王 瑾,王永剛,朵建文,冷非凡,陳吉祥,孫尚琛*

(1.蘭州資源環(huán)境職業(yè)技術(shù)大學(xué),甘肅蘭州 730030;2.蘭州理工大學(xué),甘肅蘭州 730050)

目前,由于快速發(fā)展的工業(yè)活動(dòng)、礦山開(kāi)采、高價(jià)態(tài)金屬?gòu)U棄物傾倒、化肥的過(guò)度使用等,重金屬在環(huán)境中的遷移加劇、遷移速度大大加快,越來(lái)越多的含金屬殘留物被排放到地表進(jìn)入土壤系統(tǒng)和地下水,并通過(guò)食物鏈富集在人體中,進(jìn)而對(duì)人體和生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重危害[1-2]。當(dāng)重金屬在土壤中的積累量超過(guò)土壤的自凈能力后會(huì)改變陸地生態(tài)系統(tǒng)中棲息動(dòng)植物的種類、分布及數(shù)量,影響植物根系微生物的群落結(jié)構(gòu)和酶活性,阻礙植物的光合作用、呼吸作用等[3]。當(dāng)過(guò)量的重金屬進(jìn)入水生系統(tǒng)后,會(huì)嚴(yán)重阻礙水生動(dòng)物DNA的合成,導(dǎo)致胚胎畸變、影響性別和身長(zhǎng)等[2]。而水生藻類一旦積累了過(guò)量的重金屬會(huì)導(dǎo)致其代謝和生理功能紊亂,光合作用被抑制,更有甚者導(dǎo)致藻類死亡,改變天然環(huán)境中藻類的數(shù)量和分布[3]。另外,進(jìn)入人體的重金屬借助體內(nèi)某些有機(jī)成分可結(jié)合成金屬絡(luò)合物或螯合物富集在人體內(nèi),當(dāng)積累量超過(guò)人體新陳代謝最大限值后,會(huì)嚴(yán)重?fù)p害人體的呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等,甚至造成人體癌變和死亡[3-5]。

基于過(guò)量重金屬對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的諸多危害,重金屬已被公認(rèn)為是對(duì)自然動(dòng)植物群造成嚴(yán)重危害的最持久和最復(fù)雜的污染因子。目前,對(duì)于重金屬污染環(huán)境的防治與治理,已發(fā)展起來(lái)的方法有包括離子交換法、吸附法和膜分離法在內(nèi)的物理法,沉淀法、氧化還原法等在內(nèi)的化學(xué)法和依賴于微生物的生物法。因微生物具有可培養(yǎng)性強(qiáng)、環(huán)境友好、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn),微生物修復(fù)策略被認(rèn)為是在重金屬污染物治理方面最有前景的方式之一。一方面,微生物對(duì)某些特定的金屬具有強(qiáng)選擇性,且因其體積小的特點(diǎn)可以為重金屬的高效結(jié)合提供大的比表面積[5]。另一方面,微生物吸附是一個(gè)獨(dú)立和可逆的過(guò)程,存活的和死亡的微生物都可以用作金屬吸收的生物吸附劑[6]。此外,微生物還可以通過(guò)離子交換、氧化還原、電化學(xué)處理、化學(xué)沉淀等方式對(duì)重金屬進(jìn)行固定和解毒[1]。所有這些改變重金屬遷移性和毒性的轉(zhuǎn)變都具有巨大的生物地球化學(xué)意義并具有生物修復(fù)潛力。另外,在重金屬脅迫下,微生物的聚集和生物膜的形成使微生物能夠維持更長(zhǎng)的時(shí)間,進(jìn)一步表明微生物修復(fù)機(jī)制比傳統(tǒng)方法更經(jīng)濟(jì)和有效。

“微生物-重金屬”是一個(gè)較為復(fù)雜的生物學(xué)命題,該研究從重金屬對(duì)微生物的毒性作用、微生物對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)等多方面進(jìn)行綜述,以期為“微生物-重金屬”的相互作用提供更為全面的理解,為生物修復(fù)策略的進(jìn)一步應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 重金屬對(duì)微生物的影響

重金屬通常對(duì)微生物產(chǎn)生雙向作用,如某些低濃度的重金屬在微生物蛋白質(zhì)的合成、酶活性構(gòu)型的維系、氧化還原等過(guò)程中發(fā)揮作用[7]。但當(dāng)重金屬的濃度超過(guò)微生物生長(zhǎng)代謝所需的閾值后會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生不利影響。

從宏觀角度來(lái)講,重金屬會(huì)影響微生物的群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性,這主要取決于重金屬和微生物的類型。張瀚丹等[8]研究發(fā)現(xiàn),Cr和Ni的濃度與放線菌門(Actinobacteria)和奇古菌門(Thaumarchaeota)的豐度呈負(fù)相關(guān),但與擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度呈正相關(guān),Cd、Pb和Hg的濃度與芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)呈正相關(guān),但總體上重金屬會(huì)導(dǎo)致微生物生物多樣性的下降。何一凡等[9]的研究表明,在受Cr、Pb和Zn污染的土壤中,硝化菌(Nitrobacterium)、擬桿菌(Bacteroidetes)和疣微菌(Verrucomicrobia)的豐度與重金屬濃度呈負(fù)相關(guān),但綠彎菌(Chloroflexi)的生長(zhǎng)卻受顯著的促進(jìn)。另外,受低濃度的Cd、Cu、Zn、Pb復(fù)合污染的土壤中,細(xì)菌、真菌和放線菌的生物量均較污染前顯著增加,表明低濃度的重金屬會(huì)刺激微生物群落結(jié)構(gòu)的增加。但隨著重金屬濃度的增加,其對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響由刺激變?yōu)槎竞ψ饔?相應(yīng)微生物的群落結(jié)構(gòu)相應(yīng)降低。

從微觀角度來(lái)講,高濃度的重金屬離子會(huì)破壞微生物細(xì)胞壁的完整性、干擾DNA和RNA的合成、誘導(dǎo)部分酶的構(gòu)型發(fā)生變化、阻礙輔因子與生物分子的結(jié)合,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡(圖1)[10]。Ranquet等[11]研究發(fā)現(xiàn),隨著大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞內(nèi)的Co2+濃度增加,tRNA甲基硫轉(zhuǎn)移酶、烏頭酸酶和鐵還原酶3種Fe-S酶的活性逐漸降低。另外,Co2+還會(huì)干擾微生物細(xì)胞的氧化還原及酶的水解過(guò)程、抑制細(xì)胞分裂。Das等[12]研究發(fā)現(xiàn),在低濃度(<130 μmol/L)的Au4+環(huán)境中,米根菌(Rhizopusoryzae) 會(huì)通過(guò)合成金屬還原硫蛋白對(duì)Au4+進(jìn)行解毒,以維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng),但當(dāng)Au4+的濃度超過(guò)130 μmol/L后,米根菌的生長(zhǎng)受到明顯抑制。另有研究表明,高濃度的Cr6+會(huì)通過(guò)靜電結(jié)合的方式與大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)DNA中的磷酸基團(tuán)結(jié)合,阻礙轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程,導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生誘變[13]。

圖1 重金屬對(duì)微生物的影響示意Fig.1 Schematic diagram of the effect of heavy metals on microorganisms

2 微生物對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)

盡管重金屬脅迫會(huì)顯著降低微生物的多樣性和豐度,及對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝造成一定毒害,但在長(zhǎng)期的重金屬環(huán)境中,微生物會(huì)形成一定的抗性機(jī)制來(lái)響應(yīng)重金屬的脅迫,以維持自身正常的生長(zhǎng)代謝。如微生物細(xì)胞可利用細(xì)胞壁表面的負(fù)電荷官能團(tuán)對(duì)重金屬離子進(jìn)行螯合,以避免過(guò)量的重金屬進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[14]。其次,在重金屬的刺激下,微生物的谷胱還原蛋白和硫氧還原蛋白基因被激活,進(jìn)而可實(shí)現(xiàn)對(duì)重金屬離子的氧化還原。另外,微生物細(xì)胞還可利用一些存在于細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)重金屬離子的吸附、轉(zhuǎn)運(yùn)及外排等?？傮w來(lái)說(shuō),微生物對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)機(jī)制可分為細(xì)胞外屏障、細(xì)胞外螯合、細(xì)胞內(nèi)絡(luò)合、細(xì)胞內(nèi)外排、金屬離子還原5類。

2.1 細(xì)胞外屏障通常,重金屬離子必須先穿透細(xì)胞壁才可進(jìn)入細(xì)胞膜,但因細(xì)胞壁獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu),尤其是革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁肽聚糖層厚而致密,且鑲嵌有磷壁酸的特點(diǎn),細(xì)胞壁在抵御外界刺激過(guò)程中發(fā)揮分子篩的功能,其可阻止分子量大于600 Da的化合物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[15]。另外,一些革蘭氏陽(yáng)性菌如括紅球菌(Rhodococcus)、分枝桿菌(Mycobacterium)、諾卡氏菌(Nocardia)、棒狀桿菌(Corynebacterium)、戈登氏菌(Gordonia)等由于其細(xì)胞壁中富含霉菌酸,使得微生物細(xì)胞表面疏水性和滲透性極差,進(jìn)而阻止了重金屬離子的滲透[16]。而革蘭氏陰性菌由于存在于其細(xì)胞外膜的磷脂和脂多糖不斷地旋轉(zhuǎn)和側(cè)移,且脂多糖的?；湵攘字湼?排列更緊密,致使其對(duì)疏水性化合物的滲透性更低,從而使得革蘭氏陰性菌在細(xì)胞外對(duì)重金屬有較強(qiáng)抗性[17]。

細(xì)胞質(zhì)膜的通透性在阻止重金屬離子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的過(guò)程中亦發(fā)揮重要作用。當(dāng)微生物細(xì)胞受重金屬脅迫后,細(xì)胞膜的脂肪酸組成、鏈長(zhǎng)和磷脂組成會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化以調(diào)整細(xì)胞膜的通透性,進(jìn)而保證了細(xì)胞膜的活力[16-17]。在研究不同濃度的Cu2+、Pb2+、Zn2+和Cr6+對(duì)嗜根寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)活性和細(xì)胞膜通透性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),0～120 mg/L的金屬離子對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)均無(wú)影響,在Cu2+、Pb2+和Zn2+環(huán)境中的細(xì)菌的細(xì)胞膜通透性隨著金屬離子濃度的增加而增加,但當(dāng)Cr6+濃度超過(guò)80 mg/L后,細(xì)胞膜通透性逐漸降低[15]。另外,細(xì)胞膜上大量脂肪酸鏈的存在也會(huì)阻礙重金屬離子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[17]。細(xì)胞莢膜作為一些細(xì)菌表面的特殊結(jié)構(gòu),在微生物細(xì)胞響應(yīng)重金屬的刺激中同樣發(fā)揮重要作用,其可作為一種擴(kuò)散屏障抵抗重金屬進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。

2.2 細(xì)胞外螯合利用微生物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌的螯合蛋白將重金屬在細(xì)胞外進(jìn)行螯合是降低重金屬毒性,維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)的方式之一。目前,已證明可胞外螯合重金屬的蛋白有鐵載體、草酸鹽、磷酸鹽和硫化物等,而細(xì)菌只產(chǎn)生細(xì)胞外鐵載體,是一種含有異羥肟酸鹽、兒茶酚酸鹽、羧酸鹽的多肽[18]。研究發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)分泌2種鐵載體,其中綠膿桿菌螯鐵蛋白pyochelin可以螯合Cd2+、Co2+、Cu2+、Pb2+、Ga3+、Hg2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Sn2+、Tb3+等金屬離子[19],另一種鐵載體熒光嗜鐵素pyoverdines可螯合U6+、Np5+等金屬離子[20]。另外,鐵載體還可以促進(jìn)部分植物對(duì)重金屬離子的吸收,Dimkpa等[21]的研究證明,唐德鏈霉菌(Streptomycestendae)F4分泌的鐵載體去鐵胺desferrioxamineB、coelichelin和desferrioxamine E可使向日葵對(duì)Cd2+的吸收能力顯著增加,來(lái)源于銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)的熒光嗜鐵素pyoverdine和綠膿桿菌螯鐵蛋白pyochelin能顯著促進(jìn)玉米對(duì)Cr6+和Pb2+的吸收[22]。

另外,通過(guò)一些硫酸鹽還原菌在胞外與重金屬形成硫化物沉淀是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞外螯合的另一種途徑。如有研究證明,硫還原泥土桿菌(Geobactermetallireducens)可將Mn4+還原為Mn2+,將U6+還原為U4+,進(jìn)而使兩種金屬離子的毒性減弱[23]。金屬還原地桿菌(Geobactersulfreducens)可將強(qiáng)度性的Cr6+還原為弱毒性的Cr3+[24]。

2.3 細(xì)胞內(nèi)絡(luò)合微生物細(xì)胞經(jīng)外界刺激后,可在胞內(nèi)分泌大量的金屬硫蛋白(MTs)、金屬伴侶蛋白和谷胱甘肽(GSH)等活性大分子物質(zhì),這類物質(zhì)因其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對(duì)重金屬有極強(qiáng)的結(jié)合能力(圖2)[4]。其中MTs是一類富含Cys的金屬結(jié)合蛋白,其高級(jí)結(jié)構(gòu)由含4個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的羧基端和含3個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的氨基端組成,能高效結(jié)合不同類型的金屬離子[24]。研究發(fā)現(xiàn),Cd和Zn可誘導(dǎo)聚球藻(Synechococcus)smtA和smtB基因編碼的MT的合成,其中smtA基因編碼的MT中的半胱氨酸殘基幾乎可以結(jié)合所有類型的金屬離子,而smtB基因編碼的MT含有4個(gè)Zn2+結(jié)合位點(diǎn),負(fù)責(zé)對(duì)Zn2+的特異性結(jié)合[25]。Su等[26]通過(guò)將人MT基因hMT-1A克隆至大腸桿菌JM109中后發(fā)現(xiàn),與原始菌株相比,表達(dá)hMT-1A基因的大腸桿菌突變株對(duì)As3+的吸附效率提高了3倍。Zhao等[27]將豌豆的金屬硫蛋白表達(dá)基因表達(dá)至大腸桿菌JM109中后發(fā)現(xiàn),重組大腸桿菌對(duì)Hg2+的吸附效率提高了6.4倍。

圖2 微生物對(duì)重金屬的胞內(nèi)絡(luò)合機(jī)理示意Fig.2 Schematic diagram of intracellular complexation mechanism of heavy metals by microorganisms

谷胱甘肽(GSH)是由Glu、Cys和Gly組成的含有γ-酰胺鍵和巰基的三肽,在微生物抵抗外界刺激中同樣發(fā)揮重要作用。其中Cly上的羧基和Cys上的巰基是谷胱甘肽能穩(wěn)定的結(jié)合金屬離子的主要原因[13]。任吉民等[28]研究發(fā)現(xiàn),在水溶液中,GSH通過(guò)其Gly兩端的羧基與Dy3+、Ho3+、Yb3+等稀土離子可形成穩(wěn)定的遙爪配位結(jié)構(gòu),進(jìn)而減弱金屬離子的毒性,該結(jié)論亦被Podanyi等[29]證實(shí)。另外,劉建華等[30]的研究發(fā)現(xiàn),Cr2+和Cr3+可與GSH中的S原子結(jié)合形成9種穩(wěn)定的配位化合物,而Wang等[31]利用EDS研究Cd2+脅迫對(duì)路德維希腸桿菌(E.ludwigii)LY6的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),菌株表面形成的顆粒物為CdS沉淀,進(jìn)一步表明GSH在微生物吸附重金屬中具有重要作用。

2.4 細(xì)胞內(nèi)外排許多微生物可通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸或外排系統(tǒng)將存在于細(xì)胞質(zhì)中的金屬離子排出至細(xì)胞外,以避免重金屬對(duì)微生物造成毒害。目前,對(duì)于重金屬的外排公認(rèn)的是CDF、RND和ATPase三大外排系統(tǒng),其家族成員可特異性或非特異性地將重金屬離子通過(guò)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)輸至細(xì)胞外(圖3)[4]。其中CDF家族成員廣泛存在于細(xì)菌、古生菌和真核生物,蛋白結(jié)構(gòu)主要由300～550個(gè)氨基酸組成,包括6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、1個(gè)C-端結(jié)構(gòu)域和1個(gè)富含組氨酸的結(jié)構(gòu)域[30]。研究發(fā)現(xiàn),嗜根寡養(yǎng)單胞菌JC1基因組中含有2個(gè)CDF家族的成員,其中czcD/zitB被預(yù)測(cè)可能參與Co2+、Cd2+、Zn2+的轉(zhuǎn)運(yùn)和外排[15],而其在Ralstoniametallidurans中的同源物已被證明參與Ni2+和Cu2+的轉(zhuǎn)運(yùn)[32]。嗜根寡養(yǎng)單胞菌中的另一個(gè)CDF家族成員是一個(gè)膜蛋白,該蛋白在Achromobacterxylosoxidans中被證明參與Pb2+的轉(zhuǎn)運(yùn)[33]。另外,Von Rozycki等[34]的研究表明,CupriavidusmetalliduransCH34基因組中存在3個(gè)CDF家族的成員,主要參與Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+和 Cd2+的轉(zhuǎn)運(yùn)。RND家族的蛋白質(zhì)是位于細(xì)胞質(zhì)膜上的三聚體蛋白,它們與1個(gè)三聚體外膜因子OMF和周質(zhì)蛋白MFP形成蛋白復(fù)合物。依據(jù)可轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類型和作用機(jī)理,Nies將負(fù)責(zé)重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)的RND家族成員分為Zn2+/Co2+/Cd2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (HME1)、Ni2+/Co2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HME2)、Zn2+(HME3a)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、Co2+(HME3b)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和 Cu+/Ag+(HME4)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5類,但研究發(fā)現(xiàn)嗜根寡養(yǎng)單胞菌基因組中的RND成員中不含特異性負(fù)責(zé)Ni2+/Co2+轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì),預(yù)測(cè)到1個(gè)參與Mg2+/Co2+轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)[15],這可能與微生物的進(jìn)化與遺傳背景有關(guān)。P-ATPase是一種重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族,可攜帶多種重金屬的底物,從結(jié)構(gòu)上考慮P-ATPase具有多個(gè)嚴(yán)格保守的Cys序列的殘基用于識(shí)別和螯合親水性重金屬離子。研究發(fā)現(xiàn),海氏腸球菌(Enterococcushirae)使用稱為CopA和CopB的CPx型 ATP 酶轉(zhuǎn)運(yùn)Cu+和Ag+,惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)S4通過(guò)ATP水解從細(xì)胞質(zhì)中輸出Cu2+,隨后在細(xì)胞周質(zhì)中螯合Cu2+。

圖3 三大外排系統(tǒng)的作用示意Fig.3 Function diagram of the three efflux systems

除上述3種外排系統(tǒng)外,CHR蛋白、NreB和CnrT系統(tǒng)在解毒Cr6+、Ni2+和Co2+方面也發(fā)揮重要作用。CHR介導(dǎo)鉻酸鹽流出并由化學(xué)滲透梯度驅(qū)動(dòng),而CnrT和NreB樣蛋白則由質(zhì)子動(dòng)力和CDF蛋白驅(qū)動(dòng)[35]。

2.5 金屬離子的生物還原通過(guò)生物還原的方法,降低高價(jià)態(tài)重金屬離子的化合價(jià),使其呈弱毒性或無(wú)毒性,并降低其在自然界中的遷移速率是微生物解毒重金屬的另一途徑。研究表明大多數(shù)細(xì)菌如地桿菌(Geobacter)、脫硫單胞菌(Desulfuromonas)、微弧菌(Vibrio)等均可利用金屬元素作為終端電子受體。如Thamdrup[35]的研究發(fā)現(xiàn),Geobactermetallireducens可利用Fe(III)、Cr(VI) 和 Mn(IV)作為終端電子受體來(lái)保存能量和維持正常生長(zhǎng)。Prabhakaran 等[24]的研究表明,砷酸還原菌能將土壤中的As5+還原為As3+,進(jìn)而使植物根系中的As5+含量減少11.5%左右。此外,細(xì)胞色素、氫、乙醇、乳酸鹽等亦可作為電子供體參與微生物對(duì)重金屬的還原。研究表明,細(xì)胞色素a參與硫酸鹽還原菌對(duì)Cr6+的還原,細(xì)胞色素c和細(xì)胞色素b分別參與陰溝腸桿菌和大腸桿菌對(duì)Fe3+和Mn4+的還原。白桿菌屬利用氫、乙醇、乳酸鹽、甲酸鹽等作為電子供體對(duì)Fe3+和Mn4+進(jìn)行還原。

3 展望

微生物具有可培養(yǎng)性強(qiáng)、環(huán)境友好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì),微生物修復(fù)技術(shù)目前被認(rèn)為是重金屬污染場(chǎng)地的修復(fù)中最有潛力的方式?，F(xiàn)階段,已較清晰地掌握了微生物解毒重金屬的生理機(jī)制,這將為微生物修復(fù)技術(shù)的廣泛應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。但目前報(bào)道的大多數(shù)微生物對(duì)重金屬高效的解毒能力均基于實(shí)驗(yàn)室理想的條件下,而一旦應(yīng)用于工程化,受外界諸多不確定因素的影響,其解毒效率將大幅降低。為此,后期需著力挖掘可廣泛應(yīng)用于工程化的微生物資源。另外,工程菌的構(gòu)建是實(shí)現(xiàn)微生物修復(fù)技術(shù)高效、可持續(xù)應(yīng)用的有效途徑,為此在后期的工作中需通過(guò)基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組結(jié)合的方式,挖掘相關(guān)微生物基因組中參與重金屬解毒的基因資源,為工程菌的構(gòu)建提供基因資源。