程振原，孫 婉,孟繁輝，張曉鈺，李杰婷，曹夢璇，鄭董儀

（德州學(xué)院醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院，山東 德州 253023）

有機(jī)發(fā)光材料因具有良好的光學(xué)穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用于光電器件、化學(xué)/生物傳感和生物應(yīng)用等領(lǐng)域。改善有機(jī)發(fā)光材料的發(fā)光性能和效率，一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1-4]。傳統(tǒng)的有機(jī)發(fā)光材料在稀溶液中的發(fā)光性能良好，但聚集時(shí)則會(huì)發(fā)生聚集誘導(dǎo)熒光淬滅現(xiàn)象（Aggregation-caused quenching,ACQ）[5-8]。盡管科學(xué)家們做了很多嘗試，比如采用化學(xué)改性和物理方法來阻止聚集誘導(dǎo)熒光淬滅現(xiàn)象，但聚集是自發(fā)過程，聚集誘導(dǎo)熒光淬滅現(xiàn)象很難突破。因此，聚集誘導(dǎo)熒光淬滅這一傳統(tǒng)有機(jī)發(fā)光材料普通存在的現(xiàn)象，極大限制了其廣泛應(yīng)用。唐本忠于2001年提出了聚集誘導(dǎo)熒光技術(shù)(Aggregation-induced emission，AIE)，并通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和理論模擬，提出了限制分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)（Restriction of intermolecular motion, RIM）理論。該類材料因分子運(yùn)動(dòng)受限，會(huì)減少聚集時(shí)的π-π相互作用，從而使得分子即使處在聚集狀態(tài)，依然具備熒光性能[9-13]。目前，各種聚集誘導(dǎo)熒光材料已應(yīng)用于熒光顯像、生物探針等領(lǐng)域。

在眾多AIE分子中，三苯胺具有特殊的螺旋槳結(jié)構(gòu)，可以更好地阻止分子間的π-π堆積，并構(gòu)建多種AIE化合物[14-17]。另外，作為給電子基，三苯胺與吸電子基通過單鍵或共軛鍵相連后，可以更好地調(diào)節(jié)分子內(nèi)的電子離域態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)對化合物光學(xué)性能的調(diào)控[18-19]。目前已有大量的三苯胺衍生物作為AIE分子，應(yīng)用于光學(xué)材料領(lǐng)域。

本文以三苯胺為中心，通過縮合反應(yīng)合成了2種D-π-A型的三苯胺衍生物TP-NO和TP-NH，使用核磁和質(zhì)譜進(jìn)行了表征，通過熒光發(fā)射光譜和紫外-可見吸收光譜，研究了二者在不同溶液中的光學(xué)性質(zhì)及AIE特性。研究了構(gòu)效關(guān)系對光學(xué)性質(zhì)的影響，采用掃描電子顯微鏡，對其在不同溶劑中的SEM圖像進(jìn)行了研究，并研究了TP-NH在細(xì)胞和活體中的熒光成像。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：2-甲基-6-硝基噻唑、2-甲基-6-氨基噻唑、4-(二苯氨基)苯甲醛、哌啶、二氯甲烷、四氫呋喃、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）、無水乙醇（EtOH）、乙酸乙酯（EA）、石油醚（PE）、水。

儀器：Bruker 400 Ultra-shield 核磁共振儀，Perkin-Elmer240 元素分析儀，F(xiàn)innigan LCQ質(zhì)譜儀，UV-3600 紫外可見分光光譜儀，F(xiàn)L-7000 熒光分光光度計(jì)，Ultra Plus 掃描電鏡。

1.2 化合物的合成

TP-NO與TP-NH的合成路線見圖1。

圖1 TP-NO與TP-NH的合成路線

1.2.1 TP-NO合成

將0.97g（5mmol）的2-甲基-6-硝基苯并噻唑、 2.73g（10mmol）的4-(二苯基氨基)苯甲醛和250mL哌啶溶于100mL乙醇中，混合物攪拌后回流反應(yīng)24h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，產(chǎn)物用柱層析進(jìn)行分離提純（洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯=3∶1），得到紅色粉末0.45g，收率20%。1H NMR (400MHz，DMSO-d6)，δ×10-6：9.14~9.13 (d，J=9.14Hz，1H)，8.33~8.30(dd，J=8.32Hz，1H)，8.09~8.07 (d，J=8.08Hz，1H)，7.77~7.68 (m，3H)，7.54~7.50(d，J=7.52Hz，1H)，7.39~7.35(m，4H)，7.17~7.10(m，6H)，6.93~6.91(d，J=6.92Hz，2H)。13C NMR(100MHz，DMSO-d6)，δ：173.72，158.28，149.65，146.84，144.69，140.11，130.66，130.07，128.37，125.79，124.86，122.86，122.42，121.39，119.68，119.25。HRMS-ESI：m/z calcd.for C27H20N3O2S+，[M+H]+：450.1198， found 450.1268。

1.2.2 TP-NH的合成

按照相同的步驟，將2-甲基-6-硝基苯并噻唑替換為2-甲基-6-氨基噻唑，得到化合物TPNH 0.42g，收率20%。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)，δ×10-6：7.62~7.55(m，3H)，7.36~7.32(t，J=7.8Hz，4H)，7.31(s，2H)，7.12~7.03(m，7H)，6.93~6.91(d，J=8.7Hz，2H)，6.76~6.74(dd，J=8.7Hz，2.2Hz，1H)，5.51(s，2H)。13C NMR(100MHz，DMSO-d6)，δ：160.95，148.46，147.98，147.18，145.68，136.28，134.80，130.21，128.99，125.26，124.32，123.32，122.44，120.93，115.43，104.27。HRMS-ESI：m/z calcd.for C27H22N3S+，[M+H]+：420.1456，found 420.1526。

2 結(jié)果與討論

2.1 光學(xué)性質(zhì)

為了比較2個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)對光學(xué)性質(zhì)的影響，分別配制了濃度為1×10-3M的母液，使用紫外可見光光度計(jì)和熒光光度計(jì)，分別測試了化合物TP-NO和TP-NH在不同溶劑中的吸收光譜和發(fā)射光譜。用得到的光譜數(shù)據(jù)分析2個(gè)化合物在不同溶劑中的光學(xué)性質(zhì)，以及結(jié)構(gòu)變化對光學(xué)性質(zhì)的影響。

2.1.1 紫外-可見吸收光譜

化合物TP-NH、TP-NO的吸收光譜見圖2。在水溶劑中，化合物TP-NO僅有1組吸收峰，位于450nm處；化合物TP-NH有2個(gè)最大的吸收峰，分別位于300nm和450nm處。其中短波的吸收峰是由三苯胺的π→π*電子躍遷造成的，長波的吸收峰是整個(gè)共軛結(jié)構(gòu)中因發(fā)生了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移而造成的[20]。

圖2 TP-NO、TP-NH在水中的吸收光譜

TP-NO在不同溶劑中的紫外吸收光譜見圖3。由圖3可知，當(dāng)溶劑極性發(fā)生改變時(shí)，TP-NO的紫外吸收強(qiáng)度的變化不大，在四氫呋喃中發(fā)生了150nm的藍(lán)移，在其他溶劑中則沒有發(fā)生明顯的紅移或者藍(lán)移現(xiàn)象。結(jié)果表明，溶劑的極性對TP-NO的紫外吸收作用無較明顯的影響。

圖3 TP-NO在不同溶劑中的吸收光譜(濃度1×10-3M，以下同)

TP-NH在不同溶劑中的紫外吸收光譜見圖4。在其他溶劑中，TP-NH在400nm左右有一處最大吸收峰，峰的位置沒有改變，表明極性的改變與基態(tài)的電子結(jié)構(gòu)無關(guān)。該峰位為局域激發(fā)狀態(tài)，主要由三苯胺的π→π*的躍遷導(dǎo)致。結(jié)果顯示，溶劑的極性對TP-NH吸收的影響較小，且無明顯的紅移或者藍(lán)移的現(xiàn)象，在水中只發(fā)生了微弱紅移，說明溶劑的極性對TP-NH吸收的影響不大[21]。

圖4 TP-NH在不同溶劑中的吸收光譜

2.1.2 熒光發(fā)射光譜

圖5是TP-NO和TP-NH在二氯甲烷中的熒光光譜。由圖5可知，在二氯甲烷中，TP-NH的熒光峰處于498nm處，TP-NO的熒光峰處于517nm處。硝基為典型的吸電子基，氨基為典型的供電子基，硝基的引入增強(qiáng)了D-π-A型化合物吸電子基的吸電子能力，使得熒光峰發(fā)生了紅移。

圖5 TP-NO和TP-NH在二氯甲烷中的熒光光譜

圖6是TP-NO在不同溶劑中的熒光發(fā)射光譜。由圖6可知，化合物TP-NO在四氫呋喃、乙酸乙酯和N,N-二甲基甲酰胺中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光，而在二氯甲烷、無水乙醇、二甲基亞砜和水中，熒光的發(fā)射強(qiáng)度較低。

圖6 TP-NO在不同溶劑中的熒光發(fā)射光譜

圖7是TP-NH在不同溶劑中的熒光發(fā)射光譜。由圖7可知，TP-NH在不同的溶劑中表現(xiàn)出不同的熒光強(qiáng)度和位置。在四氫呋喃溶劑中，TP-NH的熒光發(fā)射強(qiáng)度最強(qiáng)，波長位于500nm處，而在無水乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜和水中幾乎沒有熒光強(qiáng)度，表明在極性大的溶劑中，TP-NH的熒光強(qiáng)度降低，激發(fā)態(tài)能量被大量消耗，從而導(dǎo)致了熒光淬滅。

圖7 TP-NH在不同溶劑中的熒光發(fā)射光譜

2.2 聚集誘導(dǎo)熒光性質(zhì)

2種化合物都可以溶解于四氫呋喃，都不溶解于水。為了研究TP-NO和TP-NH的聚合誘導(dǎo)熒光性能，我們對不同含水量的四氫呋喃/水混合液（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）進(jìn)行了熒光分析。

2種化合物在不同比例的四氫呋喃/水混合液中的熒光發(fā)射光譜見圖8。化合物TP-NO在純四氫呋喃溶液中發(fā)射出微弱的熒光，隨著含水量增加，TP-NO的熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，含水量達(dá)到60%時(shí)，TP-NO的熒光發(fā)射強(qiáng)度達(dá)到最大值。聚集體中熒光發(fā)射增強(qiáng)的原因是分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受阻，非輻射性的能量因消耗而減弱或消失。此外，化合物TP-NO分子結(jié)構(gòu)內(nèi)硝基的扭曲構(gòu)像可以延長分子間的距離，并因π→π鍵的堆積而減少了熒光淬滅[22]。含水量大于60%后，TP-NO的熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸降低，可能是隨著含水量增加，TP-NO在混合溶液中的溶解度出現(xiàn)降低而導(dǎo)致的?；衔颰P-NH在純四氫呋喃溶液中的熒光強(qiáng)度最大，隨著含水量增加，TP-NH的熒光逐漸降低且熒光發(fā)射峰值發(fā)生了紅移，表現(xiàn)出聚集誘導(dǎo)熒光淬滅現(xiàn)象。

圖8 TP-NO和TP-NH在不同含水量的四氫呋喃/水混合液中的熒光性能

2.3 掃描電鏡結(jié)果

為了更好地研究2種化合物在不同極性溶劑中的自組裝狀態(tài)，我們測試了二者在二氯甲烷和乙醇中的自組裝形貌圖。

化合物TP-NH在二氯甲烷和無水乙醇溶液中的掃描電鏡圖見圖9?？梢钥闯?，在二氯甲烷中TP-NH呈現(xiàn)圓球狀，在無水乙醇中則是棒狀的形態(tài)?；衔颰P-NO在二氯甲烷和無水乙醇溶液的掃描電鏡圖見圖10?？梢钥闯龌衔颰P-NO 在二氯甲烷中呈現(xiàn)出規(guī)則的花型結(jié)構(gòu)，而在無水乙醇中則是分散的、不規(guī)則的納米顆粒。這可能是化合物在不同溶劑中的溶解性差異以及相互作用產(chǎn)生的差異導(dǎo)致的。取代基的不同，使得2種化合物在二氯甲烷和無水乙醇溶液中呈現(xiàn)出2種不同的組裝形態(tài)。

圖9 TP-NH在二氯甲烷、無水乙醇中的SEM圖像

圖10 TP-NO在二氯甲烷、無水乙醇中的SEM圖像

2.4 熒光顯像

對2個(gè)化合物的熒光性質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)TP-NH具有較好的熒光性質(zhì)，為此將其應(yīng)用于生物成像領(lǐng)域。對TP-NH在腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在50μM濃度范圍內(nèi)，腫瘤細(xì)胞的死亡率在60%以上，證明TP-NH具有較好的生物安全性（圖11）。將10μM的TP-NH與細(xì)胞和斑馬魚共孵育30min后，利用熒光顯微鏡觀察成像效果（圖12），在細(xì)胞和斑馬魚體內(nèi)均觀察到綠色熒光，表明TP-NH成功進(jìn)入了細(xì)胞和斑馬魚，并成功對其染色。

圖11 不同濃度的TP-NH對Hela細(xì)胞的毒性效應(yīng)

圖12 TP-NH對Hela活細(xì)胞和斑馬魚的細(xì)胞顯影圖

3 結(jié)論

本文通過縮合反應(yīng)，合成了2種三苯胺衍生物TP-NH、TP-NO。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三苯胺衍生物TP-NH的熒光強(qiáng)度比TP-NO更強(qiáng)，TP-NO的發(fā)射波長相對于TP-NH發(fā)生了紅移。TP-NH表現(xiàn)出ACQ現(xiàn)象，TP-NO則表現(xiàn)出AIE現(xiàn)象。采用掃描電鏡，研究了三苯胺衍生物在小極性溶劑二氯甲烷和大極性溶劑乙醇中的自組裝形貌，結(jié)果表明，TP-NH在二氯甲烷中自組裝成了球形納米顆粒，在乙醇中自組裝成了棒狀。TP-NO在二氯甲烷中自組裝成了花型，在乙醇中自組裝成了無規(guī)的形狀。2種三苯胺衍生物均表現(xiàn)出較好的熒光性能。TP-NH表現(xiàn)出較好的熒光現(xiàn)象，可對細(xì)胞和活體進(jìn)行染色，因此在細(xì)胞和活體成像領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。這些結(jié)果可為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和實(shí)際應(yīng)用提供參考。