潘越，劉珩，王明，韓政偉,2，郭靖,2，張浩,2，王季姣,4，馬勇,4，杜林峰

（1. 新疆林業(yè)科學(xué)院，新疆烏魯木齊 830063；2. 新疆林業(yè)科學(xué)院佳木國家重點(diǎn)林木良種基地，新疆溫宿 843100；3. 新疆阿克蘇森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，新疆溫宿 843100；4. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；5. 昌吉州林業(yè)技術(shù)推廣中心，新疆昌吉 831100）

山葡萄是葡萄屬中最抗寒的一個(gè)種[1]，新疆獨(dú)特的區(qū)位地理及環(huán)境因素，使山葡萄具備很大發(fā)展?jié)摿?。?019年以來，新疆林科院陸續(xù)從吉林地區(qū)引進(jìn)抗寒性狀表現(xiàn)優(yōu)異的10余個(gè)山葡萄品種， 經(jīng)馴化、區(qū)域栽培試驗(yàn)，從中篩選出4個(gè)適應(yīng)性良好的品種，目前栽培面積穩(wěn)中有升，產(chǎn)量持續(xù)增加。沿天山北麓地帶光照充裕，空氣干燥，晝夜溫差大，有利于糖分累積，但受春季回溫加速和冷暖交織加劇影響，葡萄出土后極易遭受霜凍災(zāi)害[2-3]，影響釀酒葡萄產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，為此篩選出高抗寒的品種對該區(qū)域的釀酒葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重大意義。

低溫脅迫是一種限制植被生長與分布的非生物脅迫因素。關(guān)于植物抗寒性的研究多集中在通過測定相對電導(dǎo)率和Logistic方程推算半致死溫度的方法，對葡萄抗寒性的研究也有很多，如賈金輝等[4]以8個(gè)釀酒葡萄為試材，通過測量一年生枝條相對電導(dǎo)率，基于隸屬函數(shù)值和半致死溫度綜合排序，得出‘雙豐’抗寒性最強(qiáng)；劉鈺璽等[5]基于主成分分析對葡萄抗寒性綜合評價(jià)時(shí)認(rèn)為，評價(jià)結(jié)果與半致死溫度LT50存在極顯著相關(guān)性，通過計(jì)算半致死溫度，可有效判別不同品種間的抗寒性。同時(shí)，通過探究滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)丙二醛[6]、游離脯氨酸[7]和保護(hù)酶系統(tǒng)[8]等與植被抗寒能力的差異性， 亦可間接反映植被的抗寒水平。目前，關(guān)于葡萄的抗寒性及品種的生物學(xué)特性研究很多，但是對天山北麓引進(jìn)的山葡萄抗寒生理評價(jià)方面的研究報(bào)道較少。

為進(jìn)一步探索山葡萄在天山北麓生態(tài)區(qū)域的抗寒生理特性，試驗(yàn)以‘北冰紅’等4個(gè)適應(yīng)性良好的品種為試材，對一年生休眠枝條的抗寒生理指標(biāo)及萌芽率進(jìn)行調(diào)查，綜合評價(jià)各個(gè)品種的抗寒性，為天山北麓生態(tài)區(qū)域篩選自然越冬的高抗寒山葡萄品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

供試的4個(gè)山葡萄品種（北冰紅、雙紅、左優(yōu)紅、雪蘭紅）一年生苗于2019年秋從中國農(nóng)科院特產(chǎn)所（左家）引進(jìn)，窖內(nèi)保存， 2020年3月于溫室內(nèi)煉苗，5月種植在新疆烏魯木齊三坪農(nóng)場山葡萄資源匯集圃。于2021年12月中旬，每個(gè)品種隨機(jī)選取5株樹，采集充分成熟、無病蟲害、長勢一致的一年生枝條。所有枝條的朝向及位置盡量保持一致，使用凡士林涂抹剪口，根據(jù)品種分別裝入聚乙烯保存袋中，于0～4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.1 試驗(yàn)處理

采回的一年生枝條分段，剪成10 cm的長度，自來水沖洗干凈，再用離子水沖刷3次，吸干枝條表面水分，每個(gè)品種分為5份，紗布包裹后置入超低溫冰箱進(jìn)行低溫處理。共設(shè)置0、-10、-20、-30、-40 ℃ 5個(gè)梯度，冷凍降溫幅度及解凍升溫幅度均保持5 ℃·h-1，到達(dá)預(yù)設(shè)溫度時(shí)維持12 h后解凍，測量相關(guān)生理指標(biāo)，每組處理3次重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生理指標(biāo)的測定

相對電導(dǎo)率的測定。將低溫處理后的枝條剪成2～3 cm的小段，避開芽眼，稱取1 g置入三角瓶內(nèi)，加入20 mL重蒸餾水，放置搖床室溫環(huán)境浸提10 h，用電導(dǎo)儀（型號：DDS-11A）測定此時(shí)電導(dǎo)率（R）。用保鮮膜將三角瓶瓶口封好置入沸水浴中蒸煮30 min后浸提10 h，測量此時(shí)電導(dǎo)率R0。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，計(jì)算公式如下：

游離脯氨酸（Pro）采用酸性茚三酮法測定[9]；丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法測定[10]，在450、532、600 nm分別測量吸光度值，計(jì)算含量；可溶性糖采用蒽酮乙酸乙酯法測定[11]；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）還原法測定[11]。

1.2.2 萌芽率的測定

枝條經(jīng)不同低溫梯度處理12 h后扦插于溫室（25～28 ℃）營養(yǎng)缽內(nèi)，每個(gè)營養(yǎng)缽扦插6根枝條，以體積比2∶1的草炭土和鋸末作為基質(zhì)，每組處理重復(fù)3次，1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)枝條芽體萌發(fā)情況，以破磷露白為標(biāo)志，萌芽率（%）=萌發(fā)芽眼數(shù)/扦插枝條芽眼總數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 半致死溫度的計(jì)算[12]

各品種半致死溫度LT50擬合曲線方程為：

其中，Y為相對電導(dǎo)率，a、b是方程參數(shù)，K是常數(shù)，此處取值100。LT50為方程拐點(diǎn)，計(jì)算公式如下：

1.3.2 主成分分析

主成分分析是將多項(xiàng)復(fù)雜指標(biāo)簡化為少數(shù)綜合指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，在保證原始信息損失少且減少變量數(shù)目的前提下，采用少數(shù)變量反映原始信息[13-15]。

在對山葡萄枝條抗寒能力進(jìn)行綜合評價(jià)之前，考慮到各指標(biāo)數(shù)量綱不一致，其中MDA為達(dá)到峰值時(shí)的溫度，其值越低越好，萌芽率、SOD、游離Pro、可溶性糖和半致死溫度均為值越高越好，為此在進(jìn)行主成分分析前，基于隸屬函數(shù)法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

設(shè)X=(X1，X2，…Xn)'，設(shè)n為隨機(jī)向量，其線性關(guān)系式如下：

將PC1代替原來p個(gè)變量X1，X2，…，Xp，PC1會盡可能多的反映原始變量的信息，如若PC1不足以反映原始的絕大多數(shù)信息，則考慮引入PC2，據(jù)此類推。主成分分析成分個(gè)數(shù)m需依據(jù)各個(gè)成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率最終確定。

式中，λ為各成分所對應(yīng)的特征值；k為選定的成分?jǐn)?shù)；i為全部成分?jǐn)?shù)。

主成分分析，通過主成分載荷矩陣Ai和特征向量λ計(jì)算各成分系數(shù)矩陣Ti，計(jì)算公式如下：

其中，A為不同山葡萄品種的成分值，C為各成分的貢獻(xiàn)率（i=1，2，…）。主成分分析采用SPSS 21.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫處理下山葡萄相對電導(dǎo)率的變化

由圖1可見，經(jīng)不同梯度低溫處理后，4個(gè)山葡萄品種的相對電導(dǎo)率與處理溫度呈“S”型上升趨勢，各品種的相對電導(dǎo)率在0～-20 ℃緩慢上升，其中‘左優(yōu)紅’上升幅度最小，‘雙紅’次之，‘北冰紅’上升幅度最大；在-20～-30 ℃表現(xiàn)為急速上升狀態(tài)，在-30 ℃時(shí)，‘雙紅’相對電導(dǎo)率顯著低于其他品種；在-30～-40 ℃，各品種上升幅度趨于平緩。4個(gè)山葡萄品種在相同低溫處理下的相對電導(dǎo)率差異較大，伴隨溫度降低，相對電導(dǎo)率上升幅度不一，增幅在56.95%～65.94%，這主要與品種間抗寒能力的差異有關(guān)。

圖1 不同低溫處理后4個(gè)山葡萄品種枝條相對電導(dǎo)率的變化Figure 1 Changes in relative conductivity of four Vitis amurensis Rupr. branches with different temperatures treatments

2.2 半致死溫度的比較

根據(jù)相對電導(dǎo)率，基于Logistic方程擬合得出不同山葡萄品種的半致死溫度。不同低溫梯度處理下材料的Logistic方程、擬合度及半致死溫度見表1。4個(gè)山葡萄品種的半致死溫度在-29.193～-20.236 ℃，擬合度均大于0.900，達(dá)到極顯著水平。由于半致死溫度與植物抗寒能力呈負(fù)相關(guān)，抗寒性越強(qiáng)，半致死溫度越低[16]。由此得出抗寒性由高到低排序依次是：雙紅＞北冰紅＞左優(yōu)紅＞雪蘭紅。

表1 山葡萄枝條Logistic方程及半致死溫度Table 1 The relative conductivity Logistic equation parameter and semilethal temperature (LT50) of Vitis amurensis Rupr. shoots

2.3 低溫脅迫下各品種枝條抗寒生理指標(biāo)變化

表2可以看出，從0～-30 ℃，MDA、游離Pro、可溶性糖含量和SOD活性均隨著溫度的降低而增加，枝條萌芽率則與之相反?！髢?yōu)紅’在-20、-30、-40 ℃時(shí)， MDA含量顯著高于其他3個(gè)品種；‘北冰紅’‘左優(yōu)紅’‘雙紅’和‘雪蘭紅’游離Pro的最大值分別是55.46、45.38、53.23、49.47 μg·g-1。多重比較可知，‘北冰紅’與‘雙紅’差異不顯著，但均顯著高于‘左優(yōu)紅’；4個(gè)品種的SOD活性均在-30 ℃達(dá)到最高，由高到低排序依次是北冰紅＞雙紅＞左優(yōu)紅＞雪蘭紅；4個(gè)品種可溶性糖含量均伴隨脅迫溫度的降低而增加，均在-40 ℃達(dá)到最大值；枝條萌芽率方面， ‘北冰紅’和‘雙紅’在-10～-30 ℃區(qū)間內(nèi)萌芽率下降幅度較小，‘左優(yōu)紅’和‘雪蘭紅’下降幅度較大，‘左優(yōu)紅’和‘雪蘭紅’在-30 ℃時(shí)的萌芽率顯著低于-10 ℃和-20 ℃，4個(gè)品種均在-40 ℃時(shí)萌芽率最低。

表2 低溫條件對山葡萄枝條抗寒生理指標(biāo)及萌芽率的影響Table 2 Changes of MDA content、Pro content、 SOD activity 、Soluble sugar and Germination rate in branches from different Vitis amurensis Rupr. under low temperature stress

2.4 山葡萄枝條各項(xiàng)生理指標(biāo)的主成分分析

從表3中看出，前兩個(gè)主成分的特征根＞1，且累計(jì)解釋方差達(dá)95.072%，包含了原始數(shù)據(jù)的絕大部分信息，為此提取前兩個(gè)主成分進(jìn)行分析。

表3 主成分特征值Table 3 Component eigenvalue

為突出主要因子對評價(jià)結(jié)果的影響，對公因子進(jìn)行最大正交旋轉(zhuǎn)，得到的旋轉(zhuǎn)載荷矩陣見表4。主成分f1載荷值較高的抗寒指標(biāo)包括萌芽率、半致死溫度、脯氨酸和SOD，載荷權(quán)數(shù)依次為：0.940、0.892、0.868和0.951，這4項(xiàng)指標(biāo)對第1主成分產(chǎn)生正向影響。

表4 旋轉(zhuǎn)后的主成分載荷矩陣Table 4 Rotated principal component loading matrix

第2主成分載荷值較高且符號為正的指標(biāo)包括：丙二醛和可溶性糖，載荷權(quán)數(shù)依次是0.746和0.994，這2項(xiàng)指標(biāo)對第2主成分產(chǎn)生正向影響。

用各指標(biāo)的主成分載荷除以與主成分對應(yīng)的特征根，開算數(shù)平方根，得出2個(gè)主成分每項(xiàng)指標(biāo)對應(yīng)的系數(shù)（即為特征向量），將特征向量與測得的數(shù)據(jù)結(jié)果相乘，即可得出2個(gè)主成分的函數(shù)表達(dá)式（ZX為標(biāo)準(zhǔn)化后的結(jié)果）：

上述表達(dá)式中，X1為萌芽率、X2為半致死溫度、X3為丙二醛、X4為脯氨酸、X5為SOD、X6為可溶性糖。

以各主成分的特征值占特征值總和的比例作為權(quán)重，得出綜合評價(jià)函數(shù)fz=A1f1＋A2f2，其中A1=λ1/(λ1＋λ2)，A2=λ2/(λ1＋λ2)。λ1和λ2分別為2個(gè)主成分的特征值。表5所示，綜合得分由高到低排序依次為：雙紅＞北冰紅＞雪蘭紅＞左優(yōu)紅。

表5 不同山葡萄品種主成分得分、綜合得分及排序Table 5 Scores of each principal component, composite scores and sequence of different Vitis amurensis Rupr. varieties

3 討論與結(jié)論

植被抗寒機(jī)理較為復(fù)雜，評價(jià)一個(gè)品種的抗寒能力無法單獨(dú)通過某一個(gè)指標(biāo)來確定，而應(yīng)通過多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行全面綜合評判[17]。Lyons等[18]發(fā)現(xiàn)，植被遭受凍害時(shí)，受害程度較低或抗寒性較強(qiáng)的品種不但電導(dǎo)率增加幅度較小，且細(xì)胞滲透性變化可以逆轉(zhuǎn)；受害程度較重或抗寒性較差的品種則反之。本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨處理溫度的降低，不同山葡萄品種的電導(dǎo)率逐漸升高，通過Logistic曲線方程模擬了4個(gè)山葡萄品種的LT50范圍在-29.193～-20.236 ℃，天山北麓生態(tài)區(qū)域冬季平均氣溫-10.6 ℃，平均最低氣溫-24.6 ℃，按照本試驗(yàn)判斷‘北冰紅’和‘雙紅’均可自然越冬。然而生產(chǎn)上天山北麓生態(tài)區(qū)域山葡萄自然越冬下，仍表現(xiàn)出干枯、抽梢凍害等現(xiàn)象，推測引起釀酒葡萄產(chǎn)生凍害的原因不僅與當(dāng)年低溫有關(guān)，還與當(dāng)年降雪覆蓋量、控水控肥和開春時(shí)干熱風(fēng)發(fā)生頻率有關(guān)。因此為防止凍害發(fā)生，生產(chǎn)上宜通過鋪設(shè)地膜提高地溫等抗寒輔助措施進(jìn)行預(yù)防。

MDA是植物在受到低溫凍害時(shí)產(chǎn)生的過氧化產(chǎn)物，會對細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒害作用[19-20]。游離Pro可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，防止細(xì)胞過度脫水進(jìn)而增強(qiáng)植被抗寒性[6,21]。本研究發(fā)現(xiàn)，‘雙紅’的MDA含量較小，抗寒性較強(qiáng)，‘北冰紅’和‘雙紅’游離Pro含量較高，適應(yīng)低溫環(huán)境的能力優(yōu)于其他兩個(gè)品種?？扇苄蕴亲鳛榈鞍踪|(zhì)和細(xì)胞膜的重要保護(hù)劑，其積累量越高越能幫助植被免于凍害[22-23]。本研究中的4個(gè)山葡萄品種隨著溫度降低，對外界環(huán)境做出應(yīng)激反應(yīng)，從而使可溶性糖含量持續(xù)增加，出現(xiàn)這種情況主要是由于低溫脅迫之初，山葡萄對外界不良環(huán)境做出的應(yīng)激反應(yīng)，使可溶性糖含量增加；當(dāng)溫度過低造成細(xì)胞死亡，可溶性糖含量下降。

植被活性氧清除系統(tǒng)包括酶促及非酶促抗氧化系統(tǒng)，酶促系統(tǒng)包含過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、脫氫抗壞血酸還原酶和谷胱甘肽還原酶等[5,24]，非酶促抗氧化系統(tǒng)主要由還原性谷胱甘肽和抗壞血酸構(gòu)成。本研究發(fā)現(xiàn)，‘北冰紅’和‘雙紅’的SOD表現(xiàn)優(yōu)于‘雪蘭紅’和‘左優(yōu)紅’。楊盛[25]等研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下，植物體酶活高于正常水平。本研究供試的4個(gè)山葡萄品種酶活性變化幅度明顯不同，抗寒性強(qiáng)的品種在受低溫脅迫后酶活性增加幅度大，抗寒性弱的品種反之，且隨著低溫加劇，在到達(dá)-40 ℃后酶活性迅速降低，由此證明在輕度低溫脅迫環(huán)境下，山葡萄可通過增加酶活性減輕脅迫傷害，在脅迫程度超過保護(hù)酶系統(tǒng)清除能力時(shí)，氧化酶活性開始下降。

為了更全面地對植被的抗寒性進(jìn)行評價(jià)，避免單一指標(biāo)鑒定的不足，科研工作者先后提出了隸屬函數(shù)法[26]、直接比較法[27]和分級比較法[5]等。劉鈺璽等[5]對不同葡萄砧木抗寒性進(jìn)行了主成分分析和聚類分析，所得結(jié)果與田間觀察基本一致。本研究基于主成分分析法得出， 4個(gè)山葡萄品種的抗寒性由高到低依次為：雙紅＞北冰紅＞雪蘭紅＞左優(yōu)紅，與Logistic曲線方程模擬半致死溫度結(jié)果大致吻合。