楊夢(mèng)華 楊運(yùn)田 都廣艷 趙 玲 高 毅 王雙雙 李 蓓

牙周炎是牙齦炎癥波及深層的牙槽骨、牙周膜、牙骨質(zhì)，造成牙槽骨萎縮、牙齒逐漸松動(dòng)，甚至脫落，現(xiàn)已成為口腔科常見病、多發(fā)病和突出的口腔健康難題[1]。臨床上常規(guī)應(yīng)用的齦上潔治，齦下刮治等操作僅能阻止牙周炎癥的進(jìn)展，不能有效恢復(fù)牙周組織；而再生性治療，如引導(dǎo)性骨組織再生術(shù)，雖然能獲得一定程度上的軟硬組織的修復(fù)，但是效果有限[2]。J?rgen Slots 提出同時(shí)調(diào)節(jié)宿主和危險(xiǎn)因素的方法治療牙周炎，效果明顯提高[3]。中醫(yī)藥注重整體觀念，辨證施治，通過調(diào)節(jié)宿主，提高對(duì)外界危險(xiǎn)因素的抗性治療疾病[4]。

牙槽骨作為人體骨骼中代謝最活躍的組織，其代謝的穩(wěn)定依賴于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡。治療牙周炎的關(guān)鍵是抑制牙槽骨吸收或促使牙槽骨的再生，使成骨大于破骨。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，是牙周支持組織中的重要細(xì)胞，在骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化中起著核心作用。通過全身免疫調(diào)節(jié)增加成骨細(xì)胞的數(shù)量、增強(qiáng)成骨細(xì)胞的骨化能力，在牙周炎治療過程中尤為重要。我科應(yīng)用補(bǔ)腎活血固齒方治療腎虛血瘀型牙周炎，療效滿意[5]，該方劑是以“腎主骨”理論為基礎(chǔ)的中藥方劑，為了探究其作用機(jī)制，觀察其是否通過促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的骨化能力，促進(jìn)牙槽骨的再生而發(fā)揮作用。

筆者進(jìn)行了系列研究，前期研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)小鼠顱頂前成骨細(xì)胞（MC3T3-E1）增殖活性及細(xì)胞周期無影響[6]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該方劑可能通過增強(qiáng)MC3T3-E1 細(xì)胞中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性、提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞骨鈣素（osteocalcin,OCN）分泌水平,促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成促進(jìn)該細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化成熟[7～9]。該方劑可能通過促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞分泌血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor, PDGF）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP2）參與誘導(dǎo)成骨，通過鈣離子通道TRPV6 上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化[10～12]。

小鼠顱頂前成骨細(xì)胞（MC3T3-E1 細(xì)胞）是1981年由日本學(xué)者從新生的C57BL/6 小鼠顱骨中分離并體外培養(yǎng)出來的，該細(xì)胞在體外可連續(xù)培養(yǎng)并確保遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定，是研究體外成骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的最佳模型[13]。Ⅰ型膠原蛋白（Collagen TypeⅠ, ColⅠ）是成骨細(xì)胞合成的成纖維膠原，骨基質(zhì)蛋白，通過礦化促進(jìn)骨量的增加，是成骨細(xì)胞向基質(zhì)成熟方向分化的標(biāo)志，ColⅠ基因缺陷會(huì)引起骨發(fā)育障礙性疾病，影響骨礦化，不能形成骨結(jié)節(jié)，造成成骨不全[14]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞ColⅠmRNA 和MC3T3-E1 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步研究該方劑成骨的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

資料和方法

1. 試劑與儀器:α-MEM 培養(yǎng)基（美國GIBCO 公司），胰酶（Amresco），Triton x-100（Solarbio），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（invitrogen）PCR SuperMix 擴(kuò)增試劑盒（invitrogen），熒光定量PCR 試劑盒（TaKaRa）。HF240 二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司），BSC-1100ⅡA2生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），25 cm2（50 mL）細(xì)胞培養(yǎng)瓶（加拿大Jetbiofil 公司）,TE2000-U 熒光倒置顯微鏡（日本NiKon 公司），D-37520 高速離心機(jī)（Thermo ELECTRON CORPORATION），B40 低速離心機(jī)（安新縣白洋器材公司），HKA-A2450-230 精密電子天平（意大利BEL Engineering公司），H-7500透射電鏡（HITACHI 日立公司），DK-600A 電熱恒溫水箱（上海一恒科技有限公司），SHAL水浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市江南儀器廠），DDY-7C 型電泳儀（北京市六一儀器廠），7500 全自動(dòng)熒光定量PCR 儀（ABI,USA），小鼠顱頂前成骨細(xì)胞亞克隆14（MC3T3-E1 Subclonel4），購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫（ATCC CRL-2594）。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：16 只清潔級(jí)的健康雄性SD 大鼠，體重280～300 g，合格證編號(hào)1312020，購于河北醫(yī)科大學(xué)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件室溫保持在18℃～25℃，空氣流通，12 h 維持光照，動(dòng)物在籠中自由飲水?dāng)z食。

3. MC3T3-E1 細(xì)胞的培養(yǎng):倒置相差顯微鏡下觀察MC3T3-E1 細(xì)胞，細(xì)胞鋪滿瓶底。37℃超凈臺(tái)內(nèi)，倒掉原培養(yǎng)基，PBS 清洗2 遍，加入0.25%胰酶1 mL 后立即鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞胞體變圓、收縮，立即放回超凈臺(tái)內(nèi)加入2 mL α-MEM 培養(yǎng)基終止消化。用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞，使所有細(xì)胞脫離瓶壁，然后移至15 mL 的離心管中，1000 r/min 離心5 min 后倒掉上清液，加入6 mL αMEM+10%FBS 培養(yǎng)基，吸管輕輕吹打混勻。平均分裝至3 個(gè)培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)5～6 d后細(xì)胞逐漸貼壁，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞表面伸出較多突起，胞核清晰可見，細(xì)胞形態(tài)更加豐滿。每3 d 更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)約5～7 d 時(shí)細(xì)胞鋪滿瓶底約80%時(shí)，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4. 補(bǔ)腎活血固齒方藥液制備:補(bǔ)腎活血固齒方由淫羊藿15 g、補(bǔ)骨脂15 g、熟地黃10 g、當(dāng)歸10 g、丹參10 g、知母10 g、甘草3 g 組成。藥物中加入10倍量蒸餾水煎煮1.5 h 后過濾，加同等量蒸餾水再次煎煮1.5 h過濾，2次濾液混合煎煮濃縮至150 mL，裝袋備用。

5. 分組及血清制備：實(shí)驗(yàn)設(shè)含藥血清組（含有10%含藥血清）、無藥血清組（含有10%無藥血清）、胎牛血清組（含有10%胎牛血清）。16 只SD 大鼠隨機(jī)分到含藥血清組和無藥血清組，每組8 只。①含藥血清制備：按人與動(dòng)物之間體表面積折算的等效劑量比值給藥。補(bǔ)腎活血固齒方人的給藥量劑量為73 g/d，換算成大鼠給藥量為7.6 g/(kg.d)，大鼠每日灌胃2 次，灌胃前6 h 禁食，不禁水，連續(xù)灌胃7 d。第7 d兩次灌胃后2 h，再次灌胃，此時(shí)大鼠血清中藥物濃度達(dá)到最大。末次灌胃1 h 后，腹腔注射1.2%戊巴比妥麻醉大鼠，碘伏消毒，打開腹腔，游離腹主動(dòng)脈，套管針取血。將取出的血液立即輕輕注入離心管中，以免溶血，將離心管置于冰盒內(nèi)靜置，1 h后3000 r/min 高速離心機(jī)離心20 min。收集同組大鼠血液的上清液，混合均勻，避免個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。上清液經(jīng)56℃水浴滅活30 min，經(jīng)0.22 μm濾菌器過濾后分裝，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩＂跓o藥血清制備：將中藥換成等劑量的生理鹽水，灌胃及血清制備方法同上。③胎牛血清從廠家直接購買，超凈臺(tái)內(nèi)分裝后，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

6. 實(shí)驗(yàn)檢測：細(xì)胞傳代培養(yǎng)2 d 后，分別用3 組培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞換液，繼續(xù)培養(yǎng)。1 d、2 d、3 d，QRT-PCR 檢測補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞ColⅠmRNA 表達(dá)的影響。培養(yǎng)1 d、4 d、7 d、14 d 后透射電鏡觀察MC3T3-E1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。

7. QRT- PCR 法檢測補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞ColⅠmRNA 表達(dá)的影響：①細(xì)胞總RNA的提取：低溫離心機(jī)預(yù)冷20 min，每組各取一瓶細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)基，用PBS 清洗2 遍，培養(yǎng)瓶中加入1 mL Trizol，反復(fù)吹打混勻細(xì)胞，放入EP 管中，冰上靜置10 min，使細(xì)胞充分裂解，加入200 μL 氯仿，震蕩12 s，冰上靜置3 min，EP 管中可見分層，4℃，12000 r/min 離心15 min，吸取上層無色液相加入新的EP管中，新的EP管加入500 μL異丙醇，EP管顛倒混勻，冰上靜置10 min，4℃，12000 r/min離心10 min，RNA 沉于管底，為白色小塊，EP 管中加入75%乙醇1 mL，振蕩EP 管，將沉淀懸浮起來，靜置1 min，9000 r/min 離心10 min，晾干EP 管至沉淀變?yōu)榘咨该鳡?，加入去核酶?0 μL 溶解白色沉淀，吹打混勻，即為提取的總RNA，-20℃冰箱保存。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：分別取各樣品5 μg 總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所得溶液為cDNA。③擴(kuò)增反應(yīng)見表1。④設(shè)置反應(yīng)體系：在0.2 mL PCR8 聯(lián)管中加入以下試劑，每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔:SYBR Premix Ex Taq II（2×）12.5 μL，PCR Forward Primer（10μm）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μm）1 μL，cDNA 2 μL，RNase Free dH2O 補(bǔ)足至25μL，94℃5 min 變性；94℃15 s，59 ℃30 s,72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán);95℃15 s，60℃1 min,95 ℃30 s，60℃15 s。⑤相對(duì)mRNA 表達(dá)水平的計(jì)算：本實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)定量公式RQ=2-ΔΔCt法，計(jì)算各樣本中目的基因的相對(duì)定量值（RQ值），將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析。⑥統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料比較采用F檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 COLⅠ基因及內(nèi)參基因β-actin的引物序列

8.透射電鏡觀察MC3T3-E1 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變:0.25%的胰酶消化，1000 rpm，離心10 min后制成細(xì)胞混懸液，放入EP 管中再次1000 rpm，離心5 min，緩慢加入2.5%戊二醛1 mL，丙酮系列脫水，乙酸異戊脂置換，樹脂包埋，制備超薄切片，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。

結(jié)果

1.補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞Col ⅠmRNA的影響:1 d、2 d、3 d時(shí)，無藥血清組、胎牛血清組細(xì)胞的ColⅠmRNA 表達(dá)均無明顯差異（P＞0.05）；含藥血清組ColⅠmRNA 表達(dá)與其他兩組相比明顯增多（P＜0.05），結(jié)果見表2。

表2 MC3T3-E1 細(xì)胞ColⅠmRNA的表達(dá)

2.補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響:MC3T3-E1 細(xì)胞經(jīng)含藥血清培養(yǎng)1 d、4 d、7 d、14 d 時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長MC3T3-E1 細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器逐漸豐富；14 d 時(shí)MC3T3-E1 細(xì)胞呈成骨細(xì)胞樣表型，細(xì)胞表面突起較多，核呈卵圓形，較大，核膜曲折凹陷；線粒體嵴的密度較大，細(xì)胞合成功能旺盛；胞質(zhì)豐富，胞漿中糖元明顯可見；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯，網(wǎng)腔內(nèi)充滿低電子密度絮狀物。無藥血清組、胎牛血清組細(xì)胞的細(xì)胞器與含藥血清組細(xì)胞相比較不豐富，14 d 時(shí)MC3T3-E1 細(xì)胞表面突起較少（圖1）。

圖1 MC3T3-E1細(xì)胞在3種血清中培養(yǎng)的超微結(jié)構(gòu)

討論

經(jīng)過多年的臨床觀察，腎虛血瘀型牙周炎患者在所有牙周炎患者辨證分型中比例最高，占57.5%，在牙周基礎(chǔ)治療的基礎(chǔ)上應(yīng)用補(bǔ)腎活血固齒方治療該型牙周炎，既改善局部病損，又調(diào)節(jié)全身狀況，標(biāo)本兼治，療效滿意[5]。該方劑組成為淫羊藿15 g、補(bǔ)骨脂15 g、熟地黃10 g、當(dāng)歸10 g、丹參10 g、知母10 g、甘草3 g。為探究其作用機(jī)制，筆者應(yīng)用“血清藥理學(xué)”的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了研究，該方法是將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通過灌胃等方式服用藥物，藥量需換算為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的等效劑量，在一定時(shí)間后取動(dòng)物的含藥血清作為藥物源進(jìn)行藥理學(xué)觀察，研究其藥用機(jī)理,是一種半體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法[15]。在這個(gè)過程中中藥粗制劑和復(fù)雜的成分經(jīng)過消化已被實(shí)驗(yàn)動(dòng)物吸收、分布，再取含藥的血清進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)，比較接近體內(nèi)環(huán)境中藥物產(chǎn)生作用的真實(shí)過程，適用于復(fù)方中藥進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)及其作用機(jī)制的研究[15]。該方法可有效排除中藥制劑自身理化性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，排除了在體外實(shí)驗(yàn)過程中藥物與細(xì)胞直接作用時(shí)某些因素的干擾,客觀地模擬了藥物與機(jī)體相互作用過程,反映中藥在胃腸道內(nèi)的消化吸收、生物轉(zhuǎn)化、產(chǎn)生藥效的真實(shí)過程，是一種較為科學(xué)的中藥藥理學(xué)研究方法，用含藥血清進(jìn)行中藥藥效作用的觀察、研究，增加了中藥藥理研究的方法和手段，有利于從細(xì)胞水平上探討中藥的作用機(jī)理[16]。

成骨細(xì)胞在骨形成過程中要經(jīng)歷成骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟、細(xì)胞外基質(zhì)礦化和成骨細(xì)胞凋亡4 個(gè)階段。在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中成骨細(xì)胞表型發(fā)育與其體內(nèi)的發(fā)育分化較相似，都要經(jīng)歷細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟和基質(zhì)礦化3 個(gè)時(shí)期。膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白，是很多結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)蛋白，如皮膚、骨骼、關(guān)節(jié)和筋腱.膠原蛋白為動(dòng)物的皮膚、骨骼提供了細(xì)胞外框架，增強(qiáng)其強(qiáng)度和柔韌性，并參與組織的形成、成熟、細(xì)胞間信息的傳遞，因此在結(jié)締組織中起著至關(guān)重要的作用[17,18]。一些膠原蛋白是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)記物，能反映成骨細(xì)胞分化表型特征，其中ColⅠ是最普遍的膠原形式，由成骨細(xì)胞合成分泌，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分、羥基磷灰石沉積反應(yīng)的依托和骨架，是成骨細(xì)胞分化的中期指標(biāo)，其蛋白表達(dá)量的高低反應(yīng)成骨細(xì)胞骨形成能力的強(qiáng)弱[19～22]。ColⅠ可以控制骨礦物晶體的形成和發(fā)育，這是由于ColⅠ同存在于骨中的礦化膠原纖維形成鍵進(jìn)一步結(jié)合，成為細(xì)胞附著以及鈣鹽沉著的支架，從而增強(qiáng)骨的韌性[23]，它的合成分泌是骨組織形成的先決條件，加速其合成分泌起到促進(jìn)骨組織礦化的作用，是成骨細(xì)胞向基質(zhì)成熟方向分化的標(biāo)志[14]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用QRT-PCR 技術(shù)通過檢測ColⅠmRNA 表達(dá)量的變化，反應(yīng)成骨細(xì)胞骨形成能力的強(qiáng)弱[24]。

細(xì)胞器幫助細(xì)胞行使功能，可以反應(yīng)當(dāng)下細(xì)胞的功能狀態(tài)。細(xì)胞核是真核細(xì)胞內(nèi)最大、最重要的結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞遺傳與代謝的調(diào)控中心，是遺傳信息的儲(chǔ)存、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的主要場所，在一定程度上控制著細(xì)胞的代謝、生長、分化和繁殖等活動(dòng)，任何有核細(xì)胞丟失核后便失去生活機(jī)能，并趨于死亡。核膜作為細(xì)胞內(nèi)的界膜，調(diào)節(jié)細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間的物質(zhì)交換。核膜面積增加代表細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間信息交換增加[25～27]。炎癥、氧化應(yīng)激、缺氧等均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能障礙，使細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能紊亂，產(chǎn)生亞細(xì)胞器病理狀態(tài)，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，其表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)折疊異常、未折疊蛋白質(zhì)積累[28]。線粒體增多或線粒體嵴密度增大表明所需能量較多，細(xì)胞處于活躍狀態(tài)。線粒體經(jīng)過不斷的融合和裂變可維持其形態(tài)及生理功能[29]。高爾基體作為真核細(xì)胞中一種重要的細(xì)胞器，參與多種重要的蛋白質(zhì)，包括與自噬和成骨密切相關(guān)的多種蛋白質(zhì)的合成、加工、分類選擇、運(yùn)輸[30]。

本次研究結(jié)果顯示,于含藥血清培養(yǎng)的MC3T3-E1 細(xì)胞隨著時(shí)間的延長細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器逐漸豐富，14 d 時(shí)MC3T3-E1 細(xì)胞呈成骨細(xì)胞樣表型；無藥血清組、胎牛血清組細(xì)胞的細(xì)胞器與含藥血清組細(xì)胞相比較不豐富，14 d 時(shí)MC3T3-E1 細(xì)胞表面突起較少。1 d、2 d、3 d時(shí)，無藥血清組、胎牛血清組細(xì)胞的ColⅠmRNA 表達(dá)均無明顯差異；含藥血清組細(xì)胞ColⅠmRNA 表達(dá)與其他2組相比明顯增多。表明補(bǔ)腎活血固齒方可能通過增加ColⅠmRNA 的表達(dá)，促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞向成骨細(xì)胞樣表型發(fā)展，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟，而促進(jìn)骨的形成，對(duì)牙周炎的治療發(fā)揮作用。結(jié)合前期研究，該方劑可能通過增強(qiáng)MC3T3-E1 細(xì)胞中ALP 活性、提高OCN、PDGF、BMP2分泌水平,提高ColⅠmRNA 表達(dá)，促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成等機(jī)制，促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化成熟，促進(jìn)骨的形成[5～12]。

筆者前期研究均是在無菌狀態(tài)下觀察補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞成骨機(jī)制的影響，而牙周炎是由菌斑微生物引起的牙周支持組織的慢性感染性疾病，當(dāng)牙周組織發(fā)生炎癥時(shí)，活化的巨噬細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)，如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）和 腫 瘤 壞 死 因 子（tumor necrosisfactor，TNF）等[31]，細(xì)胞因子在牙周組織炎癥反應(yīng)中起著重要作用。筆者會(huì)在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中探討在炎癥病理微環(huán)境，如用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis）等刺激模擬炎癥微環(huán)境[32～34]，觀察補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的各種成骨分化蛋白的影響，進(jìn)一步探討該方劑的成骨機(jī)制。