李仁靜，申晚霞，趙婉彤，程莉，李沛，江東

利用SLAF-seq簡(jiǎn)化基因組數(shù)據(jù)挖掘甜橙果實(shí)品質(zhì)性狀基因

李仁靜，申晚霞，趙婉彤，程莉，李沛，江東

1西南大學(xué)柑橘研究所，重慶 400712

【目的】通過(guò)對(duì)240份不同甜橙資源群體利用SLAF-seq測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行Fst與XP-CLR選擇性清除分析，挖掘調(diào)控甜橙中優(yōu)良性狀的相關(guān)基因，為甜橙的分子育種工作提供重要參考?！痉椒ā繉?duì)國(guó)家柑橘種質(zhì)資源圃（重慶）中保存的具有廣泛遺傳多樣性和不同地理來(lái)源的240份甜橙種質(zhì)資源進(jìn)行SLAF-seq測(cè)序，獲得全基因組范圍內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）基因型數(shù)據(jù)和單果重、果臍有無(wú)、可滴定酸含量等性狀的表型數(shù)據(jù)，分析不同亞群之間Fst與XP-CLR數(shù)值?！窘Y(jié)果】采用SLAF-seq技術(shù)對(duì)240份甜橙進(jìn)行測(cè)序，共獲得497.82 Mb短讀數(shù)據(jù)，用BWA軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到甜橙參考基因組上，取GATK和samtools兩種方法得到的SNP標(biāo)記交集，共得到1 467 968個(gè)SNP。利用Fst與XP-CLR分析篩選出了與甜橙果臍有無(wú)、單果重以及可滴定酸相關(guān)的候選基因。對(duì)受選擇snp位點(diǎn)附近區(qū)域進(jìn)行基因注釋，結(jié)果表明基因orange1.1g044639m和orange1.1g023641m參與編碼生長(zhǎng)素外排載體，可能與臍的形成相關(guān)；orange1.1g023641m在單果重性狀中的Fst得分最高，其參與編碼E3泛素連接酶，可能影響果實(shí)大小和重量，orange1.1g046891m可能通過(guò)調(diào)節(jié)碳水化合物的形成來(lái)影響果實(shí)重量；orange1.1g011684m編碼丙酮酸脫氫酶二氫硫辛酰胺轉(zhuǎn)乙?；?，其cds序列發(fā)生堿基突變，可能影響了檸檬酸在不同品種間的含量；orange1.1g034502編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，基因注釋功能與磷酸化/去磷酸化相關(guān)?！窘Y(jié)論】本研究利用Fst方法對(duì)甜橙的SLAF-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選。最終在甜橙資源的有無(wú)果臍、單果重和可滴定酸等性狀上篩選出了6個(gè)相關(guān)的基因，可作為后期驗(yàn)證的候選基因，為甜橙品種的定向改良提供了依據(jù)。

SLAF-seq；Fst；XP-CLR；甜橙；單果重；可滴定酸含量；果臍有無(wú)

0 引言

【研究意義】甜橙作為目前國(guó)際市場(chǎng)上受歡迎程度較高的柑橘類(lèi)水果，研究其重要的園藝性狀遺傳基礎(chǔ)，有利于加強(qiáng)其種質(zhì)資源的高效管理和遺傳改良。對(duì)于甜橙品種來(lái)說(shuō)，較重要的園藝性狀有單果重量、可滴定酸含量、種子數(shù)等。甜橙中果臍的有無(wú)是臍橙品種區(qū)別于其他普通甜橙品種的一個(gè)重要園藝特征，也是普通甜橙園藝種類(lèi)劃分的重要依據(jù)，由于臍橙的果實(shí)品質(zhì)較好，因而受到消費(fèi)者和育種者的密切關(guān)注。目前，市場(chǎng)上較受消費(fèi)者歡迎的甜橙一般來(lái)說(shuō)都具有外觀漂亮、高產(chǎn)、無(wú)核、糖酸比合適、耐貯運(yùn)等特質(zhì)[1]。本研究利用SLAF-seq（specific locus amplified fragment sequencing）數(shù)據(jù)挖掘甜橙果臍有無(wú)、單果重量、可滴定酸含量等園藝性狀的相關(guān)基因，為這些性狀的改良提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】SLAF-seq技術(shù)是一項(xiàng)基于限制性內(nèi)切酶和高通量測(cè)序的大規(guī)?；蚪M測(cè)序技術(shù)[2]，其具有不受參考基因組限制，酶切方案靈活、避開(kāi)重復(fù)序列、簡(jiǎn)化復(fù)雜基因組等優(yōu)點(diǎn)，且開(kāi)發(fā)的SNP分子標(biāo)記性價(jià)比高、穩(wěn)定性好，在基因組中分布均勻，已在群體進(jìn)化[3-4]、分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)[5-6]、全基因組關(guān)聯(lián)分析[7-8]、遺傳圖譜構(gòu)建[9-10]及QTL定位[11]等研究上發(fā)揮了重要的作用。目前，SLAF測(cè)序技術(shù)已在陸地棉[12-13]、大豆[8]、南美白對(duì)蝦[14]、蘋(píng)果[11]等得到廣泛應(yīng)用。近年來(lái)對(duì)于柑橘重要園藝性狀如柑橘果實(shí)無(wú)核[15]、果肉顏色[16]、果實(shí)酸度[17]等方面的研究越來(lái)越多。WANG等[18]在114個(gè)芽變甜橙品種中共鑒定到2 321個(gè)結(jié)構(gòu)變異，進(jìn)一步鑒定到877個(gè)轉(zhuǎn)座子跳躍事件。遺傳和基因功能研究表明，這些轉(zhuǎn)座子在低酸和無(wú)酸的突變體中插入到轉(zhuǎn)運(yùn)子基因或者其調(diào)控基因前，從而影響了果實(shí)的pH及檸檬酸含量。Shi等[19]發(fā)現(xiàn)柑桔中檸檬酸含量的變化和p型質(zhì)子泵基因的表達(dá)高度相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)于甜橙園藝性狀的調(diào)控基因報(bào)道主要集中在可滴定酸含量變化上，對(duì)于臍橙的“臍”形成的相關(guān)基因以及影響柑橘果實(shí)重量的基因尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)240份甜橙種質(zhì)的SLAF-seq測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)合連續(xù)兩年的表型數(shù)據(jù)，采用Fst方法與XP-CLR獲得不同類(lèi)別甜橙與性狀相關(guān)性較高的SNP候選位點(diǎn)，進(jìn)而篩選出與可滴定酸含量、單果重、果臍的有無(wú)相關(guān)的候選基因，為后期的育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

240份甜橙種質(zhì)資源均來(lái)自重慶市北碚區(qū)的國(guó)家柑橘種質(zhì)資源圃（重慶），詳見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取和文庫(kù)構(gòu)建 春季采集甜橙幼嫩葉片裝在1.5 mL離心管存于液氮中，樣品交北京百邁客科技有限公司進(jìn)行DNA的提取、質(zhì)檢、建庫(kù)以及測(cè)序。選取適量DNA用于文庫(kù)的構(gòu)建，采用I+III酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切。并且針對(duì)得到的酶切片段進(jìn)行3′末端加A處理、連接Dual-index測(cè)序接頭，隨后對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化，將純化后的樣品進(jìn)行混樣，電泳后割膠回收350—400 bp的DNA條帶，用于在Illumina測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。

表1 本研究中所采用的240份甜橙種質(zhì)資源

續(xù)表1 Continued table 1

1.2.2 可滴定酸含量與單果重測(cè)定 可滴定酸含量與單果重測(cè)定均參照《柑橘種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[20]，從樹(shù)體東、南、西、北4個(gè)方位隨機(jī)采取10個(gè)成熟果。

1.2.3 單核苷酸多態(tài)性（SNP）鑒定 下機(jī)后的短讀序列經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制后，利用BWA軟件[21]將高質(zhì)量的測(cè)序短讀序列比對(duì)到甜橙參考基因組上（https://www. citrusgenomedb.org/analysis/174），并使用GATK[22]和samtool[23]兩種方法鑒定SNP，以兩種方法得到的SNP標(biāo)記交集作為最終可靠的SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)集。

1.2.4 候選基因預(yù)測(cè) 目前最基礎(chǔ)、利用率最高的檢測(cè)自然選擇的方法就是計(jì)算群體之間的Fst值，F(xiàn)st可以認(rèn)為是在分層群體中不同亞群間相關(guān)基因的度量，F(xiàn)st的取值范圍為0—1，數(shù)值越大，表明群體間分化程度越大，其篩選到的差異基因的可靠性就越高[24]。對(duì)240份甜橙種質(zhì)資源在重慶北碚進(jìn)行連續(xù)兩年的果實(shí)可滴定酸含量、單果重、有無(wú)臍的分析，選擇低酸（可滴定酸含量低于0.5 mg/100 mL）和高酸（可滴定酸含量高于1 mg/100 mL）、大果（單果重高于250 g）和小果（單果重低于150 g）、有臍和無(wú)臍等分化群體，利用plink軟件逐位點(diǎn)計(jì)算Fst，將其閾值設(shè)定為0.25，再用柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.citrusgenomedb. org/）對(duì)篩選獲得的顯著性較高的SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因注釋。同時(shí)對(duì)上述三類(lèi)分組以選擇掃描窗口為50 kb、步長(zhǎng)為10 kb進(jìn)行XP-CLR分析，計(jì)算出的XP-CLR正則化值后利用R軟件包進(jìn)行可視化。對(duì)篩選獲得的XP-CLR最大值對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)利用柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋。

1.3 基因表達(dá)分析

分別收獲位于重慶市北碚區(qū)的國(guó)家柑橘種質(zhì)資源圃（重慶）中的高酸甜橙品種果實(shí)（‘摩洛血橙’‘銅水72-1錦橙’‘康拜爾夏橙’）以及低酸甜橙品種果實(shí)（‘埃及1號(hào)糖橙’‘冰糖橙’‘冰糖橙（仁4）’）幾個(gè)不同發(fā)育階段的代表性果實(shí)，去除外果皮和中果皮后，將剩余的果肉組織切成小塊后用液氮快速冷凍保存于-80℃冰箱中待用。采用Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取甜橙果肉總RNA，使用Hifair? III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。

使用Primer3 Input（version 0.4.0）在線設(shè)計(jì)熒光定量引物（表2）以及基因克隆引物，內(nèi)參基因?yàn)楦涕伲贑FX96 TouchTM熒光定量PCR儀進(jìn)行qPCR反應(yīng)。擴(kuò)增體系包含2 μL cDNA，上、下游引物各0.4 μL，Hieff UNICON? Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 5 μL，2.2 μL RNase Free ddH2O，共10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理3次重復(fù)。

表2 qPCR試驗(yàn)所用引物

1.4 基因克隆測(cè)序

使用Primer3 Input（version 0.4.0）在線設(shè)計(jì)基因克隆引物，引物名稱為orange1.1g011684，正向引物序列為CTGCAAGCCGGGTACTTAAA，反向引物序列為T(mén)CCTACGTTTTTCCTGCTGTT。使用pClone007 Versatile Simple Vector Kit、Trelirf 5α Chenically Competent Cell（擎科生物）進(jìn)行克隆測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用Excel處理，并用SPSS 18.0進(jìn)行差異性統(tǒng)計(jì)分析；使用GraphPad Prism繪制圖形。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序質(zhì)量

240份甜橙種質(zhì)經(jīng)過(guò)DNA質(zhì)量檢測(cè)、酶切建庫(kù)和SLAF-seq測(cè)序共產(chǎn)生497.82 Mb短讀數(shù)據(jù)，測(cè)序平均Q30為94.70%，平均GC含量為41.31%。高質(zhì)量的測(cè)序短讀數(shù)據(jù)通過(guò)BWA軟件比對(duì)到甜橙參考基因組（citrus sinensis V1.1），群體樣本與甜橙參考基因組的比對(duì)率為70.01%—76.95%，表明本研究中的樣本與甜橙參考基因組有較高的遺傳相似性，其中澳大利亞紅夏橙的比對(duì)率最低，深紅皮甜橙的比對(duì)率最高。GATK和samtools兩種方法的SNP標(biāo)記取交集，共得到1 467 968個(gè)高質(zhì)量的SNP位點(diǎn)用于后續(xù)分析。

2.2 主成分分析

利用PCA分析法對(duì)240份甜橙種質(zhì)進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯分組情況出現(xiàn)，說(shuō)明甜橙的基因組較為混雜，利用基因組SNP數(shù)據(jù)不能將園藝學(xué)上臍橙、血橙、普通甜橙進(jìn)行準(zhǔn)確的劃分。具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

為評(píng)價(jià)240份甜橙種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)，使用ΔK來(lái)劃分亞群，當(dāng)K=3時(shí)觀察到最大的ΔK，表明240份甜橙種質(zhì)可分為Q1、Q2、Q3三組，詳見(jiàn)圖2。其中Q1包含絕大部分的臍橙和血橙以及少部分的普通甜橙，Q2包含絕大部分的普通甜橙和少部分的臍橙，Q3包含一部分普通甜橙以及少部分的臍橙和血橙，并不能在園藝學(xué)層面上將其完全劃分，這與PCA的結(jié)果一致。

BO：血橙 Blood orange；NO：臍橙 Navel orange；OSO：普通甜橙 Ordinary sweet。下同 The same as below

藍(lán)色為Q1，紅色為Q2，綠色為Q3 Blue refer to Q1, Red refer to Q2, Green refer to Q3

2.4 調(diào)控臍、單果重、可滴定酸園藝性狀的相關(guān)基因預(yù)測(cè)

利用Fst分析比較了有臍（21）和無(wú)臍（25）有明顯差異的兩個(gè)類(lèi)群（圖3），在scaffold00042上發(fā)現(xiàn)了可能與果臍發(fā)育相關(guān)的snp位點(diǎn)，臨近該位點(diǎn)的基因?yàn)閛range1.1g044639m，該基因注釋為生長(zhǎng)素外排載體，編碼生成的蛋白質(zhì)屬于PIN蛋白，參與生長(zhǎng)素在植物體內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。在該位點(diǎn)的下游則是orange1.1g023641m，注釋為含有RING結(jié)構(gòu)域的與膜結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因，其在克里曼丁當(dāng)中的同源蛋白注釋為參與生長(zhǎng)素的外排運(yùn)輸。利用XP-CLR方法在有臍（21）和無(wú)臍（25）兩個(gè)類(lèi)群中進(jìn)行選擇性清除分析，同樣鑒定出生長(zhǎng)素外排載體所在基因位置有最強(qiáng)的選擇信號(hào)。

利用Fst比較分析單果重（46）和單果輕（52）有明顯差異的兩個(gè)類(lèi)群（圖4），鑒定了2個(gè)與單果重量相關(guān)的候選基因，均位于scaffold00042上。Fst得分最高的是orange1.1g023641m，SNP位于scaffold00042的234 747處，該基因被注釋為含有RING結(jié)構(gòu)域和膜相關(guān)的基因，參與E3泛素連接酶的合成。在該基因的上游為orange1.1g046891m，基因注釋是-糖苷酶，其參與碳水化合物代謝過(guò)程，可能通過(guò)調(diào)節(jié)碳水化合物的合成來(lái)影響果實(shí)重量。利用XP-CLR方法在單果重（46）和單果輕（52）兩個(gè)類(lèi)群中進(jìn)行選擇性清除分析，同樣鑒定出調(diào)控E3泛素連接酶所在基因位置有最強(qiáng)的選擇信號(hào)。

圖3 利用有臍和無(wú)臍兩個(gè)甜橙群體計(jì)算的全基因組Fst值（A）和XP-CLR選擇消除分析結(jié)果（B）

通過(guò)對(duì)240份甜橙種質(zhì)在重慶北碚進(jìn)行連續(xù)兩年的果實(shí)TA含量分析，利用Fst比較分析低酸（28）和高酸（30）有明顯差異的兩個(gè)類(lèi)群（圖5），鑒定了3個(gè)可滴定酸的候選基因。根據(jù)Fst結(jié)果，顯示在sacffold00019上有和TA顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，其臨近基因?yàn)閛range1.1g011684m，該基因注釋為丙酮酸脫氫酶復(fù)合物二氫硫辛酰賴氨酸殘基乙酰轉(zhuǎn)移酶，其在檸檬酸循環(huán)中扮演著重要角色。該酶是由酰基轉(zhuǎn)移酶生成乙酰輔酶A，之后草酰乙酸、H2O和乙酰輔酶A經(jīng)ATP-檸檬酸合酶催化后，在線粒體內(nèi)發(fā)生雙向反應(yīng)，生成CoA與檸檬酸。該基因的下游是orange1.1g002727m，注釋為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PRP4同源物。在Fst得分較高的scaffold00012上鑒定到的是orange1.1g034502，注釋為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase），該酶是利用ATP作為磷酸鹽供體，催化目標(biāo)蛋白上的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化的蛋白激酶。對(duì)該SNP位點(diǎn)的基因型分析表明，高酸品種基因型為T(mén)/T，低酸品種的基因型為C/C、T/C。利用XP-CLR方法在低酸（28）和高酸（30）兩個(gè)類(lèi)群中進(jìn)行選擇性清除分析，同樣鑒定出絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶所在基因位置有最強(qiáng)的選擇信號(hào)。

圖4 利用輕果和重果兩個(gè)甜橙群體計(jì)算的全基因組Fst值（A）和XP-CLR選擇消除分析結(jié)果（B）

2.5 關(guān)于調(diào)控可滴定酸候選基因的初步驗(yàn)證

2.5.1 可滴定酸含量動(dòng)態(tài)變化情況 分別對(duì)‘康拜爾夏橙’‘摩洛血橙’‘銅水72-1錦橙’‘冰糖橙（仁4）’‘埃及1號(hào)糖橙’以及‘冰糖橙’在花后45、75、105、135、165、195和225 d果實(shí)汁胞中可滴定酸含量進(jìn)行測(cè)定（圖6）。

圖5 利用高酸和低酸兩個(gè)甜橙群體計(jì)算的全基因組Fst值（A）和XP-CLR選擇消除分析結(jié)果（B）

結(jié)果顯示，隨著柑桔果實(shí)的發(fā)育，6個(gè)品種果實(shí)汁胞中的可滴定酸含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在花后45 d，6個(gè)品種的TA含量并無(wú)明顯區(qū)別，隨后，‘康拜爾夏橙’‘摩洛血橙’‘銅水72-1錦橙’3個(gè)高酸品種的TA含量急劇上升。其中‘摩洛血橙’‘銅水72-1錦橙’的可滴定酸含量在花后105 d達(dá)到峰值，之后開(kāi)始下降并在花后165 d趨于平穩(wěn)，而‘康拜爾夏橙’的可滴定酸含量在持續(xù)增加?！浅龋ㄈ?）’‘埃及1號(hào)糖橙’以及‘冰糖橙’3個(gè)低酸品種的TA含量在花后45 d之后的變化量明顯低于‘康拜爾夏橙’‘摩洛血橙’‘銅水72-1錦橙’3個(gè)高酸品種。

2.5.2 利用qpcr對(duì)可滴定酸含量的候選基因進(jìn)行初步驗(yàn)證 在果實(shí)發(fā)育周期中，orange1.1g034502m在高酸品種群‘康拜爾夏橙’‘摩洛血橙’‘銅水72-1錦橙’的果實(shí)汁胞中，于花后45 d時(shí)的表達(dá)量最低，隨后表達(dá)逐漸增加，在花后75 d達(dá)到峰值，其中在‘摩洛血橙’中的表達(dá)量最高，‘銅水72-1錦橙’次之，‘康拜爾夏橙’最低；在花后75—225 d呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)。在低酸品種群‘冰糖橙（仁4）’‘埃及1號(hào)糖橙’及‘冰糖橙’中的表達(dá)水平也呈現(xiàn)微弱的先升高后下降的趨勢(shì)，并且在花后75 d，高酸品種中orange1.1g034502m基因的表達(dá)水平明顯高于低酸品種（圖7）。

圖6 6個(gè)甜橙品種可滴定酸含量和變化趨勢(shì)

圖7 orange1.1g034502m在6個(gè)品種不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量

orange1.1g011684m在6個(gè)品種中呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在‘康拜爾夏橙’‘摩洛血橙’‘銅水72-1錦橙’‘埃及1號(hào)糖橙’‘冰糖橙（仁4）’中于花后135 d達(dá)到峰值，這與可滴定酸含量的變化趨勢(shì)一致。在低酸品種（‘冰糖橙（仁4）’‘埃及1號(hào)糖橙’ ‘冰糖橙’）中的表達(dá)量平均值高于高酸品種（‘康拜爾夏橙’‘摩洛血橙’‘銅水72-1錦橙’）（圖8）。orange1.1g11684m的cds序列在低酸品種中的1 314位發(fā)生堿基突變（G突變?yōu)锳），導(dǎo)致甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸（圖9）。

圖9 orange1.1g011684m cds序列突變示意圖

3 討論

3.1 對(duì)于調(diào)控甜橙“臍”發(fā)生的基因預(yù)測(cè)

臍橙作為甜橙當(dāng)中較為特殊的一類(lèi)芽變品種，因其往往具有較好的果實(shí)品質(zhì)，在市場(chǎng)上比普通甜橙受到更多的關(guān)注。到目前為止幾乎沒(méi)有調(diào)控臍橙“臍”生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)基因報(bào)道，推測(cè)臍橙的“臍”形成的原因可能與雌蕊發(fā)育有關(guān)，而生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸在花的形態(tài)建成中扮演了重要的角色。NIE等[25]在對(duì)黃瓜的研究中發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶抑制劑樣蛋白作為黃瓜中局部生長(zhǎng)素分布的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)量影響著生長(zhǎng)素的積累進(jìn)而調(diào)控了黃瓜花器官的發(fā)生。在對(duì)紫花苜蓿的研究中發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸會(huì)導(dǎo)致花發(fā)育出現(xiàn)異常[26]。而orange1.1g044639m基因參與生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，并且該基因參與編碼的PIN蛋白對(duì)器官的發(fā)生，花粉、雄配子體與孢子體的發(fā)育都受影響[27]，這在一定程度上也可解釋臍橙無(wú)核的原因，因?yàn)槟毘绕贩N多數(shù)是花粉和花藥敗育的，因此推測(cè)該基因與臍橙“臍”的形成存在密切關(guān)系。

3.2 對(duì)于調(diào)控甜橙果實(shí)重量基因的預(yù)測(cè)

果實(shí)重量一直都是育種家比較關(guān)注的重要園藝性狀。前人研究表明，E3泛素連接酶可能與果實(shí)重量的改變密切相關(guān)[28-30]。張永強(qiáng)[28]在對(duì)影響番茄大小的研究中發(fā)現(xiàn)可能與番茄果實(shí)的大小和重量有關(guān)。Song等[29]在水稻中發(fā)現(xiàn)一個(gè)定位于細(xì)胞質(zhì)中的基因，缺失該基因會(huì)加速水稻籽粒灌漿的速度，從而改變水稻的千粒重。對(duì)擬南芥中一個(gè)帶有E3泛素連接酶活性的基因研究發(fā)現(xiàn)，其轉(zhuǎn)基因植株后代的籽粒相較于野生型明顯增大，并且轉(zhuǎn)基因擬南芥的千粒重高于野生型[30]。所以，E3泛素連接酶參與調(diào)控果實(shí)大小可能具有廣譜性。本研究中發(fā)現(xiàn)的orange1.1g023641基因帶有E3泛素連接酶活性，但是該基因是否參與調(diào)控柑橘果實(shí)的大小和重量還有待進(jìn)一步深入研究。

3.3 對(duì)于甜橙中可滴定酸調(diào)控基因的預(yù)測(cè)

蘋(píng)果酸、檸檬酸等眾多有機(jī)酸是影響肉質(zhì)水果風(fēng)味的重要因素，而柑橘中的有機(jī)酸主要以檸檬酸為主[31]。因?yàn)闄幟仕岷吞O(píng)果酸都是三羧酸循環(huán)的產(chǎn)物，所以前人的很多研究都集中于三羧酸循環(huán)以及相關(guān)的代謝通路。DENG等[32]研究發(fā)現(xiàn)位于果實(shí)細(xì)胞線粒體內(nèi)的檸檬酸合成酶活性與臍橙果實(shí)中的檸檬酸含量呈極顯著正相關(guān)；Katz等[33]研究發(fā)現(xiàn)GABA途徑以及和氨基酸合成有關(guān)的酶活性在臍橙果實(shí)檸檬酸下降階段的表達(dá)水平明顯增加，使位于代謝通路下游的琥珀酸含量增加。乙酰輔酶A作為生成檸檬酸的重要前體物質(zhì)，由丙酮酸經(jīng)過(guò)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的催化而生成。該反應(yīng)需要3種酶連續(xù)催化，依次為E1（丙酮酸脫氫酶，EC1.2.4.1）、E2（二氫硫辛酰胺轉(zhuǎn)乙?；?，EC2.3.1.12）和E3（二氫硫辛酰胺脫氫酶，EC1.8.1.4）。E2作為其中的關(guān)鍵酶，其參與編碼的基因orange1.1g011684m cds序列中的第1 314位堿基由G突變?yōu)锳，導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，可能影響相關(guān)蛋白質(zhì)的活性進(jìn)而影響乙酰輔酶A的合成，形成了最終可滴定酸含量的差異，該酶有磷酸化和去磷酸化兩種形式。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶作為響應(yīng)外界信號(hào)從而特異性催化蛋白質(zhì)底物上的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化[34]，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)酶的相關(guān)功能。其調(diào)控的結(jié)果可影響包括TCA循環(huán)、糖酵解等途徑在內(nèi)的相關(guān)酶的表達(dá)。本研究中Orange1.1g034502m表達(dá)水平伴隨著TA含量的變化而出現(xiàn)同步的變化，推測(cè)可能是由于該酶磷酸化/去磷酸化影響了與檸檬酸合成、代謝以及轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)酶的酶活，進(jìn)而影響了甜橙果實(shí)中的TA含量。

4 結(jié)論

本研究采用SLAF-seq對(duì)240份甜橙種質(zhì)資源進(jìn)行基因分型，結(jié)合表型數(shù)據(jù)，對(duì)不同甜橙類(lèi)群進(jìn)行全基因組掃描獲得Fst值。最終在甜橙果臍的發(fā)生、單果重和可滴定酸等園藝性狀上篩選出了相關(guān)的基因（orange1. 1g044639m、orange1.1g023641m、orange1.1g023641m、orange1.1g046891m、orange1.1g011684m、orange1. 1g034502），這些基因可作為后期功能驗(yàn)證的候選基因，將為甜橙品種的定向改良提供重要依據(jù)。

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Mining Genes Related to Fruit Quality in Sweet Oranges Based on Specific Locus Amplified Fragment Sequencing

LI RenJing, SHEN WanXia, ZHAO WanTong, CHENG Li, LI Pei, JIANG Dong

Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712

【Objective】By using specific locus amplified fragment sequencing (SLAF-seq) sequencing method and combined with fixation indices analysis on different sweet orange populations, the candidate genes related with some excellent traits in sweet orange were mined, so as to provide some candidate genes for the further molecular breeding in sweet orange. 【Method】SLAF-seq technology was used to genotype 240 sweet orange germplasm resources, which represented extensive genetic diversity and from different geographical origins accessions preserved in the National Citrus Germplasm Repository in Beibei of Chongqing. The genomic SNP genotype data were obtained using the sweet orange genome as the reference, and the Fst and XP-CLR values between different subpopulations were calculated. 【Result】A total of 497.82 Mb-reads were obtained by sequencing 240 sweet oranges accessions with SLAF-seq technology, after the sequencing reads were mapped on to the reference genome by BWA software, and a total of 1 467 968 SNPs were identified by GATK and samtools. The Fst and XP-CLR indices were used to screen out candidate genes related to three traits, including fruit navel occurrence, fruit weight, and titratable acid content. Those genes adjacent to the selected SNPs were called. The result showed that orange1.1G044639m and orange1.1g023641m which annotated auxin efflux vector were related to the formation of navel in sweet orange. SNP in orange1.1G023641m which encoded E3 ubiquitin ligase had the highest Fst score between two different single-fruit weight population, and orange1.1G046891m might affect fruit weight by regulating carbohydrate formation; orange1.1G011684m encoding dihydrolipoamide transacetylase of PDH, and the SNP caused a nonsynonymous mutation in its CDS region, which might determine the citric acid content in fruit; orange1.1G034502m encodes Serine/threonine protein kinase, annotated as phosphorylation dephosphorylation function also related with the citric acid content in fruit. 【Conclusion】In this study, the Fst indices were used to screen six candidate genes associated with three fruit traits in sweet orange by using SNPs from SLAF-seq data. Finally, the relevant genes were screened out for three horticultural traits, including navel occurrence, fruit weight and titratable acid content, and the identified candidate genes should be giving further investigation to explore their regulation mechanism in these traits.

SLAF-seq; Fst; XP-CLR; sweet orange; fruit weight; titratable acids content; fruit navel occurrence

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.16.010

2022-12-17；

2023-02-13

國(guó)家科技重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2019YFD1001400）、柑橘種質(zhì)資源精準(zhǔn)鑒定項(xiàng)目（192111142）

李仁靜，E-mail：18046108857@163.com。通信作者江東，E-mail：jiangdong@cric.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）