呂朝軍, 張楚毓, 鐘寶珠, 趙建超, 陳 拓

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所,海南 文昌 571339

紅棕象甲Rhynchophorusferrugineus(Oliv.)是棕櫚科植物的重要害蟲,對椰子CocosnuciferaL. (Chakravarthyetal.,2014; Lizanneetal.2016)、油棕ElaeisguineensisJacq. (Nazmietal.,2020)、椰棗PhoenixdactyliferaL.(Manzooretal.,2022)等造成了極為嚴重的損失。隨著人們對食品健康、生態(tài)保護的要求越來越高,生物防治作為重要的防控手段日益受到重視。紅棕象甲的生防因子包括綠僵菌(Ahmedetal.,2022)、白僵菌(Ahmed &Freed,2021)、細菌(Almasoudietal.,2022; Celietal.,2022)、昆蟲病原線蟲(Aqsa,2020; Wanetal.,2021; Yasinetal.,2021)等。目前,昆蟲病原線蟲(entomopathogenic nematodes, EPNs)在農(nóng)業(yè)害蟲防治中越來越表現(xiàn)出其優(yōu)越性,由于其喜歡潮濕隱蔽的環(huán)境,常被用于防治鉆蛀害蟲和土壤害蟲(劉奇志等,2002)。研究發(fā)現(xiàn),在沙特將EPNs施用到土壤中后,可導(dǎo)致60%和46%的紅棕象甲幼蟲和成蟲死亡(Saleh &Alheji,2003);在實驗室條件下處理8 d后,嗜菌異小桿線蟲HeterorhabditisbacteriophoraPoinar對紅棕象甲致死率達到86.9%(Manzooretal.,2017);EPNs功效評估結(jié)果顯示,在阿聯(lián)酋的椰棗園本土分離的異小桿線蟲能在短時間內(nèi)成功殺死紅棕象甲的幼蟲、成蟲和繭,椰棗地的RPW種群也成功減少(Elawadetal.,2007)。由于其對昆蟲宿主的高致病性(Gozeletal.,2015),2種常見的EPNs被用作害蟲綜合治理中的生物控制劑(Griffin,2012)。鐘寶珠等(2020a,2020b)研究表明,嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲具有一定的防控潛力,但其對紅棕象甲的血淋巴等免疫系統(tǒng)的影響還未可知。因此,本試驗系統(tǒng)研究了嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲各蟲態(tài)的動態(tài)毒力水平,及對幼蟲血淋巴總量、血淋巴酯酶活性及血淋巴蛋白含量的影響,以期為揭示嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染紅棕象甲的作用機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

嗜菌異小桿線蟲H06品系及紅棕象甲各蟲態(tài)均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所生物防治實驗室自繁自養(yǎng)。其中,嗜菌異小桿線蟲H06品系以大蠟螟Galleriamellonella(L.)幼蟲為寄主進行擴繁,采用White (1927)方法收集3齡感染期線蟲(infective juveniles, IJs),使用前用蒸餾水稀釋至系列濃度備用;紅棕象甲采用半人工飼料(馬子龍等,2012)進行飼養(yǎng)。

試蟲繁育及毒力試驗均在溫度(26±1) ℃、濕度(70±5)%的室內(nèi)開展。

1.2 試驗方法

1.2.1 嗜菌異小桿線蟲對紅棕象甲不同蟲態(tài)致病力的時間效應(yīng) 8齡幼蟲致病力測定:用移液槍吸取1 mL線蟲溶液,均勻滴加在紅棕象甲背部,將試蟲轉(zhuǎn)移至養(yǎng)蟲盒(35 cm×24 cm×11 cm)中,養(yǎng)蟲盒內(nèi)預(yù)先放置2層甘蔗段作為試蟲飼料。每處理30頭,重復(fù)3次,處理后逐日統(tǒng)計死亡率,連續(xù)統(tǒng)計5 d。以昆蟲針輕觸蟲體,完全不動者為死亡。以蒸餾水處理為對照。

卵致病力測定:將卵置于養(yǎng)蟲杯(φ4 cm×3 cm)中,杯底覆蓋濾紙,用移液槍滴加1 mL不同濃度線蟲液至濾紙上。處理后逐日統(tǒng)計卵死亡率,連續(xù)統(tǒng)計5 d。每處理30粒,重復(fù)3次,以卵變紅色或黑色為死亡。以蒸餾水處理為對照。

蛹致病力測定:將紅棕象甲蛹單獨置于養(yǎng)蟲杯(φ4 cm×3 cm)中,杯底覆蓋濾紙,用移液槍滴加1 mL不同濃度線蟲液至濾紙上。處理后逐日統(tǒng)計蛹死亡率,連續(xù)統(tǒng)計7 d。每處理30頭,重復(fù)3次,以毛筆輕觸蛹體,蛹不動者為死亡。以蒸餾水處理為對照。

成蟲致病力測定:將紅棕象甲成蟲單獨置于養(yǎng)蟲杯(φ4 cm×3 cm)中,杯內(nèi)添加甘蔗塊作為試蟲飼料,杯底覆蓋濾紙,用移液槍滴加1 mL不同濃度線蟲液至濾紙上。處理后逐日統(tǒng)計成蟲死亡率,連續(xù)統(tǒng)計7 d。每處理30頭,重復(fù)3次,以昆蟲針輕觸蟲體蜷曲不動者為死亡。以蒸餾水處理為對照。

1.2.2 紅棕象甲幼蟲血淋巴總量測定 參考胡美英等(2002)的方法。以750條·mL-1嗜菌異小桿線蟲H06品系處理紅棕象甲8齡幼蟲,處理方法同1.2.1。用電子天平準確稱量處理后0、36、48、60和72 h的紅棕象甲8齡幼蟲活蟲質(zhì)量(精確至0.001 g),用昆蟲針刺破胸部,擠出血淋巴,讓其在吸水紙上爬行0.5 h后再次稱質(zhì)重,最后計算血淋巴總質(zhì)量(每克幼蟲體重中血淋巴的毫克數(shù),mg·g-1)。以蒸餾水處理為對照。

1.2.3 紅棕象甲血淋巴酯酶活性測定 采用陳長琨(1993)的方法。以750條·mL-1線蟲液處理紅棕象甲8齡幼蟲,處理方法同1.2.1。在濃度為3×10-4mol·L-1的3 mLα-醋酸萘酯溶液中加入0.04 mol·L-1磷酸緩沖液(PBS)0.45 mL。搖勻后置于25 ℃下平衡5 min,各加入血淋巴0.05 mL,立即搖勻計時。25 ℃下平衡25 min,迅速加入顯色劑0.5 mL (1%固藍RR鹽溶液+15%SDS,使用前2∶5混勻),終止反應(yīng)并顯色,30 min后待出現(xiàn)穩(wěn)定的藍綠色后,測定D600 nm值。以蒸餾水處理為對照。

1.2.4 紅棕象甲血淋巴蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍G-250法(陳鈞輝等,2003)。以750條·mL-1線蟲液處理紅棕象甲8齡幼蟲,處理方法同1.2.1。預(yù)先用0.5 mg·mL-1牛血清蛋白制作標準曲線。將處理后的紅棕象甲血淋巴溶液0.2 mL加入蒸餾水0.8 mL,考馬斯亮藍試劑5 mL,搖菌放置20 min后,測定D595 nm值,對照標準曲線統(tǒng)計每毫升血淋巴中的蛋白質(zhì)含量(mg·mL-1)。以蒸餾水處理為對照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

參考黃劍和吳文君(2004)的方法,采用Excel統(tǒng)計軟件求出毒力回歸方程及LC50、LC50的95%置信區(qū)間等。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜菌異小桿線蟲對紅棕象甲不同蟲態(tài)致病力的時間效應(yīng)

嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲不同蟲態(tài)的毒力水平和致死效果如表1和圖1所示。以LC50為參考,隨處理時間延長,嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲各蟲態(tài)的毒力水平也呈現(xiàn)上升的趨勢,其中以對卵的毒力水平最高。

圖1 嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲不同蟲態(tài)的致死率

表1 嗜菌異小桿線蟲H06品系處理對紅棕象甲的毒力

以處理后LC50的95%置信區(qū)間是否重疊為參考值,處理后3 d嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲各蟲態(tài)的毒力以卵最高,而8齡幼蟲、蛹和成蟲處理組的毒力值未出現(xiàn)顯著差異;處理后4和5 d后,對各蟲態(tài)的毒力值仍以卵最高,其次為8齡幼蟲和蛹,對成蟲的毒力水平低于8齡幼蟲處理組,但與蛹處理組差異未達到顯著水平;在處理后期(6和7 d),嗜菌異小桿線蟲H06品系對成蟲的毒力水平均顯著高于蛹處理組。

嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲不同蟲態(tài)的致死率結(jié)果表明,隨著處理時間的延長,紅棕象甲的死亡率均呈現(xiàn)上升的趨勢(圖1)。

2.2 紅棕象甲幼蟲血淋巴總量的測定

經(jīng)嗜菌異小桿線蟲H06品系處理后,紅棕象甲血淋巴總量呈現(xiàn)一個前期(0～48 h)升高,后期(48～72 h)逐漸降低的趨勢,其中在處理后48 h的血淋巴總量為83.42 mg·g-1,與對照組相比升高273.75%,在60 h降低至與對照相當水平,處理后72 h的血淋巴總量為18.90 mg·g-1,與對照相比降低39.73%(圖2)。

圖2 嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲血淋巴總量的影響

2.3 紅棕象甲幼蟲血淋巴酯酶活性的測定

經(jīng)嗜菌異小桿線蟲H06品系處理后,紅棕象甲血淋巴酯酶活性短期內(nèi)(0～36 h)升高,處理后36 h的酯酶活性升高11.11%,之后逐漸下降,處理后60和72 h的血淋巴酯酶活性與對照相比分別降低10.18%和53.36%(圖3)。

圖3 嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲血淋巴酯酶活性的影響

2.4 紅棕象甲幼蟲血淋巴蛋白含量的測定

經(jīng)嗜菌異小桿線蟲H06品系處理后,紅棕象甲幼蟲血淋巴蛋白含量與對照相比呈現(xiàn)下降的趨勢(圖4)。處理后48～60 h呈現(xiàn)一個短暫的回升,之后又迅速下降,其中在處理后72 h,血淋巴的蛋白含量與對照相比下降74.96%。

圖4 嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲血淋巴蛋白含量影響

3 討論

昆蟲不同蟲態(tài)體內(nèi)所含營養(yǎng)物質(zhì)不同,如紫棕象甲Rhynchophorusphoenicis(Fabricius)高齡幼蟲體內(nèi)蛋白含量達10.51%,而成蟲蛋白含量為8.43%(Omotoso &Adedire,2007)。EPNs侵入蟲體后需取食蟲體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)才可完成增殖進而殺死寄主,寄主的齡期、蟲態(tài)及體內(nèi)激素分泌和免疫調(diào)節(jié)等均會影響線蟲的寄生效果(劉勇,2020)。本研究中,嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲卵的毒力水平顯著高于其他蟲態(tài),其次為幼蟲和蛹,而對成蟲的毒力水平最低,這可能與紅棕象甲各蟲態(tài)體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)差異有關(guān)。紅棕象甲卵個體較小,僅需較少線蟲個體即可達到對其致死的效果,同時EPNs在寄主體內(nèi)會釋放共生細菌引起細胞毒性,破壞免疫系統(tǒng)導(dǎo)致寄主死亡(Kaya &Gaugler,1993; Park &Kim,2000),線蟲通過卵孔進入后,不僅取食卵內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì),且通過共生細菌破壞卵內(nèi)細胞的分裂造成卵死亡;幼蟲和蛹體內(nèi)富含脂肪和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)(Khanitthaetal.,2020,2022),雖可為線蟲提供繁殖所需營養(yǎng),但體內(nèi)的酯滴和蛋白又是蟲體免疫的重要物質(zhì)(葛君等,2010),對于緩解線蟲內(nèi)生細菌對寄主的傷害起到了一定作用。同時,本研究供試的8齡幼蟲和蛹個體相對較大,嗜菌異小桿線蟲H06品系需在蟲體內(nèi)增殖到一定數(shù)量才能對其起到致死效果;而成蟲表皮甲殼致密堅硬且體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)低于其他蟲態(tài),不利于EPNs侵染。

EPNs是昆蟲?；纳蕴鞌?叢斌等,1999),可通過寄主孔口、傷口等部位進入血腔后釋放細菌(Poina &Thomas,1996),使寄主血淋巴表現(xiàn)出明顯的病理學(xué)變化(孫昊雨等,2012),損壞寄主的免疫系統(tǒng)并最終導(dǎo)致寄主死亡。昆蟲血淋巴中含有昆蟲生理活性所需的一切代謝物質(zhì),對血淋巴成分和功能的干擾必然會影響其正常的代謝功能。在本研究中,經(jīng)嗜菌異小桿線蟲H06品系處理后,血淋巴總量前期迅速升高,而之后又降低,此趨勢與丁曉帆等(2005)的研究相似,可能是由于在線蟲侵染前期寄主防御系統(tǒng)開始起作用,血細胞開始大量分裂導(dǎo)致血淋巴總量急劇升高,之后隨著病原線蟲共生菌急劇增殖,紅棕象甲血細胞快速崩解致使后期血淋巴總量減低。

酯酶廣泛存在于昆蟲體內(nèi),起著生化調(diào)節(jié)、神經(jīng)傳導(dǎo)及解毒代謝等作用(陳長琨,1993; 從斌等,1999)。肖猛(2000)和丁曉帆等(2005)采用EPNs接種家蠶BombyxmoriL.和大蠟螟Galleriamellonella(L.),均發(fā)現(xiàn)在供試時間內(nèi)(0～24 h)血淋巴酯酶活性持續(xù)升高。本研究中紅棕象甲受EPNs侵染后,血淋巴酯酶活性呈現(xiàn)前期(0～36 h)升高后期(36～72 h)降低的趨勢。肖猛等(2000)認為,受線蟲侵染后酯酶活性升高是由于對酯類物質(zhì)分解增多和分解性酶活性的增強;在本研究后期出現(xiàn)的酯酶活性逐漸降低情況,筆者認為可能是由于在線蟲侵染后期,隨著EPNs和共生細菌在紅棕象甲體內(nèi)增殖,血淋巴內(nèi)脂肪等物質(zhì)被大量消耗,酯酶活性無法滿足免疫需求,導(dǎo)致酯酶活性逐漸降低。

昆蟲血淋巴蛋白與體內(nèi)代謝、抗藥性及免疫調(diào)節(jié)等功能密切相關(guān),血蜱雌蜱受嗜菌異小桿線蟲E67品系感染12 h后其血淋巴蛋白出現(xiàn)升高,在48 h后又出現(xiàn)顯著降低(高志華等,2006)。孫昊雨等(2014)研究表明,蠐螬感染嗜菌異小桿線蟲滄州品系后20 h內(nèi),血淋巴蛋白含量大幅度增加,隨后急劇降低,感染線蟲28 h后顯著低于同時間的對照(P<0.05)。本研究中,嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染后,紅棕象甲血淋巴蛋白含量呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢,雖在處理后60 h出現(xiàn)短暫的回升,但之后仍迅速降低。線蟲侵染紅棕象甲后,會大量消耗寄主體內(nèi)的蛋白進行繁殖導(dǎo)致蛋白含量降低,但在60 h出現(xiàn)短暫回升的具體原因還有待進一步闡明。