朱易斌,蔡海明,魏光偉,廖申權(quán),戚南山,李 娟,呂敏娜,林栩慧,胡俊菁,張健騑,陳進(jìn)軍,孫銘飛*

(1.廣東海洋大學(xué),廣東湛江 524088;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽流感等家禽重大疾病防控 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510640)

毛滴蟲(chóng)為寄生于人和脊椎動(dòng)物消化道或泌尿生殖道等的一類原生動(dòng)物,毛滴蟲(chóng)科的各屬包括致病和共生兩大類,寄生于人的毛滴蟲(chóng)包括陰道毛滴蟲(chóng)(Trichomonasvaginalis)、人五毛滴蟲(chóng)(Pentatrichomonashominis)、口腔毛滴蟲(chóng)(Trichomonastenax)和脆弱雙核阿米巴(Dientamoebafragilis),其中陰道毛滴蟲(chóng)是寄生于人的毛滴蟲(chóng)中致病性最強(qiáng)、危害性最大的一類毛滴蟲(chóng)[1]。人感染毛滴蟲(chóng)后會(huì)出現(xiàn)腹痛腹瀉、尿頻尿急、生殖功能障礙等癥狀。寄生于動(dòng)物的毛滴蟲(chóng)包括禽毛滴蟲(chóng)(Trichomonasgallinae) 、胎兒三毛滴蟲(chóng)(Tritrichomonasfoetus)、豬三毛滴蟲(chóng)(Tritrichomonassuis)、巴特里四毛滴蟲(chóng)(Tetratrichomonasbuttreyi)和人五毛滴蟲(chóng)(P.hominis)等[2-3]。動(dòng)物感染毛滴蟲(chóng)后會(huì)出現(xiàn)腹瀉、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、流產(chǎn)不孕等癥狀,給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展。其中人五毛滴蟲(chóng)作為人獸共患毛滴蟲(chóng)存在公共衛(wèi)生傳播風(fēng)險(xiǎn),因此對(duì)于毛滴蟲(chóng)病的準(zhǔn)確診斷尤為重要,快速準(zhǔn)確地診斷對(duì)該病的早期防治也起到關(guān)鍵作用。目前對(duì)于毛滴蟲(chóng)病的診斷方法有鏡檢法、培養(yǎng)法、染色法及分子生物學(xué)方法等,但各種方法存在較大差異。本文綜述不同毛滴蟲(chóng)病診斷方法的原理、優(yōu)勢(shì)和不足,為該病的診斷提供參考。

1 臨床診斷

毛滴蟲(chóng)感染后宿主常出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀(表1),根據(jù)不同臨床癥狀和病理變化可初步做出診斷,鴿感染毛滴蟲(chóng)后出現(xiàn)羽毛松亂、精神沉郁、食欲減退、呼吸困難、腹瀉等癥狀,剖檢發(fā)現(xiàn)口腔、咽部、食道上段及嗉囊黏膜表面局灶性或彌漫性潰瘍,小腸腫大,腸黏膜充血出血[4]。臨床上鴿毛滴蟲(chóng)病容易與鴿痘、鴿念珠菌病、鴿維生素缺乏癥等混淆,因此想要做到準(zhǔn)確診斷鴿毛滴蟲(chóng)病必須結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷。暹羅貓被毛粗亂、腹瀉、糞便中偶見(jiàn)血液,超聲檢查其大腸皺褶局部淋巴結(jié)腫大[5],在結(jié)腸病灶部位分離到胎兒三毛滴蟲(chóng),實(shí)驗(yàn)室確診為胎兒三毛滴蟲(chóng)感染。一名68歲的法國(guó)高加索人患有發(fā)熱、黏液性腹瀉、關(guān)節(jié)疼痛等臨床癥狀,后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查確診為人五毛滴蟲(chóng)陽(yáng)性感染[6]。因此臨床診斷與實(shí)驗(yàn)室診斷相結(jié)合能夠更準(zhǔn)確地診斷毛滴蟲(chóng)病。

表1 部分毛滴蟲(chóng)感染的主要臨床癥狀及病理變化

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 壓滴標(biāo)本鏡檢法

壓滴標(biāo)本鏡檢法主要是將采集的糞便、腸內(nèi)容物或鼻咽、陰道分泌物等檢測(cè)樣品均勻涂抹在載玻片上,然后滴加1～2滴生理鹽水,加蓋玻片后在不同倍數(shù)的物鏡下觀察。在100×鏡下可觀察到梨形或者卵圓形快速游動(dòng)的蟲(chóng)體,而在400×鏡下可觀察到毛滴蟲(chóng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。但是由于不同種的毛滴蟲(chóng)形態(tài)結(jié)構(gòu)相似,單一利用鏡檢法并不能區(qū)分毛滴蟲(chóng)的種類,無(wú)法做到精確地鑒別毛滴蟲(chóng),且在宿主早期感染時(shí)蟲(chóng)體數(shù)量較少容易存在漏檢現(xiàn)象。因此,需要其他檢測(cè)方法進(jìn)一步鑒定。

2.2 體外培養(yǎng)法

通過(guò)對(duì)毛滴蟲(chóng)進(jìn)行體外培養(yǎng)后使蟲(chóng)體數(shù)量增加從而準(zhǔn)確地檢測(cè)毛滴蟲(chóng),該方法可在感染早期蟲(chóng)體數(shù)量較少時(shí)提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率。用肝浸湯培養(yǎng)結(jié)合顯微鏡檢法對(duì)廣東省各地共296份鴿口腔黏液樣品進(jìn)行毛滴蟲(chóng)感染調(diào)查,鴿毛滴蟲(chóng)平均感染率為38.9%[7],其中乳鴿感染率最高為51.3%,青年鴿為48.7%,而種鴿感染率為18.1%,證明該方法比傳統(tǒng)的鏡檢法檢測(cè)準(zhǔn)確率高且成本低。已報(bào)道的適合毛滴蟲(chóng)培養(yǎng)的培養(yǎng)基有很多,如肝浸湯培養(yǎng)基、克勞森培養(yǎng)基、Diamond培養(yǎng)基、蛋黃浸液、TY1-S-33培養(yǎng)基、雞蛋白檸檬酸鈉培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基等[8]。不同的培養(yǎng)基對(duì)毛滴蟲(chóng)的培養(yǎng)存在一定的差異,因此可以利用體外培養(yǎng)來(lái)區(qū)分不同的毛滴蟲(chóng)。用DMEM培養(yǎng)基和肝浸湯培養(yǎng)基分別培養(yǎng)陰道毛滴蟲(chóng),存活時(shí)間遠(yuǎn)高于肝浸湯培養(yǎng)基,但增殖率低于肝浸湯培養(yǎng)基[9]。毛滴蟲(chóng)比較脆弱,生長(zhǎng)條件苛刻,且蟲(chóng)體死亡后迅速降解,因此選擇合適的培養(yǎng)是診斷毛滴蟲(chóng)病的關(guān)鍵。體外培養(yǎng)法的準(zhǔn)確率高于鏡檢法且成本較低,該方法也為后續(xù)毛滴蟲(chóng)的研究提供了寶貴的蟲(chóng)種資源。但是因?yàn)轶w外培養(yǎng)周期較長(zhǎng),不能達(dá)到快速診斷的目的,因此體外培養(yǎng)法也存在一定的局限性。

2.3 染色鏡檢法

染色鏡檢法可用不同染液對(duì)毛滴蟲(chóng)進(jìn)行染色進(jìn)而更清晰地觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu),達(dá)到準(zhǔn)確診斷的目的。目前可用于毛滴蟲(chóng)的染色方法有很多(表2)。不同染色方法對(duì)毛滴蟲(chóng)的染色效果不一樣,所以選擇正確合適的染色方法更有利于觀察毛滴蟲(chóng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。但因部分毛滴蟲(chóng)形態(tài)結(jié)構(gòu)差異不大,染色鏡檢法也很難達(dá)到種屬鑒定,因此該方法主要作為不同毛滴蟲(chóng)病診斷的輔助手段,想要做到更精確的診斷毛滴蟲(chóng)病還需要進(jìn)一步借助分子生物學(xué)方法。

表2 不同毛滴蟲(chóng)染色方法比較

2.4 分子生物學(xué)方法

2.4.1 普通PCR檢測(cè)法 PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),該方法也常用于毛滴蟲(chóng)病的診斷(表3)。PCR檢測(cè)方法主要通過(guò)擴(kuò)增毛滴蟲(chóng)的特異性或具有遺傳分型特性的核酸序列(18S rRNA基因、5.8S rRNA基因和EF-1α基因等[13])后進(jìn)行遺傳分析進(jìn)而達(dá)到種水平鑒定。PCR檢測(cè)技術(shù)的高靈敏性,使毛滴蟲(chóng)感染早期便能準(zhǔn)確檢測(cè)。根據(jù)毛滴蟲(chóng)TV-E650-1基因設(shè)計(jì)了1對(duì)引物,并建立了一種檢測(cè)陰道毛滴蟲(chóng)的方法,PCR擴(kuò)增出438 bp的目的片段,對(duì)模板稀釋1 000倍后仍能明顯擴(kuò)增,表明此方法特異性強(qiáng),靈敏度高,可作為體外診斷陰道毛滴蟲(chóng)病及進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的候選方法[14]。套式PCR(nested-PCR)是一種特殊的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),其原理是利用2對(duì)引物進(jìn)行目的片段擴(kuò)增,第2對(duì)套式引物結(jié)合在第1次PCR產(chǎn)物內(nèi)部,降低PCR反應(yīng)過(guò)程中的錯(cuò)誤擴(kuò)增,因此其具有比普通PCR更特異的優(yōu)點(diǎn)?；谌宋迕蜗x(chóng)EF-1α和18S rRNA基因分別建立兩種套式PCR方法,對(duì)139份鹿糞便樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示其適合臨床上人五毛滴蟲(chóng)感染檢測(cè),而基于18S rRNA基因的套式PCR方法則更適合用人五毛滴蟲(chóng)基因亞型的鑒定[15]。但是套氏PCR需進(jìn)行兩輪擴(kuò)增,過(guò)程比普通PCR繁瑣,但其靈敏性高于普通PCR,因此兩種方法都是近年診斷毛滴蟲(chóng)病的主要方法。

表3 毛滴蟲(chóng)PCR檢測(cè)及陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)

2.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)是在DNA擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中,用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該方法與傳統(tǒng)PCR方法相比具有更加靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn),已作為獸醫(yī)寄生蟲(chóng)學(xué)中一種診斷、定量分析和標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)的有效工具[16]?；赟YBR green染料建立一種通過(guò)擴(kuò)增18S rRNA基因的113 bp區(qū)域來(lái)檢測(cè)禽毛滴蟲(chóng)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析其擴(kuò)增效率,該方法可用于臨床上禽毛滴蟲(chóng)感染的檢測(cè)[17]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法具有更加靈敏特異的優(yōu)點(diǎn),但其作為一種診斷方法所需儀器設(shè)備和試劑要比普通PCR更加昂貴,因此該方法也很少用于毛滴蟲(chóng)病的診斷。

2.4.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isot hermal amplification,LAMP)是一種新的核酸擴(kuò)增基因的檢測(cè)方法,該方法也被用于多種毛滴蟲(chóng)病的診斷,用檢測(cè)陰道毛滴蟲(chóng)的LAMP方法對(duì)121名女性進(jìn)行陰道毛滴蟲(chóng)流行病學(xué)調(diào)查,檢出率(42.06%)高于培養(yǎng)法(8.26%)和PCR方法(7.44%)[30]。對(duì)比PCR方法和LAMP方法,兩種方法都可用于陰道毛滴蟲(chóng)病的診斷,且特異性都很高。但LAMP方法的靈敏度優(yōu)于PCR方法[31]。根據(jù)口腔毛滴蟲(chóng)的ITS和5.8S rRNA基因設(shè)計(jì)特異性引物,建立一種用于檢測(cè)口腔毛滴蟲(chóng)的LAMP方法,該方法特異性和靈敏度均高于普通PCR方法[32]。LAMP方法也被用于檢測(cè)胎兒三毛滴蟲(chóng)。LAMP方法與常規(guī)PCR相比減少了模板熱變性、溫度循環(huán)以及電泳過(guò)程,且檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR,具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)。

2.4.4 原位雜交檢測(cè)法 用核酸堿基對(duì)的互補(bǔ)配對(duì)原則將標(biāo)記好的外源性核酸與細(xì)胞、組織的待測(cè)目的序列進(jìn)行堿基配對(duì)互補(bǔ),結(jié)合成帶有標(biāo)記的目的基因的雜交核酸分子,再利用特定的方法進(jìn)行檢測(cè)。顯色原位雜交方法可直接從寄生組織中檢測(cè)到毛滴蟲(chóng),并對(duì)其寡核苷酸探針進(jìn)行設(shè)計(jì)和評(píng)估,理論上可以檢測(cè)到滴蟲(chóng)目的所有已知成員。有研究設(shè)計(jì)3種探針,用顯色原位雜交技術(shù)對(duì)102只貓的腸組織切片進(jìn)行毛滴蟲(chóng)檢測(cè),結(jié)果在102只貓中檢測(cè)到3只貓的胎兒三毛滴蟲(chóng)呈陽(yáng)性,1只貓的人五毛滴蟲(chóng)呈陽(yáng)性,在對(duì)陽(yáng)性貓的腸組織剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)腸腔內(nèi)有大量毛滴蟲(chóng),并侵入腸黏膜。但是原位雜交檢測(cè)法操作較為繁瑣且靈敏度低于PCR檢測(cè)法,不經(jīng)常用于臨床上毛滴蟲(chóng)病的診斷。

2.5 其他檢測(cè)方法

對(duì)于毛滴蟲(chóng)病的診斷方法還有血清學(xué)方法。商品化的ELISA檢測(cè)試劑盒通常采用直接免疫測(cè)定的方法,通過(guò)過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的單克隆抗體與多種陰道毛滴蟲(chóng)的蛋白進(jìn)行抗原抗體反應(yīng),其檢出率與培養(yǎng)法相同。建立一種鴿毛滴蟲(chóng)感染Dot-ELISA檢測(cè)方法,對(duì)70個(gè)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果48個(gè)鏡檢陽(yáng)性的樣品用Dot-ELISA檢測(cè)有44個(gè)呈陽(yáng)性,陽(yáng)性符合率91.7%,22個(gè)鏡檢陰性的樣品檢測(cè)出12個(gè)呈陰性,陰性符合率54.5%,Dot-ELISA檢測(cè)與鏡檢結(jié)果的總符合率為80%。用牛源T.foetus的TF1.17抗原的1.15和1.17表位產(chǎn)生的單克隆抗體,評(píng)估TF1.17在貓?jiān)碩.foetus的存在和作用,用免疫印記、免疫熒光分析和流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)貓?jiān)碩.foetus中TF1.17抗原的存在,表明TF1.17抗原也可能作為診斷和預(yù)防貓?jiān)碩.foetus感染的靶點(diǎn)。美國(guó)唯一獲得FDA批準(zhǔn)的用于檢測(cè)陰道毛滴蟲(chóng)的方法OSOM滴蟲(chóng)免疫檢測(cè)法,該方法可在10 min內(nèi)達(dá)到有效診斷,使其成為比鏡檢法,培養(yǎng)法和ELISA法更靈敏和快速,但其特異性低于PCR檢測(cè)法。

3 展望

毛滴蟲(chóng)的感染范圍廣,人源毛滴蟲(chóng)對(duì)人類健康造成極大的威脅,動(dòng)物源的毛滴蟲(chóng)對(duì)我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重阻礙我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展。人獸共患毛滴蟲(chóng)形成了一條人畜傳播鏈,造成一定的公共衛(wèi)生傳播風(fēng)險(xiǎn)。因此快速準(zhǔn)確地診斷毛滴蟲(chóng)病就顯得尤為重要,而單一的濕片鏡檢已經(jīng)不能滿足毛滴蟲(chóng)病的準(zhǔn)確診斷,體外培養(yǎng)法和濕片鏡檢法相結(jié)合能夠提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率,也為毛滴蟲(chóng)后續(xù)研究提供了寶貴的蟲(chóng)種資源,但其培養(yǎng)周期較長(zhǎng)不能快速做出診斷,PCR方法靈敏性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)使其成為診斷毛滴蟲(chóng)病的首選方法,該方法可以快速準(zhǔn)確地診斷毛滴蟲(chóng)病,為毛滴蟲(chóng)病的早期防治起到了關(guān)鍵作用,也為毛滴蟲(chóng)的后續(xù)研究提供了技術(shù)支持,是普遍選擇的檢測(cè)毛滴蟲(chóng)的方法。目前對(duì)于毛滴蟲(chóng)病的診斷方法已經(jīng)有了很大的發(fā)展,但部分診斷方法仍存在不足,未來(lái)有望開(kāi)發(fā)出更加快速準(zhǔn)確地診斷毛滴蟲(chóng)病的新方法。