孔樂輝，宗德乾，史青堯，殷盼盼，巫文玉，田鵬，單衛(wèi)星，強曉玉

馬鈴薯基因家族鑒定及其抗晚疫病的功能分析

孔樂輝，宗德乾，史青堯，殷盼盼，巫文玉，田鵬，單衛(wèi)星，強曉玉

西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院/旱區(qū)逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100

【目的】通過鑒定馬鈴薯基因家族成員，分析其響應(yīng)致病疫霉（）侵染的表達模式，挖掘具有抗晚疫病功能的并解析其免疫機制，為馬鈴薯抗晚疫病分子育種提供新型抗性基因資源?！痉椒ā坷秒p向BLAST法鑒定基因家族成員，通過ExPASy Prot Param、Cell-Ploc 2.0、ESPript等軟件分析StCYP83蛋白序列基本信息、亞細胞定位情況、保守基序；利用qRT-PCR技術(shù)分析響應(yīng)致病疫霉侵染的表達模式；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙瞬時表達體系和馬鈴薯過表達（OE）穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株分析候選基因影響寄主植物抗致病疫霉的免疫功能及作用機理?！窘Y(jié)果】在馬鈴薯基因組中共鑒定到10個家族基因，分別命名為，編碼蛋白長度介于387—503 aa，分子量介于44—57 kDa，亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示StCYP83蛋白均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。qRT-PCR結(jié)果表明，家族成員在不同程度上均可響應(yīng)致病疫霉侵染而誘導(dǎo)表達，暗示家族基因可能在馬鈴薯與致病疫霉互作中發(fā)揮作用?；诖?，從中選取明顯響應(yīng)致病疫霉侵染而誘導(dǎo)上調(diào)表達、且與擬南芥同源性最高的用于后續(xù)的免疫功能解析。本氏煙瞬時過表達的接菌測試結(jié)果表明，具有抗致病疫霉的生物學功能；同時，過表達可顯著促進PTI標記基因（、）、SA信號通路標記基因（和）和JA信號通路標記基因（和）的上調(diào)表達，并提高flg22誘發(fā)的活性氧迸發(fā)。此外，編碼蛋白保守基序中的半胱氨酸位點為其抗性功能所必需。過表達（OE）株系對致病疫霉的抗性有所增強，且呈現(xiàn)出增強的PTI免疫反應(yīng)，包括flg22誘發(fā)的活性氧水平升高以及PTI標記基因（、和）的顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達。此外，馬鈴薯SA信號通路相關(guān)基因（、、和）和JA信號通路相關(guān)基因（、和）也被誘導(dǎo)上調(diào)表達?！窘Y(jié)論】共鑒定到10個家族成員，家族成員在不同程度上均可響應(yīng)致病疫霉的侵染而誘導(dǎo)表達。通過激活PTI、SA和JA信號通路調(diào)控植物對致病疫霉的抗性；而StCYP83B1血紅素結(jié)合域中的半胱氨酸位點為其抗性功能所必需。

馬鈴薯；基因家族；致病疫霉；植物抗病性；晚疫病

0 引言

1 材料與方法

試驗于2021—2023年在西北農(nóng)林科技大學旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室完成。

1.1 試驗材料

馬鈴薯品種大西洋、本氏煙、大腸桿菌菌株Turbo、根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101、致病疫霉菌株88069、融合GFP標簽的35S::pART27質(zhì)粒載體，均由西北農(nóng)林科技大學單衛(wèi)星實驗室保存。

1.2 StCYP83基因家族的鑒定

（1）從EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫（http://plants.ensembl. org/info/data/ftp/index.html）下載馬鈴薯（SolTub_3.0）和擬南芥（TAIR10）全基因組相關(guān)文件；（2）以馬鈴薯全基因組蛋白序列構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫，使用AtCYP83家族蛋白作為種子序列比對出候選StCYP83蛋白（參數(shù)為E-value≤1e-10，并用query coverage≥70%過濾）；（3）以擬南芥全基因組蛋白序列構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫，用候選StCYP83蛋白序列blastp擬南芥數(shù)據(jù)庫，篩選最佳匹配為家族的基因；（4）使用PFAM數(shù)據(jù)庫（http://pfam-legacy.xfam.org/ search#tabview=tab1）和NCBI中CD-search工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）對候選的蛋白序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析，確保上述候選蛋白具有CYP450結(jié)構(gòu)域，最終確定馬鈴薯家族成員；（5）利用ExPASy Prot Param（http:// web.expasy.org/protparam/）分析StCYP83家族成員的氨基酸長度、分子量和等電點等理化性質(zhì)，使用Cell-Ploc 2.0軟件（http://www.csbio.sjtu.edu. cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）預(yù)測StCYP83蛋白的亞細胞定位。

1.3 StCYP83基因家族結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

利用MEGA-X的CLUSTALW算法進行StCYP83家族蛋白多序列比對，用TBtools的TrimAL工具修剪后采用鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建進化樹，獲得Newick Tree文件；利用基因組的基因結(jié)構(gòu)注釋文件（GFF3/GTF文件）獲取的注釋信息（https://ftp.ebi.ac.uk/ensemblgenomes/pub/release-55/ plants/gtf/solanum_tuberosum/），分析家族成員基因結(jié)構(gòu)，使用TBtools軟件的Gene Structure View（Advanced）功能對家族基因進化樹和基因結(jié)構(gòu)進行可視化分析。最后對StCYP83蛋白多序列比對結(jié)果用ESPript在線工具（https://espript. ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）進行保守基序分析。

1.4 致病疫霉接種處理

用滅菌牙簽挑取致病疫霉菌絲塊于黑麥培養(yǎng)基上，封口并于16 ℃暗培養(yǎng)10—15 d后，鏡檢孢子囊產(chǎn)生情況，選擇孢子囊多的進行后續(xù)試驗。滅菌ddH2O于4 ℃冰箱預(yù)冷，每皿加入5 mL滅菌ddH2O，用涂布器刮下菌絲層，使孢子囊從菌絲上脫落以制備無性孢子囊懸浮液。將制備好的懸浮液于4 ℃放置2 h，刺激孢子囊釋放游動孢子以制備游動孢子懸液。顯微鏡下用無菌水將游動孢子濃度調(diào)至2.5×104個/mL左右，置于冰上備用。

1.5 StCYP83響應(yīng)致病疫霉侵染的表達模式分析

將培育一個月的馬鈴薯組培苗經(jīng)蛭石煉苗后，移入育苗基質(zhì)中進行培養(yǎng)，待其成熟后，剪取成熟植株中上部葉片進行致病疫霉游動孢子接種處理，于接種后0、6、12、24、36、48、72 h取樣，并用液氮速凍后于-80 ℃保存。使用Trizol（invitrogen）法提取葉片RNA，使用TaKara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit，RR047A）合成cDNA后進行qRT-PCR反應(yīng)：首先將反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA稀釋10倍，吸取4 μL于96孔板中，依次加入7.5 μL 2×UltraSYBR Mixture、0.7 μL Forward Primer（10 μmol·L-1）、0.7 μL Reverse Primer（10 μmol·L-1）、2.1 μL ddH2O。qRT-PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40—45次循環(huán)，熔解曲線程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，利用2-ΔΔCT計算基因相對表達量[29]。

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙葉片瞬時表達

取200 μL過表達載體菌液，加入含有Rif、Gen、Spec的LB液體培養(yǎng)基，置于28 ℃搖床，轉(zhuǎn)速為200 r/min，至菌液OD600＞1.0。室溫下離心5 min（轉(zhuǎn)速為3 500×）收集菌體，并重懸于含有200 μmol·L-1乙酰丁香酮的MES，稀釋至OD600=0.5備用。利用1 ml一次性注射器將菌液注射于煙草葉片，并做以標記；吸去葉片表面多余的重懸菌液，并保濕避光；次日，移至正常光照條件，通過熒光顯微鏡檢測融合有熒光標簽的目標蛋白表達量，并選擇合適的煙草葉片進行接菌測試。

實際試驗時，采用均值濾波對邊緣檢測后的結(jié)果進行濾波處理。通過多次試驗分析，選擇3x9的內(nèi)核來處理效果最好。二值化處理之后，邊緣線條會有加粗的效果，利于腐蝕膨脹操作，如圖3所示。

1.7 活性氧迸發(fā)檢測

選擇適齡的馬鈴薯葉片以及本氏煙瞬時表達目的基因2 d后的葉片，用打孔器在葉片兩邊取葉圓盤（約10—12個葉圓盤），置于ddH2O中浸泡過夜。次日，將浸泡好的葉圓盤轉(zhuǎn)移至含有100 μL luminol和100 μL辣根過氧化物酶的96孔白色酶標板內(nèi)，打開酶標儀，設(shè)置以下程序：化學發(fā)光，每分鐘循環(huán)一次，30—50個循環(huán)，最后在每個酶標孔中加入終濃度為1 μmol·L-1的flg22，并立即檢測，最后導(dǎo)出數(shù)據(jù)即可。

2 結(jié)果

2.1 StCYP83基因家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

通過雙向比對，共獲得11條候選StCYP83蛋白序列，剔除不包含血紅素結(jié)合域（FxxGxxxCxG/A）的蛋白，最終得到10個馬鈴薯家族成員（表1），所有成員均含有保守的血紅素結(jié)合域（PF00067）。通過ExPASy工具，對所編碼的蛋白進行氨基酸長度、分子量及等電點分析，發(fā)現(xiàn)基因家族成員氨基酸長度在387—503 aa，分子量介于44—57 kDa，理論等電點在5.45—9.10，亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示StCYP83蛋白均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。

表1 StCYP83基因家族的理化特性

2.2 StCYP83基因家族結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)域分析

通過對家族成員基因結(jié)構(gòu)分析（圖1），發(fā)現(xiàn)家族聚類在一起的基因其內(nèi)含子與外顯子的數(shù)量相同，例如和含有3個外顯子、2個內(nèi)含子，而其余基因均由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成，結(jié)構(gòu)較為保守。

圖1 StCYP83基因家族結(jié)構(gòu)分析

為了分析家族基因編碼的蛋白所具有的保守基序，對該家族蛋白序列進行了多序列比對，結(jié)果表明StCYP83家族蛋白序列均含有CYP450蛋白的典型基序：K螺旋中的ExxR、PDR結(jié)構(gòu)域中的PERF和血紅素結(jié)合域中的FxxGxxxCxG/A（圖2）。其中，血紅素結(jié)合域是鑒定CYP450蛋白的主要特征結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基（Cys）絕對保守，兩個甘氨酸（Gly）和一個苯丙氨酸（Phe）通常也保守，但不絕對保守[30]。如StCYP83B9血紅素結(jié)合域中的保守基序為FxxSxxxCxG/A，其第1個保守的甘氨酸（Gly）改變?yōu)榻z氨酸（Ser）。

2.3 StCYP83響應(yīng)致病疫霉侵染的表達模式分析

qRT-PCR分析結(jié)果表明，與0 hpi對比，和在接種致病疫霉的每個時間點均顯著上調(diào)表達，其中在6 hpi的表達量上調(diào)至9.47倍，在72 hpi的表達量上調(diào)至11.63倍；在36 hpi的表達量上調(diào)至3.09倍；僅在12 hpi顯著上調(diào)表達；僅在72 hpi顯著上調(diào)表達；在24 hpi的表達量上調(diào)至6.32倍；在6 hpi的表達量上調(diào)至4.11倍；在36 hpi的表達量上調(diào)至2.95倍；和可能因為本底表達水平低，未檢測到表達（圖3）。基于上述分析結(jié)果，選取明顯響應(yīng)致病疫霉侵染而誘導(dǎo)上調(diào)表達、且與同源性最高的用于后續(xù)的免疫功能解析。

2.4 StCYP83B1能夠影響植物對致病疫霉的抗性

為了探究影響植物抗致病疫霉的免疫功能，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙瞬時表達體系在煙草葉片上分別過表達和對照，于2 d后利用免疫印跡（Western blot）確認StCYP83B1蛋白的表達（圖4-A），并對煙草葉片離體接種致病疫霉游動孢子。結(jié)果顯示，接菌后5 d，與對照相比，過表達的葉片表現(xiàn)出更小的致病疫霉侵染區(qū)域（圖4-B），通過統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)過表達的葉片病斑面積約為1.7 cm2，明顯小于對照葉片（2.1 cm2）的病斑面積（圖4-C）。進一步提取接菌部位相同面積的煙草葉片基因組DNA，并利用qRT-PCR量化分析致病疫霉定殖于葉片組織中的生物量，結(jié)果顯示，過表達葉片中的致病疫霉生物量顯著低于對照組（圖4-D）。該結(jié)果揭示了在植物抗致病疫霉中具有重要作用。

紅色覆蓋區(qū)表示嚴格一致的氨基酸序列The red cover regions represented sequences maintaining consistent amino acids

2.5 StCYP83B1過表達可增強植物PTI免疫

為了進一步解析參與調(diào)控植物PTI的免疫功能，首先分析了是否影響flg22激發(fā)的活性氧迸發(fā)。于本氏煙葉片中分別瞬時表達和2 d后，分析比較植物活性氧水平變化。結(jié)果顯示，相比于對照組，過表達的葉片表現(xiàn)出更為強烈的活性氧迸發(fā)水平（圖5-A）。

同時，接種致病疫霉于瞬時表達和的煙草葉片，利用qRT-PCR分析比較PTI標記基因（和）的表達變化。結(jié)果表明，在0和6 hpi，過表達均可促使和的表達量顯著高于對照（圖5-B）。以上結(jié)果揭示了在植物響應(yīng)致病疫霉侵染初期可增強植物PTI免疫反應(yīng)。

以馬鈴薯管家基因StEF1α為內(nèi)參，將0 hpi的StCYP83表達水平設(shè)為1 Housekeeping gene StEF1α of potato as internal reference. The expression level of StCYP83 at 0 hpi was set to 1

A：Western blot檢測煙草葉片中StCYP83B1蛋白表達，蛋白質(zhì)載量用麗春紅染色表示The protein expression of StCYP83B1 in N. benthamiana leaves was examined by Western blot, and protein loading was indicated by Ponceau staining。B：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙葉片瞬時轉(zhuǎn)化：左側(cè)注射GFP對照，右側(cè)注射轉(zhuǎn)有StCYP83B1的農(nóng)桿菌，表達2 d后接種致病疫霉游動孢子，于5 dpi記錄病斑，并進行臺盼藍染色A. tumefaciens-mediated transient transformation in N. benthamiana leaves. The left and right sides were expressed with GFP and StCYP83B1 genes, respectively. After two days, P. infestans zoospores were inoculated followed by photographing of disease symptom and trypan blue staining at 5 dpi。C：病斑面積統(tǒng)計。用于接菌測試的煙草葉片不少于10片（n=15）The lesion area was statistically analyzed. At least 10 N. benthamiana leaves were used for inoculation test (n=15)。D：侵染葉片中菌絲定殖量分析，以本氏煙管家基因NbF-box為內(nèi)參，利用qRT-PCR檢測致病疫霉管家基因PiUBC的表達，將過表達GFP葉片中的致病疫霉生物量設(shè)為1。3次獨立試驗均獲得相似結(jié)果Quantification of P. infestans biomass in infected N. benthamiana leaves. The expression level of housekeeping genePiUBC of P. infestans was detected by qRT-PCR with housekeeping gene NbF-box of N. benthamiana as internal reference. The P. infestans biomass in leaves overexpressing GFP was set to 1. Similar results were obtained from three individual experiments

A：將過表達GFP和StCYP83B1的本氏煙葉片用1 μmol·L-1 flg22處理后，利用魯米諾化學發(fā)光法檢測活性氧迸發(fā)水平。結(jié)果表示為6個生物學重復(fù)的平均值±標準誤ROS burst was measured using a luminol-based chemiluminescence assay in the overexpression of GFP and StCYP83B1 leaves treated with 1 μmol·L-1 flg22. Results were the mean±SE of 6 biological replicates。B：在致病疫霉侵染不同時期，NbWRKY7和NbWRKY8在過表達GFP和StCYP83B1的本氏煙葉片的表達量，將過表達GFP葉片中0 hpi的PTI標記基因的表達量設(shè)為1 The expression levels of NbWRKY7 and NbWRKY8 in leaves of N. benthamiana overexpressed with GFP and StCYP83B1, respectively, during P. infestation infection. The expression level of PTI marker genes at 0 hpi in GFP-expressed leaves was set to 1

2.6 StCYP83B1過表達可激活SA和JA信號通路

為進一步探究影響植物抗疫霉菌的作用機理，以為對照，于本氏煙葉片瞬時表達2 d后，進行致病疫霉接種，分別于0和6 hpi采樣用以分析植物防御激素水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）信號通路相關(guān)基因的表達變化。qRT-PCR結(jié)果表明，在0和6 hpi，與對照相比，過表達的本氏煙葉片中SA信號通路標記基因（）和JA信號通路標記基因（）的表達量均顯著升高（圖6-A、6-B）。該結(jié)果揭示了在植物響應(yīng)致病疫霉侵染初期，可能通過快速激活SA和JA信號通路而影響植物免疫。

對瞬時表達2 d后的煙草葉片接種致病疫霉游動孢子，并在接菌0和6 hpi提取葉片總RNA，以本氏煙管家基因NbEF1α作為內(nèi)參，將過表達GFP葉片中0 hpi的SA和JA標記基因的表達水平設(shè)為1

2.7 StCYP83B1保守基序中的半胱氨酸位點為其抗性功能所必需

為了探究CYP450酶催化活性是否影響的免疫功能，將StCYP83B1血紅素結(jié)合域—— FxxGxxxCxG中的半胱氨酸（Cys）位點突變成絲氨酸（Ser），通過分段融合PCR構(gòu)建p35S::P- StCYP83B1植物表達載體，并借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達體系分別將p35S::與p35S::GFP-StCYP83B1表達載體注射于煙草葉片。免疫印跡檢測確認了半胱氨酸（Cys）位點的突變不會影響蛋白正常表達（圖7-A）。接種致病疫霉于瞬時表達后的煙草葉片，結(jié)果顯示，相比于過表達，StCYP83B1過表達顯著增加了煙草對致病疫霉的感病性，呈現(xiàn)出更大的病斑面積（圖7-B、7-C）以及更多的病菌定殖生物量（圖7-D）。該結(jié)果揭示了CYP450酶血紅素結(jié)合域中的半胱氨酸位點對于發(fā)揮抗性功能必不可少。

2.8 StCYP83B1影響馬鈴薯抗晚疫病的功能分析

為明確影響馬鈴薯抗晚疫病的生物學功能，利用已構(gòu)建的-OE轉(zhuǎn)化植株（Line1、Line2）[31]進行接菌測試。于5周齡的大西洋和-OE轉(zhuǎn)化株系（Line1、Line2）葉片背部接種致病疫霉游動孢子4 d后，對其病斑面積進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)-OE轉(zhuǎn)化株系（Line1、Line2）葉片的病斑面積均顯著小于對照株系（圖8-A、8-B），且葉片中致病疫霉的定殖生物量也顯著小于對照（圖8-C）。該結(jié)果驗證了過表達能夠增強馬鈴薯對晚疫病的抗性。

A：Western blot檢測煙草葉片中StCYP83B1(C438S)蛋白表達，蛋白質(zhì)載量用麗春紅染色表示The protein expression of StCYP83B1(C438S) in N. benthamiana leaves was examined by Western blot, and protein loading was indicated by Ponceau staining。B：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙葉片瞬時轉(zhuǎn)化，表達2 d后接種致病疫霉游動孢子，于5 dpi記錄病斑，并進行臺盼藍染色The N. benthamiana leaves were transiently expressed with either StCYP83B1 or StCYP83B1(C438S) for 2 days prior to the inoculation with P. infestans zoospores, followed by photographing of disease symptom and trypan blue staining at 5 dpi。C：病斑面積統(tǒng)計。用于接菌測試的煙草葉片不少于10片（n=26）The lesion area was statistically analyzed. At least 10 N. benthamiana leaves were used for the pathogenicity assay (n=26)。D：侵染葉片中菌絲定殖量分析，以本氏煙管家基因NbF-box為內(nèi)參，利用qRT-PCR檢測致病疫霉管家基因PiUBC的表達，將過表達StCYP83B1(C438S)葉片中的致病疫霉生物量設(shè)為1。3次獨立試驗均獲得相似結(jié)果Quantification of P. infestans biomass in infected N. benthamiana leaves. The expression level of housekeeping gene PiUBC of P. infestans was detected by qRT-PCR with housekeeping gene NbF-box of N. benthamiana as internal reference. The P. infestans biomass in leaves overexpressing StCYP83B1(C438S) was set to 1. Similar results were obtained from three individual experiments

A：接種致病疫霉4 d后馬鈴薯葉片病斑面積觀察以及臺盼藍染色結(jié)果Lesion area of potato leaves at 4 dpi and the leaves were stained by trypan blue。B：病斑面積統(tǒng)計。用于接菌測試的馬鈴薯葉片不少于10片（n=10）The lesion area was statistically analyzed. At least 10 potato leaves were used for the pathogenicity assay (n=10)。C：侵染葉片中菌絲定殖量分析，以馬鈴薯管家基因StEF1α為內(nèi)參，利用qRT-PCR檢測致病疫霉管家基因PiUBC的表達，將大西洋中的致病疫霉生物量設(shè)為1 Quantification of P. infestans biomass in infected potato leaves. The expression level of housekeeping gene PiUBC of P. infestans was detected by qRT-PCR with housekeeping gene StEF1α of potato as internal reference. The P. infestans biomass in Atlantic was set to 1

2.9 StCYP83B1參與調(diào)控馬鈴薯PTI免疫反應(yīng)

為了進一步驗證參與調(diào)控馬鈴薯PTI的免疫功能，首先分析了是否影響flg22激發(fā)的活性氧迸發(fā)。結(jié)果顯示，相比于對照植株大西洋，flg22觸發(fā)的活性氧迸發(fā)在-OE株系（Line1、Line2）中更為強烈（圖9-A）。

然后，利用qRT-PCR分析比較了PTI標記基因（、和）的表達變化。結(jié)果表明，、和在flg22處理后的對照材料（大西洋）中呈下調(diào)表達；與之相比，3個PTI標記基因在flg22處理后的-OE株系（Line1、Line2）中均呈顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達；在flg22處理2 h后，相比于大西洋，-OE株系（Line1、Line2）中的、、表達量均顯著升高（圖9-B）。以上結(jié)果表明，過表達可增強馬鈴薯的PTI免疫反應(yīng)。

2.10 StCYP83B1激活SA和JA信號通路

為了進一步驗證是否影響SA和JA信號通路，對-OE株系（Line1、Line2）和對照植株大西洋分別進行接菌處理。SA信號通路相關(guān)基因（、、和）的表達結(jié)果表明，盡管-OE株系（Line1、Line2）中、和的本底表達水平低于對照材料（大西洋），但在致病疫霉侵染后，-OE株系（Line1、Line2）中、、和的誘導(dǎo)上調(diào)表達幅度明顯高于對照材料，其中和在24、36 hpi均顯著高于對照，在24 hpi顯著高于對照，在36 hpi顯著高于對照（圖10-A）。

JA信號通路相關(guān)基因（、和）的表達結(jié)果表明，盡管-OE株系（Line1、Line2）中的本底表達水平低于對照材料，但在24、36 hpi均顯著高于對照，在24 hpi顯著高于對照，在0、36 hpi顯著高于對照（圖10-B）。以上結(jié)果揭示了可能通過激活SA和JA信號通路而增強馬鈴薯對晚疫病的抗性。

A：將大西洋和StCYP83B1-OE株系的葉片用1 μmol·L-1 flg22處理后，利用魯米諾化學發(fā)光法檢測活性氧迸發(fā)水平。結(jié)果表示為6個生物學重復(fù)的平均值±標準誤ROS burst was measured using a luminol-based chemiluminescence assay in the Atlantic and StCYP83B1-OE leaves treated with 1 μmol·L-1 flg22. Results were the mean±SE of 6 biological replicates。B：用40 μmol·L-1 flg22處理馬鈴薯葉片后提取總RNA，以馬鈴薯管家基因StEF1α為內(nèi)參，利用qRT-PCR檢測StCYP83B1-OE株系中StWRKY7、StWRKY8和StACRE31的表達量，將大西洋中0 h的PTI標記基因表達量設(shè)為1（n=3）Total RNA was extracted from 40 μmol·L-1 flg22-treated potato leaves. The expression levels of StWRKY7, StWRKY8 and StACRE31 of StCYP83B1-OE were detected by qRT-PCR with housekeeping gene StEF1α of potato as internal reference. The expression level of PTI marker genes at 0 h in Atlantic was set to 1 (n=3)

3 討論

3.1 StCYP83基因家族可能在馬鈴薯與致病疫霉互作中發(fā)揮重要功能

本研究鑒定到的編碼的蛋白質(zhì)序列大小介于387—503 aa，分子量介于44—57 kDa，理論等電點在5.45—9.10，表明家族成員間的蛋白質(zhì)大小、等電點等特征差異較大。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示StCYP83蛋白均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，這與WILLIAMS等[32]報道的大多數(shù)植物CYP450都與膜結(jié)合，通過其N端疏水螺旋錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的研究結(jié)果相一致。結(jié)構(gòu)分析顯示，家族進化樹中聚類在一起的基因其內(nèi)含子與外顯子的數(shù)量相同（圖1），符合PAQUETTE等[33]研究的家族成員間內(nèi)含子保守情況與進化相關(guān)。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，每個StCYP83家族成員序列都有保守的ExxR、PERF和FxxGxxxCxG/A（圖2），與已有研究相對應(yīng)：所有生物CYP450分子之間都具有一定的序列保守性，即CYP450在不同物種間具有同源性，這種同源性表明它們都起源于共同的祖先[34]。家族成員在不同程度上均可響應(yīng)致病疫侵染而誘導(dǎo)表達（圖3），表明家族基因可能在馬鈴薯與致病疫霉的互作過程中發(fā)揮作用。在致病疫霉侵染每個時間點均顯著上調(diào)表達（圖3），且與同源性最高，因此，本研究選取用于后續(xù)免疫功能的分析。

以馬鈴薯的管家基因StEF1α為內(nèi)參，將大西洋中0 hpi的SA和JA相關(guān)基因的表達水平設(shè)為1（n=3）Housekeeping gene StEF1α of potato as internal reference. The expression level of SA and JA related genes at 0 hpi in Atlantic was set to 1 (n=3)

編碼蛋白含有保守的血紅素結(jié)合域—— FxxGxxxCxG，其中的C（半胱氨酸）殘基絕對保守，其與亞鐵血紅素中的鐵元素形成硫醇鹽離子鍵，在CYP450酶的催化活性中起重要作用，Hatae等[35]發(fā)現(xiàn)將保守的C（半胱氨酸）突變成S（絲氨酸）可以使其酶活喪失。本研究證明了編碼蛋白保守基序中的半胱氨酸位點為其免疫功能所必需（圖7），這意味著可以通過對該位點的基因修飾來增強酶活水平，進而提升的免疫功能，使其在抗病分子育種中發(fā)揮更大的作用。

3.2 StCYP83B1可能通過激活PTI免疫反應(yīng)調(diào)控植物免疫

在煙草瞬時表達體系中，過表達可顯著提升植物對致病疫霉的抗性和增強植物PTI免疫反應(yīng)（圖4、圖5），表明可能是晚疫病正調(diào)控因子，因此將轉(zhuǎn)入晚疫病易感品種大西洋中以驗證其免疫功能[31]。對獲得的OE轉(zhuǎn)化馬鈴薯進行接菌測試，發(fā)現(xiàn)與對照相比，OE株系對致病疫霉的抗性有所增強（圖8）。活性氧迸發(fā)是由分子模式識別受體FLS2識別細菌鞭毛短肽flg22而激活的植物PTI免疫反應(yīng)的標志性事件之一。植物產(chǎn)生的高水平活性氧作為一種毒性因子可抑制病原菌的侵染，從而提高植物抗性[36]。擬南芥抗病突變體在寄生疫霉侵染后產(chǎn)生高水平活性氧并誘導(dǎo)細胞死亡以限制病原菌的侵染[37]。線粒體RNA加工蛋白RTP7通過調(diào)控線粒體活性氧迸發(fā)介導(dǎo)植物對多種病菌的廣譜抗性[38]。OE株系在flg22處理后，活性氧水平顯著高于對照（圖9-A）。因此，推測OE株系可能通過維持較高水平活性氧以抵御致病疫霉的侵染。PAMP識別啟動MAPK信號級聯(lián)反應(yīng)，是PTI最早期的信號事件之一[39]，進一步激活WRKY轉(zhuǎn)錄因子（例如），導(dǎo)致抗性相關(guān)基因的上調(diào)表達[21]。PTI標記基因是一種鈣結(jié)合蛋白，可被激發(fā)子快速誘導(dǎo)并參與植物防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[40]。在本研究中，OE株系中的PTI標記基因（、和）顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達（圖9-B），這些結(jié)果揭示了介導(dǎo)的免疫功能與增強的PTI免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

而PTI作為植物先天免疫的第一道防線，在提升寄主植物對多種病原菌的廣譜抗性中具有重要作用。例如，通過增強擬南芥PTI來提高對細菌和真菌的廣譜抗性[41]。因此，鑒定PTI關(guān)鍵調(diào)控因子，并將之應(yīng)用于抗病育種中被認為是行之有效的策略。本研究中的OE株系呈現(xiàn)出增強的PTI免疫反應(yīng)（圖9），揭示可能是植物PTI免疫反應(yīng)的正調(diào)控因子。后續(xù)可利用OE株系測試其對多種病原菌的抗性，以探究介導(dǎo)的馬鈴薯廣譜抗性功能與作用機制。

3.3 StCYP83B1可能通過影響SA和JA調(diào)控植物對致病疫霉的抗性

SA和JA作為植物體內(nèi)兩種主要的防御激素，在植物抵抗病原菌的過程中發(fā)揮重要作用[42]。通過SA和JA信號通路負調(diào)控水稻對稻瘟病和白葉枯病的抗性，相比于野生型水稻和-OE株系，突變體中SA相關(guān)基因（和）和JA相關(guān)基因（、、、和）明顯上調(diào)，且SA和JA累積增加[43]。棉花通過激活JA和SA信號通路（沉默植株中JA相關(guān)基因（、和）、SA相關(guān)基因（和）下調(diào)且SA和JA含量下降）增強植物對黃萎病的抗性[44]。這些結(jié)果表明SA和JA可協(xié)同調(diào)控植物免疫。在本研究中，本氏煙瞬時過表達可促使植物SA信號通路標記基因（和）和JA信號通路標記基因（和）上調(diào)表達（圖6）。進一步制備了OE穩(wěn)定轉(zhuǎn)化馬鈴薯[31]，以進一步解析該基因抗晚疫病的免疫功能及作用機理。通過分析接種致病疫霉的-OE株系中SA和JA信號通路相關(guān)基因的表達量變化，發(fā)現(xiàn)-OE株系中SA和JA信號通路相關(guān)基因均明顯上調(diào)表達（圖10）。該結(jié)果揭示了可能通過協(xié)同調(diào)控SA和JA信號通路而影響馬鈴薯對晚疫病的抗性。然而，如何協(xié)同調(diào)控SA和JA信號通路的作用機制有待進一步深入研究。

值得注意的是，OE株系中SA信號通路相關(guān)基因誘導(dǎo)表達比JA更為顯著（圖10）。致病疫霉是一種半活體營養(yǎng)型病原菌，在其侵染寄主初期正處于活體營養(yǎng)型生長階段。前期研究表明，感病因子RTP1可通過影響植物SA信號及細胞死亡以負調(diào)控擬南芥對疫霉菌的抗性[37]，從而證實SA信號通路在植物抗半活體營養(yǎng)型病原菌中的重要作用。因此，推測可能在馬鈴薯響應(yīng)致病疫霉侵染初期更強烈地激活SA免疫信號通路。

4 結(jié)論

共鑒定到10個家族成員，家族成員在不同程度上均可響應(yīng)致病疫霉的侵染，其中在植物抗致病疫霉中具有重要功能。通過激活PTI、SA和JA信號通路調(diào)控植物免疫。此外，StCYP83B1血紅素結(jié)合域中的半胱氨酸位點為其抗性功能所必需。

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Identification ofGene Family in Potato and Analysis of its Function in Resistance against Late Blight

KONG LeHui, ZONG DeQian, SHI QingYao, YIN PanPan, WU WenYu, TIAN Peng,SHAN WeiXing, QIANG XiaoYu

College of Agronomy, Northwest A & F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling 712100, Shaanxi

【Objective】The objective of this study is to identifygene family in potato and analyze their expression patterns in response toinfection, so as to mine thegenes with potential function in resistance to late blightand provide novel resistance gene resources for molecular resistance breeding in potato.【Method】The members ofgene family were identified by bidirectional BLASTmethod. The basic information of StCYP83 protein sequence, subcellular localization and conserved motifs were analyzed by ExPASy Prot Param, Cell-Ploc 2.0 and ESPript, etc. The qRT-PCR was used to analyze the expression pattern ofgenes in response toinfection. The immune function of candidate geneagainstwas analyzed in either-mediated transient transformation inleaves ofor stably transformed potato lines with overexpression (OE) of.【Result】A total of 10genes were identified in the potato genome, which were named,respectively, with the encoded protein lengths ranging from 387 to 503 aa and molecular weights ranging from 44 to 57 kDa. The subcellular localization of StCYP83 proteins was predicted in the endoplasmic reticulum. The qRT-PCR confirmed that members ofcould be induced in response toinfection, suggesting thatgenes might play a role in the interaction between potato and. Accordingly,with the highest homology towas selected as a candidate gene for subsequent immune functional analysis. The pathogenicity assay onleaves showed thatoverexpression ofcould enhance plant resistance against. In accordance with this, overexpression ofcould significantly promote the up-regulation expression of PTI marker genes (and), SA signaling marker genes (and), JA signalingmarker genes (and) and enhance the reactive oxygen species (ROS) burst induced by flg22. In addition, cysteine site in the conserved motif of StCYP83B1 protein was required for its immune function.overexpression (-OE) lines showed enhanced resistance to.In accordance with this,-OE could enhance PTI immune responses, including the increased level of ROS induced by flg22 and the significantly up-regulated expression of PTI marker genes (,and) as well as SA-mediated signaling marker genes (,,and) and JA-mediated signaling marker genes (,and) in response toinfection.【Conclusion】A total of 10 members offamily were identified, which could be induced byinfection in different degrees.regulates plant resistance toby activating PTI, SA and JA signaling pathways. The cysteine site in the heme binding domain of StCYP83B1 is required for its immune function.

potato ();gene family;; plant resistance; late blight

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.16.007

2023-06-08；

2023-06-14

國家自然科學基金（31872657）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-09）、國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0200602-2）

孔樂輝，E-mail：542909995@qq.com。通信作者單衛(wèi)星，E-mail：wxshan@nwafu.edu.cn。通信作者強曉玉，E-mail：qiangxiaoyu@nwafu.edu.cn

（責任編輯 岳梅）