后,‘鳳丹’基因組總甲基化率仍高于對(duì)照,表明DNA 甲基化參與了其對(duì)抗干旱脅迫的過(guò)程。 植物基因組DNA 的甲基化和去甲基化往往還影響著其基因轉(zhuǎn)錄的激活和抑制[42-45],即影響基因的表達(dá),探究參與干旱脅迫調(diào)控DNA 甲基化的基因,挖掘其功能,將成為改良油用牡丹抗性及品質(zhì)后續(xù)工作的重要思路。