黃子葵 李斐 陳躍洲 劉佳銘 劉嘉俊 藍(lán)素珍

摘要：目的 基于系統(tǒng)生物信息學(xué)分析鼻咽癌樣本基因芯片數(shù)據(jù)，篩選鼻咽癌的潛在預(yù)測(cè)基因，并對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。方法 通過(guò)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)篩選鼻咽癌數(shù)據(jù)集，通過(guò)limma包進(jìn)行差異分析，加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)包進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，繪制韋恩圖尋找共同基因，進(jìn)行基因本體富集分析及京都基因與基因組百科全書(shū)通路分析。通過(guò)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)、LASSO回歸及非參數(shù)檢驗(yàn)，進(jìn)一步挖掘鼻咽癌的生物標(biāo)志物。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot對(duì)鼻咽癌關(guān)鍵預(yù)測(cè)基因的mRNA及蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證結(jié)果。結(jié)果 GSE12452數(shù)據(jù)集上調(diào)基因共622個(gè)，下調(diào)基因共351個(gè)，通過(guò)limma分析及加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析并交集最終獲取116個(gè)交集基因，通過(guò)富集分析，生物過(guò)程主要包括細(xì)胞增殖及調(diào)控、細(xì)胞間黏附的調(diào)節(jié)等，富集于Rap1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等通路，經(jīng)過(guò)篩選得到血管生成素2（ANGPT2）、雙氧化酶2（DUOX2）、人組織因子Ⅲ（F3）、白細(xì)胞介素-15（IL-15）、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2、視黃酸受體相關(guān)孤兒受體B（RORB）共6個(gè)關(guān)鍵基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)證明ANGPT2、IL-15的mRNA和蛋白在鼻咽癌細(xì)胞中高表達(dá)，DUOX2、F3、RORB的mRNA和蛋白低表達(dá)。結(jié)論 ANGPT2、DUOX2、F3、IL-15、RORB為鼻咽癌的潛在預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，其機(jī)制可能與Rap1、Ras、腫瘤壞死因子等信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：鼻咽癌；生物信息學(xué)分析；基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)；加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析；生物標(biāo)志物；差異表達(dá)基因；關(guān)鍵基因

中圖分類號(hào)： R739.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1000-503X（2023）04-0597-11

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15503

Key Prediction Genes of Nasopharyngeal Carcinoma：Screening Based on

Systematic Bioinformatics and Validation by Cell Experiments

HUANG Zikui¹，LI Fei¹，CHEN Yuezhou²，LIU Jiaming³，LIU Jiajun⁴，LAN Suzhen⁵

¹Department of Traditional Chinese Medicine，Ganzhou Peoples Hospital，Ganzhou，Jiangxi 341000，China

²Shenzhen Clinical School of Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Shenzhen，Guangdong 518116，China

³The Second Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China

⁴Clinical Medical College of Acupuncture Moxibustion and Rehabilitation，Guangzhou University of

Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China

⁵Department of Oncology，Ganzhou Peoples Hospital，Ganzhou，Jiangxi 341000，China

Corresponding author：LAN Suzhen Tel：0797-5889396，E-mail：l18170115016@163.com

ABSTRACT：Objective To screen out the potential prediction genes for nasopharyngeal carcinoma（NPC）from the gene microarray data of NPC samples and then verify the genes by cell experiments.Methods The NPC dataset was downloaded from Gene Expression Omnibus，and limma package was employed to screen out the differentially expressed genes.Weighted correlation network analysis package was used for weighted gene co-expression network analysis，and Venn diagram was drawn to find the common genes.The gene ontology annotation and Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway enrichment were then performed for the common genes.The biomarkers for NPC were further explored by protein-protein interaction network，LASSO regression，and non-parametric tests.Real-time quantitative PCR and Western blotting were employed to determine the mRNA and protein levels of key predictors of NPC，so as to verify the screening results.Results There were 622 up-regulated genes and 351 down-regulated genes in the GSE12452 dataset.A total of 116 common genes were obtained by limma analysis and weighted gene co-expression network analysis.The common genes were mainly involved in the biological processes of cell proliferation and regulation and regulation of intercellular adhesion.They were mainly enriched in Rap1，Ras，and tumor necrosis factor signaling pathways.Six key genes were screened out，encoding angiopoietin-2（ANGPT2），dual oxidase 2（DUOX2），coagulation factor Ⅲ（F3），interleukin-15（IL-15），lipocalin-2，and retinoic acid receptor-related orphan receptor B（RORB）.Real-time quantitative PCR and Western blotting showed that the NPC cells had up-regulated mRNA and protein levels of ANGPT2 and IL-15 and down-regulated mRNA and protein levels of DUOX2，F(xiàn)3，and RORB，which was consistent with the results predicted by bioinformatics.Conclusion ANGPT2，DUOX2，F(xiàn)3，IL-15 and RORB are potential predictive molecular markers and therapeutic targets for NPC，which may be involved in Rap1，Ras，tumor necrosis factor and other signaling pathways.

Key words：nasopharyngeal carcinoma；bioinformatics analysis；Gene Expression Omnibus；weighted gene co-expression network analysis；biomarkers；differentially expressed gene；key gene

Acta Acad Med Sin，2023，45（4）：597-607

鼻咽癌起源于鼻咽黏膜，是一種上皮惡性腫瘤，其在全球范圍內(nèi)具有明顯的地理分布特點(diǎn)，其中81%的新發(fā)病例發(fā)生在亞洲，而非洲只有9%^［1］。關(guān)于新診斷患者的數(shù)量，2012年排名前5位的國(guó)家包括中國(guó)、印度尼西亞、越南、印度和馬來(lái)西亞，占全球鼻咽癌患者的67%^［1］。盡管鼻咽癌的治療得到了加強(qiáng)，但發(fā)病部位隱匿、診斷晚、預(yù)后差和轉(zhuǎn)移影響生存率^［2］，死亡率仍居高不下^［3］。放射治療和綜合化療策略的進(jìn)步提高了原發(fā)性鼻咽癌患者的預(yù)后^［4-5］。然而，鼻咽癌具有高惡性復(fù)發(fā)率，局部組織浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移成為放療失敗的主要原因^［6］。有研究通過(guò)分析鼻咽癌ceRNA網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展可能與核仁紡錘體相關(guān)蛋白1等基因有關(guān)，富集于絲裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路和凋亡通路^［7］。Zou等^［8］研究顯示，Xk1p2靶蛋白、極光激酶A、細(xì)胞分裂周期6、有絲分裂停滯缺陷2樣1、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα與鼻咽癌發(fā)病機(jī)制有關(guān)，且細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1與核輸出蛋白1可能是EB病毒致鼻咽癌的重要原因。盡管上述研究均針對(duì)鼻咽癌，但其未結(jié)合LASSO回歸進(jìn)行分析，且缺乏分子生物學(xué)水平的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。目前，鼻咽癌生物學(xué)標(biāo)志物網(wǎng)絡(luò)尚不完善，因此，進(jìn)一步挖掘鼻咽癌的相關(guān)標(biāo)志物并對(duì)其做出實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證非常重要。

隨著人們對(duì)數(shù)據(jù)挖掘和生物信息學(xué)的興趣與日俱增，基因表達(dá)綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)越來(lái)越受到研究人員的認(rèn)可，一些腫瘤相關(guān)基因，包括鼻咽癌相關(guān)基因，正在被發(fā)現(xiàn)^［9-10］。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）通過(guò)利用聚類原理創(chuàng)建基因與疾病表型相關(guān)的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，篩選出與臨床信息相關(guān)的基因模塊，并發(fā)現(xiàn)其中的樞紐基因，為探討疾病的分子機(jī)制提供思路^［11］。LASSO回歸正則化方法在變量篩選和模型穩(wěn)定性上具有良好表型，自提出后在醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用于預(yù)測(cè)模型構(gòu)造^［12］。通過(guò)二者聯(lián)用，具有更佳篩選高度相關(guān)的預(yù)后靶點(diǎn)優(yōu)勢(shì)。甘軻等^［13］結(jié)合生物信息學(xué)方法及臨床標(biāo)本驗(yàn)證，指出驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員11和核糖核苷酸還原酶調(diào)節(jié)亞基M2與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展預(yù)后密切相關(guān)。修德健等^［14］通過(guò)WGCNA分析TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)有絲分裂停滯缺陷2樣1與宮頸癌患者的預(yù)后及免疫浸潤(rùn)有關(guān)。本研究根據(jù)從GEO獲得的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選出差異表達(dá)基因，運(yùn)用WGCNA、LASSO回歸和非參數(shù)檢驗(yàn)，篩選出與鼻咽癌高度相關(guān)的靶點(diǎn)，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）與Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，為后續(xù)深入研究提供證據(jù)支持。

資料和方法

生物信息學(xué)分析

數(shù)據(jù)的獲取與差異表達(dá)基因處理：通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）GEO DataSets檢索關(guān)鍵詞nasopharyngeal carcinoma，并限制種屬Homosapiens和研究類型Expression profiling by array，檢索共得到61項(xiàng)。選擇未經(jīng)治療過(guò)的鼻咽癌組織樣本，且包含鼻咽癌患者與無(wú)惡性腫瘤患者的數(shù)據(jù)集納入，得到GSE12452，該數(shù)據(jù)集基于GPL570平臺(tái)，包括31例Epstein-Barr病毒陽(yáng)性未分化鼻咽癌患者與10例無(wú)惡性腫瘤患者的總RNA樣本^［15］。利用R語(yǔ)言limma包對(duì)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以log2FC≥1且P＜0.05的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因（differentially expressed genes，DEG），從而得到鼻咽癌組織與正常組織之間的DEG，進(jìn)一步繪制差異表達(dá)基因熱圖與火山圖。

加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析：WGCNA通過(guò)篩選軟閾值β建立無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)，計(jì)算模塊特征與臨床特征之間的相關(guān)性，以此識(shí)別高度相關(guān)的共表達(dá)基因模塊，并進(jìn)一步挖掘模塊內(nèi)的樞紐基因，這種方法有利于識(shí)別候選生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。本研究采用全基因一步法構(gòu)建無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)，選取GSE12452中與患病情況密切相關(guān)的模塊，提取模塊基因構(gòu)建韋恩圖，獲取與差異表達(dá)基因的交集。

富集分析：將模塊基因與差異表達(dá)基因所構(gòu)建韋恩圖篩選得到的共同基因?qū)隿lusterProfiler包進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）富集分析及京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，其中GO分析包括生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組分，根據(jù)排名進(jìn)行可視化。

蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)及LASSO回歸：蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)由蛋白通過(guò)彼此間的相互作用構(gòu)成，其參與生物信號(hào)的傳遞、能量轉(zhuǎn)化、物質(zhì)代謝、代謝基因表達(dá)的調(diào)節(jié)等重要生命過(guò)程。LASSO算法是一種通過(guò)構(gòu)造懲罰函數(shù)以壓縮部分低權(quán)重回歸系數(shù)進(jìn)而明確兩變量之間的關(guān)聯(lián)程度的回歸方法^［16］，有助于從高維變量中篩選具有代表性的變量。本研究通過(guò)Cytospace 3.9.0的CytoHubba插件加載PPI網(wǎng)絡(luò)，識(shí)別網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白，并通過(guò)LASSO回歸進(jìn)一步篩選與患病高度相關(guān)的hub基因，為后續(xù)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的挖掘提供理論依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)方法

材料與試劑：正常人永生化鼻咽上皮細(xì)胞（NP69）、人高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系（5-8F）購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，胎牛血清、杜氏改良培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Trizol試劑盒、RT-qPCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，Western blot儀器購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，兔抗血管生成素2（angiopoietin-2，ANGPT2）、雙氧化酶2（dual oxidase 2，DUOX2）、人組織因子Ⅲ（coagulation factor Ⅲ，F(xiàn)3）、白細(xì)胞介素-15（interleukin-15，IL-15）、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2（lipocalin-2，LCN2）、視黃酸受體相關(guān)孤兒受體B（related orphan receptor B，RORB）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和山羊抗兔二抗IgG 重鏈和輕鏈均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

細(xì)胞培養(yǎng)：將NP69、5-8F細(xì)胞在含10% 胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的杜氏改良培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并放置于37 ℃、含5%CO₂的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞覆蓋至80%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

RT-qPCR：用Trizol試劑盒提取NP69、5-8F細(xì)胞的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而得到反轉(zhuǎn)錄后的cDNA，接著以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因作為內(nèi)參，進(jìn)行目的基因的RT-qPCR檢測(cè)，表1為引物序列。該方法的循環(huán)條件為：首先75 ℃ 2 min，預(yù)變性，接著進(jìn)入以下循環(huán)：90 ℃ 5 min，變性；60 ℃ 60 s，退火；72 ℃ 30 s，延伸；共40個(gè)循環(huán)。采用2^-ΔΔCt法計(jì)算ANGPT2、DUOX2、F3、IL-15、LCN2、RORB基因mRNA的表達(dá)量。

Western blot：NP69、5-8F細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液，于4 ℃ 10 000 r/min（r=60 mm）離心10 min，離心后收集蛋白上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，并用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜；TBST緩沖液洗膜后，加入二抗室溫孵育2 h，再次TBST緩沖液洗膜，最后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑曝光并暗室顯影。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用R 4.1.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，使用Graphpad Prism 9.0進(jìn)行繪圖。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料選用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

鼻咽癌差異表達(dá)基因 將下載數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（圖1），通過(guò)limma包差異處理后獲得973個(gè)鼻咽癌和正常組織的DEG，這些基因均符合log2FC≥1且P＜0.05，其中，上調(diào)基因共622個(gè)、下調(diào)基因共351個(gè)（圖2）。

加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 采用WGCNA包讀取GSE12452數(shù)據(jù)，獲取與臨床信息關(guān)聯(lián)的基因模塊。計(jì)算各基因模塊的相關(guān)系數(shù)，通過(guò)選擇軟閾值β=7構(gòu)建無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置模塊尺寸最小30個(gè)基因，采用皮爾遜相關(guān)性分析，對(duì)各基因模塊與臨床信息的相關(guān)系數(shù)及P值進(jìn)行計(jì)算，此時(shí)網(wǎng)絡(luò)具有良好的相關(guān)性及節(jié)點(diǎn)間連接度（圖3A），并通過(guò)scaleFreePlot進(jìn)行驗(yàn)證，計(jì)算可得R2=0.86＞0.80，斜率=-1.71＜0，符合無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)分布（圖3B）。利用熱圖呈現(xiàn)模塊與臨床信息的相關(guān)性（圖3C），提取相關(guān)系數(shù)最高的模塊MEyellow（r=-0.87，P＜0.001）為研究對(duì)象，提取模塊基因進(jìn)一步分析。

韋恩圖 利用在線韋恩圖制作平臺(tái)（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將WGCNA模塊基因和差異表達(dá)基因進(jìn)行交集分析，共獲取116個(gè)交集基因（圖4）。

富集分析 將116個(gè)交集基因用于GO富集及KEGG通路分析，使用clusterProfiler包將基因編號(hào)轉(zhuǎn)化為ENTREZID，選擇OrgDb為org.Hs.eg.db，設(shè)定P閾值0.05，進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，并繪制氣泡圖。結(jié)果顯示生物過(guò)程細(xì)胞增殖及調(diào)控、細(xì)胞間黏附的調(diào)節(jié)、T細(xì)胞活化調(diào)節(jié)等靶點(diǎn)富集較集中（圖5A）；細(xì)胞組分胞外區(qū)、內(nèi)膜系統(tǒng)、細(xì)胞表面等靶點(diǎn)富集較集中（圖5B）；分子功能信號(hào)受體、氧化還原酶活性、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸結(jié)合等靶點(diǎn)富集較集中（圖5C）。富集通路包括Rap1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路等（圖5D）。

蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)與LASSO回歸 通過(guò)STRING（https：//cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入交集靶點(diǎn)，設(shè)置為默認(rèn)，網(wǎng)絡(luò)共包括115個(gè)節(jié)點(diǎn)，46條邊（圖6A）；將網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件，應(yīng)用CytoHubba插件，通過(guò)馬修斯相關(guān)系數(shù)算法分析得到前10靶點(diǎn)，包括LCN2、F3、血管細(xì)胞黏附因子1、ANGPT2、DNA結(jié)合抑制因子1、IL-15、晝夜節(jié)律蛋白2、RORB、DUOX2及基本螺旋-環(huán)-螺旋家族成員e40（basic helix-loop-helix family member e40，BHLHE40）（圖6B）。將上述靶點(diǎn)作為觀察變量構(gòu)建LASSO回歸模型，對(duì)應(yīng)的系數(shù)值不為0的觀察量為選入，篩選出7個(gè)鼻咽癌診斷相關(guān)基因，包括ANGPT2、BHLHE40、DUOX2、F3、IL-15、LCN2、RORB（圖7）。

基因表達(dá)對(duì)比 通過(guò)boxplot可視化ANGPT2、BHLHE40、DUOX2、F3、IL-15、LCN2、RORB在GSE12452數(shù)據(jù)集的表達(dá)情況，并通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示除BHLHE40（P=0.053）外，ANGPT2、DUOX2、F3、IL-15、LCN2、RORB在鼻咽癌組與正常對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.001）（圖8）。

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果 使用RT-qPCR對(duì)鼻咽癌預(yù)測(cè)基因的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，鼻咽癌組細(xì)胞ANGPT2（P=0.002）和IL-15（P=0.005）的mRNA表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組鼻咽上皮細(xì)胞；而DUOX2（P=0.001）、F3（P＜0.001）、LCN2（P=0.039）、RORB（P=0.024）的mRNA表達(dá)均顯著低于正常對(duì)照組鼻咽上皮細(xì)胞（圖9）。

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 使用Western blot對(duì)鼻咽癌預(yù)測(cè)基因的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)鼻咽癌細(xì)胞相關(guān)基因蛋白表達(dá)的變化。與正常對(duì)照組相比，鼻咽癌組ANGPT2和IL-15蛋白表達(dá)增高，DUOX2、F3、RORB蛋白表達(dá)降低（圖10）。

討論

鼻咽癌在我國(guó)尤其南部地區(qū)是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，為深入了解鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制及挖掘其預(yù)測(cè)基因，本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲得GSE12452數(shù)據(jù)集，將鼻咽癌樣本與正常組織樣本進(jìn)行比較，共發(fā)現(xiàn)973個(gè)差異表達(dá)基因。通過(guò)WGCNA獲取MEyellow模塊與臨床發(fā)病信息高度相關(guān)，從中獲取421個(gè)基因；二者交集基因共116個(gè)，通過(guò)分析其富集情況，有助于探討其發(fā)病機(jī)制。通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)、CytoHubba、LASSO回歸和統(tǒng)計(jì)學(xué)非參數(shù)檢驗(yàn)，挖掘與鼻咽癌發(fā)病高度相關(guān)的預(yù)測(cè)基因，并通過(guò)RT-qPCR與Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這些基因的表達(dá)。

子G蛋白R(shí)as超家族，在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞黏附等各種生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用^［17］。越來(lái)越多的研究揭示了Rap1在前列腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用，Rap1通過(guò)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/p38、Notch信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移^［18］；而Xiang等^［19］、Zhang等^［20］通過(guò)下調(diào)Rap的表達(dá)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、黏附和侵襲，發(fā)揮抑癌的作用^［17］，然而，目前關(guān)于Rap1對(duì)鼻咽癌的影響研究有限，仍需進(jìn)一步研究。Ras作為最常見(jiàn)的癌基因之一，與Rap1具有高度的同源性，且在影響下游通路及受體的結(jié)構(gòu)域上具有高度相關(guān)性，Ras與其介導(dǎo)的Ras-Raf活化激活下游的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，后者進(jìn)入細(xì)胞核后活化許多轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細(xì)胞增殖、生存、遷移和凋亡^［21-23］，研究顯示其與頭頸部、肝、胰、結(jié)直腸等腫瘤高度相關(guān)，與單純鼻咽癌5-8F細(xì)胞相比，西妥昔單抗干預(yù)組Ras蛋白顯著升高（P＜0.001），且細(xì)胞表現(xiàn)出較慢的生長(zhǎng)速度和較低的生長(zhǎng)曲線，提示Ras通路不僅影響鼻咽癌細(xì)胞增殖^［24］，且可作為鼻咽癌治療靶點(diǎn)之一。TNF-α通路激活刺激核因子κB和絲裂原活化蛋白激酶活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞炎癥反應(yīng)，對(duì)體內(nèi)外多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用^［25］，促進(jìn)腫瘤的殺傷作用，與鼻咽癌的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)^［26-27］。宋啟斌等^［28］研究顯示，TNF-α通過(guò)上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞中凋亡抑制因子的表達(dá)而使腫瘤細(xì)胞抗凋亡。

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入交集靶點(diǎn)，其結(jié)果以Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并利用boxplot可視化篩選的基因行t檢驗(yàn)，最終得到鼻咽癌的關(guān)鍵預(yù)測(cè)基因ANGPT2、DUOX2、F3、IL-15、LCN2、RORB。其中ANGPT2是血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)，在肺癌組織中高度表達(dá)，且KM曲線證實(shí)，高水平的ANGPT2與肺癌低生存率相關(guān)^［29］，進(jìn)一步研究顯示，ANGPT2經(jīng)上調(diào)后誘導(dǎo)結(jié)腸癌、黑色素瘤轉(zhuǎn)移^［30-31］，而抑制ANGPT2表達(dá)發(fā)揮抗乳腺癌、黑色瘤免疫作用^［32］，然而，其調(diào)節(jié)鼻咽癌作用仍未有研究報(bào)道，可作為未來(lái)深入研究方向。DUOX2是甲狀腺激素碘有機(jī)過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)蛋白，在食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等高度表達(dá)^［33］，并促進(jìn)胰腺癌、結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移^［34］，是永久性先天性甲狀腺功能減退癥最常見(jiàn)的突變基因^［35］。F3參與許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)、細(xì)胞存活、基因和蛋白表達(dá)、增殖等機(jī)制^［36］，其表達(dá)受TNF-α等信號(hào)通路調(diào)控^［37］，是多種細(xì)胞的表面受體，通過(guò)抑制F3表達(dá)，可顯著降低卵巢癌細(xì)胞增長(zhǎng)率和Ki-67水平，減少侵襲細(xì)胞數(shù)量^［38］。IL-15是一種細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)先天性免疫反應(yīng)及適應(yīng)性免疫反應(yīng)的功能^［39］，研究表明IL-15高表達(dá)的胸腺上皮腫瘤患者總生存期及無(wú)進(jìn)展生存期顯著縮短，IL-15可參與胸腺上皮腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，作為患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素^［40］。LCN2是一種分泌型糖蛋白，與多種生理功能有關(guān)，包括調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、維持鐵穩(wěn)態(tài)等^［41］，作為一種高度保守的分泌型脂肪因子，在卵巢癌、甲狀腺癌、肺癌等腫瘤中高表達(dá)；LCN2的低表達(dá)與具核梭桿菌促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力有關(guān)^［42］，是許多癌癥治療的潛在治療靶點(diǎn)。RORB是一種蛋白質(zhì)編碼蛋白，研究顯示其與晝夜節(jié)律相關(guān)基因表達(dá)調(diào)節(jié)有關(guān)，通過(guò)納入49 402例受試者病例對(duì)照研究，RORB等位基因攜帶者增加了乳腺癌發(fā)生率（OR=1.87）^［43］，另有研究顯示RORB可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和分化等影響腫瘤形成，其胃癌組織中為低表達(dá)^［44］。然而，盡管上述基因已有研究報(bào)道在多種惡性腫瘤均發(fā)揮重要作用，但其對(duì)鼻咽癌的影響鮮見(jiàn)報(bào)道，可作為未來(lái)研究方向。

綜上，本研究通過(guò)對(duì)GSE12452數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析及加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，挖掘既有臨床相關(guān)性又具有表達(dá)差異性的交集基因。通過(guò)富集分析，交集基因主要富集于細(xì)胞增殖、細(xì)胞間黏附的調(diào)節(jié)等生物功能，與Chen等^［45］報(bào)道的鼻咽癌“高轉(zhuǎn)移潛力”不謀而合，且主要富集于Ras、Rap1、TNF-α通路。為進(jìn)一步挖掘鼻咽癌的潛在生物標(biāo)志物，本研究通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)、LASSO回歸及統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析，篩選得到ANGPT2、DUOX2、F3、IL-15、LCN2、RORB共6個(gè)基因。并通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證了ANGPT2、IL-15的mRNA在鼻咽癌細(xì)胞中高表達(dá)，DUOX2、F3、LCN2、RORB的mRNA為低表達(dá)；通過(guò)Western blot驗(yàn)證了ANGPT2、IL-15表達(dá)的蛋白在鼻咽癌細(xì)胞中高表達(dá)，DUOX2、F3、RORB表達(dá)的蛋白為低表達(dá)，表明這5個(gè)基因有望成為鼻咽癌的診斷分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，為鼻咽癌的診斷與治療提供新的思路與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-01-19）