張曉麗 東港市中醫(yī)院檢驗科 （遼寧 東港 118301）

內(nèi)容提要：目的：探討熒光RT-PCR 儀與測序儀在丙型肝炎病毒（HCV）基因型檢測中的應(yīng)用，為臨床診斷提供依據(jù)。方法：收集2018 年1 月～2020 年2 月86 例明確診斷為丙型病毒性肝炎患者的外周靜脈血2mL，分別采用熒光RTPCR 儀和測序儀對血清進行HCV 基因分型測定。結(jié)果：熒光RT-PCR 共分型84 例丙型病毒性肝炎患者血清，其中基因1 型56 例（66.7%），非基因1 型28 例（33.3%），2 例分型不確定。測序儀共分型82 例，其中基因1 型59 例（70.2%），均為基因1b 型，非基因1 型23 例（27.3%），包括基因2a 型9 例、3b 型1 例、4a 型2 例、4k 型2 例、6a 型9 例，4 例分型不確定。以測序結(jié)果為“金標準”，RT-PCR 基因分型總符合率為93.9%（77/82），其中1 型符合率為96.6%（57/59），非1 型符合率為87.0%（20/23）。結(jié)論：測序儀是HCV 患者基因分型的金標準，具有準確度高的特點，但是該測序過程繁瑣，耗時長，而熒光RT-PCR 儀同樣是檢測HCV 基因型的重要方法，其一定程度上可以縮短檢測時間，并且也具備較高的準確度。

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是含脂類蛋白包膜的單股正鏈RNA 病毒,為黃病毒科丙型肝炎病毒屬。HCV主要經(jīng)血和血制品傳播，也可通過性傳播。急性和慢性丙型肝炎病毒及HCV 無癥狀攜帶者為HCV 主要傳染源。HCV 感染是全球流行的血源性傳播疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，全球HCV 感染率達3%，每年新發(fā)的丙型肝炎患者多達3.5 萬，患病總數(shù)達1.7 億[1]。我國的HCV 感染率約為3.2%。HCV 感染后容易呈慢性化，70%～85%可演變?yōu)槁愿腥?，并有較高的風險發(fā)展為肝硬化和肝癌。據(jù)報道，慢性丙型肝炎在10～20 年內(nèi)進展為肝硬化的比例達20%～30%，進展為肝癌的比例達5%[2]。HCV 是為單股正鏈RNA 病毒，根據(jù)基因序列差別通常可將HCV 分為6 型（1～6 型）以及多個亞型，我國的HCV 感染患者以1b 型、2a 型基因居多[3]。了解HCV 基因分型對疾病的感染、診療和預(yù)防有重要作用，目前可用于檢測HCV 基因分型的方法較多，但各有優(yōu)缺點。本研究探討熒光RT-PCR 儀與測序儀在丙型肝炎病毒（HCV）基因型檢測中的應(yīng)用價值，報道如下。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

選擇本院2018 年1 月～2020 年2 月86 例丙型肝炎患者，滿足標準：抗-HCV 陽性，且HCVRNA≥5 ×103IU/mL，排除甲型肝炎、乙型肝炎等其他病毒感染以及酒精、藥物性肝損害等。其中男50 例，女36 例，年齡22～81 歲，平均（40.29±13.28）歲。抽取患者的外周靜脈血2mL，分離血清凍存。

1.2 方法

主要試劑與儀器：PTC-200 型熒光PCR 擴增儀（美國MJResearch 公司）；HCV 基因分型檢測試劑盒（上海之江科技生物公司）；MagNAPureLC 核酸自動提取儀及配套試劑（瑞士Roche 公司）；3500dx 基因測序儀（美國ABI 公司）等。

熒光RT-PCR 法：①取樣。取86 例HCV 感染患者2mL空腹靜脈血，以3000r/min 速度，持續(xù)離心處理10min，獲得血清標本，置于-80 °C 溫度冰箱內(nèi)保存；②核酸提取。血清樣本按照QIAampViral RNA Mini Kit 試劑盒說明書進行核酸提取純化；③PCR 檢測。分別取各亞型HCV RT-PCR 反應(yīng)液38 ×（n+2）μL 和酶系2 ×（n+2）μL，（n 等于首檢樣本數(shù)），混勻，各管分別按40μL/管分裝到PCR 反反管中。再在各亞型HCV RT-CR 反應(yīng)液中分別加入25μL 礦物油。HCV RNA 或質(zhì)控品的提取產(chǎn)物各10μL?；靹?，放入PCR 儀，按下列程序條件擴增：42 °C30min；95 °C 3min；再按94 °C 20S→55 °C 20S→72 °C 30S，循環(huán)10 次；再按94 °C 15S → 60 °C 45S，循環(huán)30 次。結(jié)果判讀：①HCV 陰性：管1、管2 中Ct 值均為40 或UNDET；②基因1 型：管1、管2 中Ct 值≤35，且兩管差值的絕對值≤3.5；③非基因1 型：管1、管2 中Ct 值≤35，但兩管差值的絕對值＞3.5，或管1 中Ct 值≤35，而管2 中Ct為40 或UNDET。

測序法：① HCV-RNA 標本制備。選擇德國Qiagen QIAamp 病毒RNA 抽提試劑盒從HCV 感染患者的200μL 血清標本中提取HCV 病毒RNA，將病毒RNA 置于-80 °C 環(huán)境下保存待檢；②基因擴增。選擇HCV 感染患者的HCV NS5B基因區(qū)域作為測序重點，擴增方法選擇反轉(zhuǎn)錄方法。擴增完畢通過擴增曲線判斷是否擴增成功。將擴增成功的片段純化，然后進行測序反應(yīng)，產(chǎn)物再次純化后準備上級；③測序。將純化產(chǎn)物加入96 孔板，過夜檢測；④分析。將測序片段提交到NCBI 網(wǎng)站進行基因分型分析（www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）。

1.3 觀察指標

統(tǒng)計兩種檢測方法的基因型檢測結(jié)果；對比兩種檢測方法的檢測符合率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

以SPSS23.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05 為差異顯著。

2.結(jié)果

RT-PCR 共分型84 例，其中基因1 型56 例（66.7%），非基因1 型28 例（33.3%），2 例分型不確定。測序儀共分型82例，其中基因1 型59 例（70.2%），均為基因1b 型，非基因1型23 例（27.3%），包括基因2a 型9 例、3b 型1 例、4a 型2 例、4k 型2 例、6a 型9 例，4 例分型不確定。以測序結(jié)果為“金標準”，RT-PCR 基因分型總符合率為93.9%（77/82），其中1型符合率為96.6%（57/59），非1 型符合率為87.0%（20/23）。

3.討論

HCV 感染呈世界性分布，全世界至少有2 億HCV 感染者。國外丙肝病毒的感染率在1%～1.4%。HCV 是輸血后肝炎和散發(fā)性非甲非乙型肝炎的主要病原。HCV 感染持續(xù)時間可達20～30 年，并可進一步發(fā)展為慢性活動性肝炎和肝硬化；在許多國家，HCV 已成為肝細胞癌的主要病因[4]。由于對血液制品的嚴格篩選和相關(guān)危險行為矯正，近年呈流行下降趨。我國為HCV 中高度感染區(qū)，感染率僅次于乙型肝炎。約5%的人患丙型肝炎，占輸血后肝炎的78%～94%，占散發(fā)性肝炎的24%。前瞻性研究表明，約60%～80%的丙型肝炎感染者發(fā)展為慢性肝炎，其中約25%最終發(fā)展為肝硬化或肝癌[5]。HCV 基因具有高度的異源性與變異性，在基因組各域都可發(fā)生變異位點。HCV 基因不同分型可表現(xiàn)出不同的生物學(xué)特性，如病毒的復(fù)制能力、致病能力以及對治療藥物的敏感度等[6]。HCV 基因型的分布存在地理性差異，亞洲國家以1b 型更常見，美國以1a 型更常見，北美和歐洲以2a、2b型更常見[7]。我國1～6 型基因均有分布，其中最多的當屬1b型，在南方1b 型可占到90%及以上，其次常見的就是2a 型，北方居多?？梢姡覈煌貐^(qū)、不同人群的HCV 基因型及亞型分布存在著很大差異。

HCV RNA 屬于黃病毒家族的正鏈RNA 病毒，其感染的最大特點是極易演變?yōu)槁?，并可進一步發(fā)展為肝硬化。目前干擾素為治療的主要藥物，但其價格昂貴且療效不確切，而且在丙型肝炎抗病毒治療中的劑量、療程、適應(yīng)癥等方面無確定的統(tǒng)一指標。研究結(jié)果一致證明：患者血清中病毒含量不僅能反映疾病進程和肝損傷程度，還能較好地預(yù)測、指導(dǎo)和評價干擾素治療[8]。據(jù)報道，HCV2 型、3 型基因患者經(jīng)利巴韋林聯(lián)合干擾素治療1 年，持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的比例可達到70%～80%，而1 型、4 型基因患者僅為40%～50%[9]。

因此，應(yīng)用HCV RNA 水平監(jiān)測干擾素治療過程遠比用ALT 水平更為合適，能夠幫助醫(yī)生制定抗病毒治療的個體化方案。且臨床研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)ALT 正常而HCV RNA 陽性的患者實際上患有慢性活動性肝炎。因此了解患者體內(nèi)的HCV RNA 水平對于了解病變程度、特別是預(yù)測、評價干擾素治療反應(yīng)、制定療程有十分重要的意義，同時也使丙型肝炎發(fā)病機制的研究進入量化階段[10]。實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA 擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。Real-timePCR 是在PCR 擴增過程中，通過熒光信號，對PCR 進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的CT 值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。實時熒光定量PCR 常見的檢測方法包括SYBRGreenⅠ法及TaqMan 探針法，前者是在PCR 反應(yīng)體系中，加入過量SYBR 熒光染料，SYBR 熒光染料特異性地摻入DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR 產(chǎn)物的增加完全同步。后者則是探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR 擴增時，Taq 酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR 產(chǎn)物的形成完全同步。DNA 測序儀的工作原理主要基于Sanger 發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法或Maxam-Gilbert 發(fā)明的化學(xué)降解法。這兩種方法在原理上雖然不同，但都是根據(jù)在某一固定的位點開始核苷酸鏈的延伸，隨機在某一個特定的堿基處終止，產(chǎn)生以A、T、C、G 為末端的四組不同長度的一系列核苷酸鏈，在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳進行片段的分離和檢測，從而獲得DNA 序列。由于雙脫氧鏈末端終止法更簡便和更適合于光學(xué)自動探測，因此在單純以測定DNA 序列為目的的全自動DNA 測序儀中應(yīng)用廣泛。而化學(xué)降解法在研究DNA 的二級結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)-DNA 相互作用中具有重要的應(yīng)用價值。雙脫氧鏈末端終止法測序是利用DNA 的體外合成過程-聚合酶鏈反應(yīng)，在DNA 聚合酶的催化作用下，以目的DNA 為模板，按照堿基互補配對原則，在引物的引導(dǎo)下完成。普通的PCR 反應(yīng)體系中，加入的核苷酸單體為4 種2'-脫氧核苷三磷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)。測序反應(yīng)體系中，加入的核苷酸單體為2',3 雙脫氧核苷三磷酸( ddNTP)。與dNTP 相比，ddNTP在脫氧核糖的位置上缺少個羥基，反應(yīng)過程中雖然可以在DNA 聚合酶作用下，通過其磷酸基團與正在延伸的DNA 鏈的末端脫氧核糖-OH 發(fā)生反應(yīng)，形成磷酸二酯鍵而摻入到DNA 鏈中，但它們本身沒有-OH，不能同后續(xù)的dNTP 形成磷酸二酯鍵，從而使正在延伸的DNA 鏈在此終止。

本研究檢測了該地區(qū)86 例HCV 感染者的基因型。目前HCV 基因型的檢測方法較多，測序法被認為是HCV 基因分型的“金標準”，但是成本較高，操作復(fù)雜，技術(shù)要求高，無法在臨床上廣泛開展。近些年出現(xiàn)了一些新的檢測方法，如型特異性引物PCR 法、異源分子遷移率法、型特異性探針核酸雜交分析法、限制性片段長度多態(tài)性分析法等，但仍舊操作繁瑣、成本高，并且靈敏性、特異性不一，尚不能完全滿足臨床需求[11]。有報道顯示，熒光RT-PCR 法的靈敏性、特異性很高，而且操作簡便，成本較低，重復(fù)性好，推薦成為檢測HCV 基因分型的優(yōu)選方法[12]。本研究結(jié)果顯示，86 例HCV 基因分型，1b 型占多數(shù)，RT-PCR 共分型84 例，測序法4 例分型不確定。以測序結(jié)果為“金標準”，PCR 基因分型總符合率為93.9%，其中1 型符合率為96.6%，非1 型符合率為87.0%?？梢?，RT-PCR 法對HCV 基因分型的可靠性高，有望在臨床上廣泛開展。