王 星 張敬軍

山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 泰安 271000

腦血管病是常見(jiàn)病、多發(fā)病，也是致殘的主要原因之一，不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而且給患者家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[1］。腦血管病的發(fā)生受遺傳及環(huán)境等多種因素共同影響，遺傳因素一直是腦血管病發(fā)生的高危因素，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[2-3］。近年來(lái)，隨著連鎖分析、全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWAS）、全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）、全外顯子測(cè)序（whole exome sequencing，WES）等多種分子遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為臨床診療工作提供了有效手段，從罕見(jiàn)病到遺傳病，基因組學(xué)改變了我們對(duì)生物學(xué)的認(rèn)識(shí)，并影響了對(duì)許多疾病病理生理學(xué)的理解，為多種復(fù)雜疾病的研究及診療提供了新的思路[4］。目前這些基因組學(xué)方法在研究腦血管病上的應(yīng)用相對(duì)較少，本文就多種基因組學(xué)方法在腦血管病中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 連鎖分析在腦血管病中的應(yīng)用

連鎖分析是一種依賴于參數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對(duì)具有與遺傳標(biāo)記（微衛(wèi)星、限制性位點(diǎn)多態(tài)性等）附近位置共同遺傳傾向的基因組區(qū)域進(jìn)行參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析[5］，通過(guò)將遺傳標(biāo)記的傳遞與家族中的疾病狀態(tài)相匹配，可以將致病區(qū)域或基因座與給定標(biāo)記相關(guān)聯(lián)[6］。

通過(guò)連鎖分析已經(jīng)定位了部分腦血管病的致病基因，包括與煙霧病有關(guān)的染色體17q25上的RNF213基因[7］，與常染色體顯性遺傳病合并皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病（cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL）有關(guān)的染色體19p13上的NOTCH3基因[8］，與伴有皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體隱性遺傳性腦動(dòng)脈病（cerebral autosomal recessive arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CARASIL）有關(guān)的染色體10q25上的HTRA1基因[9］，與Fabry 病有關(guān)的染色體Xq21 上的GLA基因[10］等。該研究方法需要大量準(zhǔn)確的家系樣本數(shù)據(jù)，存在一定的局限性，僅適用于致病性高、遺傳變異敏感度高的單基因疾病，不適用于復(fù)雜性疾病的診斷。

2 候選基因關(guān)聯(lián)研究在腦血管病中的應(yīng)用

候選基因的關(guān)聯(lián)研究主要集中在病因?qū)W、流行病學(xué)、組織表達(dá)特異性、功能分析以及與已知功能基因的同源比較，研究可能與其發(fā)病機(jī)制相關(guān)的候選基因，然后鑒定導(dǎo)致功能或表達(dá)變化的基因或鄰近基因的突變，或?qū)σ鸸δ芨淖兊耐蛔冃纬蛇B鎖不平衡的多態(tài)性的研究。候選基因關(guān)聯(lián)研究主要適用于多基因復(fù)雜疾病的研究，研究方法是通過(guò)比較病例組和對(duì)照組之間候選基因的等位基因頻率的差異來(lái)確定候選基因與疾病的相關(guān)性[11］。

候選基因一部分來(lái)源于GWAS 分析，另一部分來(lái)源于腦血管病相關(guān)危險(xiǎn)因素的易感基因。目前通過(guò)候選基因關(guān)聯(lián)研究已發(fā)現(xiàn)腦血管病的發(fā)生受多種基因多態(tài)性的影響，如AGT基因的M235T多態(tài)性與缺血性腦血管病關(guān)系密切[12］，ApoE基因多態(tài)性與出血性腦血管病的發(fā)生密切相關(guān)[13］。候選基因關(guān)聯(lián)研究補(bǔ)充了危險(xiǎn)因素對(duì)腦血管病的影響機(jī)制，為腦血管病的精準(zhǔn)防治提供新的理論依據(jù)。但該研究方法一般僅針對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行研究，且腦血管病受多種危險(xiǎn)因素影響，候選基因研究方法在多基因疾病等復(fù)雜疾病的分子遺傳決定因素方面進(jìn)展甚微。

3 GWAS在腦血管病中的應(yīng)用

GWAS是一種通過(guò)大規(guī)模比較患病和未患病的群體DNA 樣本，進(jìn)行全基因組高密度遺傳標(biāo)記分型，從而尋找與復(fù)雜疾病相關(guān)聯(lián)的遺傳因素的研究方法。在基因組水平上對(duì)基因與疾病關(guān)聯(lián)進(jìn)行集中、大型、反復(fù)驗(yàn)證研究，彌補(bǔ)了連鎖分析的不足，全面揭示與疾病發(fā)生、發(fā)展和治療相關(guān)的遺傳基因，已經(jīng)成功破譯了多種復(fù)雜性狀和疾病的遺傳變異密碼[14］。

2018 年Malik 等[15］通過(guò)整合多個(gè)GWAS 數(shù)據(jù)庫(kù)，最終確定了32個(gè)腦血管病位點(diǎn)，其中包括22個(gè)新發(fā)腦血管病位點(diǎn)。2021 年Mishra 等[16］對(duì)多個(gè)腦血管病數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匯總，其數(shù)據(jù)來(lái)源包括歐洲、東亞、南亞等共5 個(gè)地區(qū)，通過(guò)Meta 分析最終確定了89 個(gè)腦血管病位點(diǎn)，其中新發(fā)現(xiàn)了60 個(gè)腦血管病位點(diǎn)。同年，Traylor 等[17］首次對(duì)歐洲人群的腔隙性腦梗死患者進(jìn)行GWAS研究，共發(fā)現(xiàn)了11個(gè)新的腔隙性腦梗死位點(diǎn)，在此之前，只在chr16q24 上發(fā)現(xiàn)一個(gè)與腔隙性腦梗死有關(guān)的位點(diǎn)，這一發(fā)現(xiàn)給腔隙性腦梗死的遺傳機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。迄今為止，通過(guò)GWAS 技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了上百個(gè)與腦血管病相關(guān)的易感基因位點(diǎn)，為探究腦血管病的發(fā)病機(jī)制和藥物開(kāi)發(fā)提供了新的思路。

GWAS的局限性：（1）由于GWAS可能對(duì)疾病易感性產(chǎn)生顯著影響，且由于存在種族差異性，導(dǎo)致部分GWAS 確定的常見(jiàn)遺傳變異與疾病無(wú)直接相關(guān)性或難以驗(yàn)證[18］；（2）GWAS得到的遺傳變異大多位于非編碼區(qū)，只能解釋遺傳變異的一小部分[19］；（3）GWAS 研究要求較大的樣本量，且實(shí)驗(yàn)費(fèi)用昂貴；（4）GWAS不能檢測(cè)導(dǎo)致疾病的超罕見(jiàn)突變。

4 WGS在腦血管病中的應(yīng)用

全基因組測(cè)序是對(duì)未知基因組序列的物種進(jìn)行個(gè)體的基因組測(cè)序，可以檢測(cè)到全基因組中數(shù)量大而多的序列變異。全基因組測(cè)序是一種快速、全面檢測(cè)基因突變的工具，取代傳統(tǒng)的耗時(shí)的分子篩選方案，為臨床表型的遺傳原因鑒定提供了另一種選擇。

在2 例 中國(guó)CADASIL 患者的WGS 中發(fā) 現(xiàn)1 個(gè)新的雜合NOTCH3致病性變異，位于其第2 號(hào)外顯子的p.Cys43Ser[20］。文獻(xiàn)報(bào)道瑞典的1個(gè)腦血管病家系研究中發(fā)現(xiàn)1個(gè)MAP3K6突變，MAP3K6基因變異參與血管生成，與腦血管病的病理變化相匹配[21］。由于WES的出現(xiàn)，能捕獲全基因組85%以上的遺傳變異，且相較于WGS費(fèi)用較少，導(dǎo)致WGS在腦血管病中的應(yīng)用減少。

5 WES在腦血管病中的應(yīng)用

WES 是指利用序列捕獲技術(shù)捕獲基因組整個(gè)外顯子區(qū)域的DNA，并進(jìn)行高通量富集后測(cè)序的基因組分析技術(shù)，用于研究蛋白質(zhì)功能區(qū)的基因突變[22］。WES是針對(duì)基因組中的所有蛋白質(zhì)編碼區(qū)，約占人類基因組序列的1% ~ 2%，但這1% ~ 2%的基因序列包括了人體約85%的遺傳變異[23］，彌補(bǔ)了GWAS 得到的遺傳變異大多位于非編碼區(qū)這一缺點(diǎn)，且WES 可以用于家系或者個(gè)體研究，相較于GWAS，有著低成本、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，深受國(guó)內(nèi)外臨床醫(yī)師和研究學(xué)者的青睞。

在國(guó)內(nèi)，Zhang等[24］通過(guò)分階段對(duì)3 754例中國(guó)漢族受試者進(jìn)行WES 分析發(fā)現(xiàn)2 個(gè)新的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與缺血性腦血管病有關(guān)。研究者第一階段選取本地區(qū)少量缺血性腦血管病患者和健康對(duì)照進(jìn)行WES，得到高度相關(guān)性的76個(gè)SNP；第二階段在本地區(qū)加大樣本量，對(duì)高度相關(guān)性SNP 進(jìn)行基因分型，最終確認(rèn)了4 個(gè)SNP 與缺血性腦血管病有關(guān)；第三階段在同種族其他地區(qū)復(fù)制了陽(yáng)性相關(guān)性SNP。經(jīng)過(guò)三個(gè)階段最終確定位于染色體1q24.2 和3p21.3 的2 個(gè)SNP 與缺血性腦血管病有關(guān)。林晶等[25］在1 個(gè)CADASIL 家系中揭示了一種新的突變?yōu)镹OTCH3基因，位于第3號(hào)外顯子上的堿基改變，使第111個(gè)氨基酸由甘氨酸變?yōu)榘腚装彼幔斐砂腚装彼釘?shù)量不配對(duì)，促使CADASIL 的發(fā)生。Chang 等[26］通過(guò)對(duì)1 個(gè)腦海綿狀血管畸形相關(guān)腦出血家族進(jìn)行WES研究，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的變異體KRIT1。

在國(guó)外，Ilinca 等[27］通過(guò)對(duì)22 例缺血性腦血管病青年患者的研究發(fā)現(xiàn)NOTCH3突變，研究者首先對(duì)22 例先證者進(jìn)行WES，發(fā)現(xiàn)8 個(gè)可能致病的突變，通過(guò)Sanger測(cè)序后縮小為6個(gè)，然后對(duì)有可能致病變異的5 個(gè)家系成員進(jìn)行基因分型，確定了NOTCH3突變與腦血管病有關(guān)。Paraskevas 等[28］在1 個(gè)CADASIL 合并自身免疫性疾病家系中發(fā)現(xiàn)共有突變NOTCH3p.R169C。Carrera 等[29］通過(guò)病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)與心源性腦血管病有關(guān)的新基因TRPV3，研究者通過(guò)對(duì)40 例心源性腦血管病患者、21例健康對(duì)照和13例有其他臨床危險(xiǎn)因素的對(duì)照進(jìn)行WES，發(fā)現(xiàn)TRPV3突變與心源性腦血管病的發(fā)生具有相關(guān)性，對(duì)TRPV3 編碼蛋白功能進(jìn)行分析，TRPV3編碼蛋白參與血管調(diào)節(jié)的離子通道，與房顫的發(fā)生有關(guān)，而房顫是心源性腦血管病的主要危險(xiǎn)因素，最后得到TRPV3突變是引發(fā)心源性腦血管病的一個(gè)致病位點(diǎn)。Xie 等[30］通過(guò)對(duì)英國(guó)生物庫(kù)的152 058 例缺血性腦血管病患者WES 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)基因CYP2R1與缺血性腦血管病的發(fā)生有關(guān)。美國(guó)國(guó)家心臟、肺和血液研究所外顯子測(cè)序計(jì)劃分析了來(lái)自歐洲和非洲血統(tǒng)眾多隊(duì)列的約6 000例參與者WES 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)新基因PDEDIP和ACOT4與缺血性腦血管病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[31］。

關(guān)于腦血管病的WES研究在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，新發(fā)現(xiàn)了部分與腦血管病有關(guān)的致病基因，豐富了腦血管病的基因譜，但WES 也有一定的局限性：（1）WES 僅分析編碼區(qū)的變異信息，缺少非編碼區(qū)變異和結(jié)構(gòu)變異的研究，可能會(huì)導(dǎo)致一定程度的信息遺漏；（2）WES 研究對(duì)測(cè)序平臺(tái)、實(shí)驗(yàn)器械、實(shí)驗(yàn)技術(shù)等有著苛刻的要求，具備實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)室少，不能廣泛開(kāi)展實(shí)驗(yàn)；（3）由于個(gè)體、種族間存在差異性，需要重復(fù)加大樣本進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證成本高。

6 表觀遺傳學(xué)在腦血管病中的應(yīng)用

表觀遺傳學(xué)是分子生物學(xué)的一個(gè)分支，用于彌補(bǔ)遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素臨床轉(zhuǎn)化的不足，研究能夠改變基因表達(dá)而不改變DNA 序列的修飾。表觀遺傳調(diào)節(jié)包括DNA 甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA[32］。其中DNA 甲基化通過(guò)修飾基因組中存在的CpG 位點(diǎn)中的胞嘧啶殘基在基因轉(zhuǎn)錄的開(kāi)啟、關(guān)閉中發(fā)揮重要作用，組蛋白的翻譯后修飾可以改變?nèi)旧|(zhì)對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的可達(dá)性，而miRNA通過(guò)與mRNA相互作用在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)[33-35］。這些基因修飾是可遺傳和可修改的，可以由生活方式和營(yíng)養(yǎng)因素觸發(fā)，由于表觀遺傳修飾是可逆的過(guò)程，因此，它們可以幫助開(kāi)發(fā)治療人類疾病的新治療方法。

Cullell 等[36］通過(guò)表觀基因組關(guān)聯(lián)研究DNA 甲基化與缺血性腦血管病的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MAP3K1和ZFHX3 的DNA 甲基化改變是心源性和動(dòng)脈粥樣硬化性腦血管病發(fā)生的危險(xiǎn)因素，ZFHX3甲基化也是腔隙性腦血管病的危險(xiǎn)因素。Silva 等[37］通過(guò)使用人缺血性腦血管病病變組織和公開(kāi)的對(duì)照RNASeq數(shù)據(jù)進(jìn)行全局表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)新的缺血性腦血管病生物標(biāo)志物has_circ_0078299和FXN。文獻(xiàn)報(bào)道lnc_000048 可以通過(guò)募集KDM1A 影響組蛋白去甲基化酶活性，通過(guò)在啟動(dòng)子區(qū)域積累H3K4me2促進(jìn)MAP2K2 轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步加速ERK 磷酸化，最終促進(jìn)下游炎癥因子，誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的形成[38］。所有表觀遺傳標(biāo)記都是由基因和環(huán)境相互作用的結(jié)果，可以幫助我們深入了解腦血管病發(fā)病機(jī)制，從而為腦血管病的防治提供新的方向[39］。

7 展望

隨著測(cè)序技術(shù)的不斷變革和進(jìn)步，基因組學(xué)在腦血管病中的應(yīng)用研究不斷深入，為腦血管病的發(fā)病機(jī)制和藥物靶點(diǎn)的探尋提供更多的數(shù)據(jù)及理論支撐?，F(xiàn)階段的每種測(cè)序手段都存在優(yōu)缺點(diǎn)，研究下一代測(cè)序方法可以彌補(bǔ)既往不足，能夠快速、高效、精準(zhǔn)、廉價(jià)地確定患者的致病原因，為腦血管病的精準(zhǔn)防治提供理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突