陳沫冰，嚴(yán) 慧，劉 偉

（1.司法鑒定科學(xué)研究院上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái) 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200063； 2.中國藥科大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210009）

黃曲霉毒素是黃曲霉、寄生曲霉等菌株產(chǎn)生的次級(jí)代謝物[1]，黃曲霉毒素衍生物約有20 種，常見的天然黃曲霉毒素衍生物包括黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（Aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（Aflatoxin G1，AFG1）和黃曲霉毒素G2（Aflatoxin G2，AFG2）等。 黃曲霉毒素的毒性已被廣泛研究，并從動(dòng)物的毒物代謝動(dòng)力學(xué)模型中獲得了大量信息。 黃曲霉毒素具有劇毒性，半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）為0.249 mg/kg，其毒性是氰化鉀的10 倍，是砒霜的68 倍[2]。 黃曲霉毒素具有遺傳毒性、肝毒性、致癌性、致突變性、致畸性和免疫抑制毒性[3-5]。 長(zhǎng)期接觸黃曲霉毒素會(huì)誘發(fā)癌癥，導(dǎo)致兒童營養(yǎng)不良和發(fā)育遲緩[6-8]。 AFB1是黃曲霉等菌株產(chǎn)生的主要毒素，研究表明，除黃曲霉毒素共有的毒性外，AFB1還具有腎毒性、脾臟毒性、心臟毒性，此外還會(huì)損害睪丸導(dǎo)致男性不育，以及加速艾滋病從感染到患病的進(jìn)程[9-11]。 糧食作物（谷物、油籽、香料和堅(jiān)果等）在生產(chǎn)過程的任何階段（如種植、收獲、加工、儲(chǔ)存和運(yùn)輸）都容易受到霉菌的污染，食用受到黃曲霉毒素污染的食物是人類和動(dòng)物接觸黃曲霉毒素的主要途徑，并且黃曲霉毒素還可通過空氣傳播增加人類和動(dòng)物接觸黃曲霉毒素的風(fēng)險(xiǎn)[12-13]。

由于黃曲霉毒素在糧食中廣泛存在且又具有毒性，黃曲霉毒素是法醫(yī)毒物學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究對(duì)象。 人們通過測(cè)定食品中黃曲霉毒素的含量來評(píng)估人體攝入黃曲霉毒素的情況，但這種方法準(zhǔn)確性不高，這是因?yàn)辄S曲霉毒素在特定食物中分布不均，人們有可能會(huì)通過飲食之外的其他途徑接觸黃曲霉毒素，且個(gè)體的吸收分布代謝情況也存在差異，對(duì)生物基質(zhì)中黃曲霉毒素原體及其代謝物進(jìn)行檢測(cè)能更準(zhǔn)確地反映人和動(dòng)物攝入的黃曲霉毒素情況[14-17]。 檢材中黃曲霉毒素的檢測(cè)結(jié)果可為黃曲霉毒素相關(guān)中毒事（案）件的偵破提供線索，探索黃曲霉毒素?cái)z入與黃曲霉毒素中毒之間的聯(lián)系，對(duì)人群攝入的黃曲霉毒素進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，有利于及時(shí)采取黃曲霉毒素管控措施，保障人們的身體健康。

1 體內(nèi)過程

黃曲霉毒素進(jìn)入體內(nèi)后主要經(jīng)肝臟的細(xì)胞色素P450酶系氧化代謝，AFB1經(jīng)氧化代謝后主要生成黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）、黃曲霉毒素Q1（Aflatoxin Q1，AFQ1）、 黃曲霉毒素B1-內(nèi)8，9-環(huán)氧化物（Aflatoxin B1endo-8,9-epoxide）、黃曲霉毒素B1-外8，9-環(huán)氧化物（Aflatoxin B1exo-8,9-epoxide）。前3 種物質(zhì)主要經(jīng)尿液排出，黃曲霉毒素B1-外8，9-環(huán)氧化物在體內(nèi)與生物大分子相互作用，攻擊脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分子產(chǎn)生黃曲霉毒素B1-N7-鳥嘌呤加合物（Aflatoxin-N7-Gua-nine，AFB1-N7-Gua），與血清白蛋白上的賴氨酸殘基結(jié)合形成黃曲霉毒素-白蛋白加合物（AFs-Albumin），并最終以黃曲霉毒素-賴氨酸加合物（Aflatoxin-lysine adducts）的形式存在外周血液循環(huán)中[18-19]。

AFM1與AFB1-N7-Gua 可反映短時(shí)間內(nèi)是否攝入過黃曲霉毒素；AFM1與AFB1-N7-Gua 主要經(jīng)尿液排泄，AFM1還可通過哺乳動(dòng)物的乳汁排出；AFB1-N7-Gua 不僅是評(píng)估個(gè)體黃曲霉毒素?cái)z入的有用標(biāo)記物，還是肝癌風(fēng)險(xiǎn)的最佳預(yù)測(cè)因子之一；依據(jù)半衰期判斷，血清黃曲霉毒素-賴氨酸加合物水平被假定為可反映過去2~3 個(gè)月內(nèi)個(gè)體攝入黃曲霉毒素的情況[18，20]。 尿液中的AFB1-N7-Gua 和血清中的黃曲霉毒素-賴氨酸濃度水平都與黃曲霉毒素的膳食攝入量相關(guān)，已被成功應(yīng)用于估算人類攝入AFB1的含量[21-22]。

因?yàn)辄S曲霉毒素-賴氨酸加合物只能反映最近2~3 個(gè)月內(nèi)黃曲霉毒素的攝入情況，而毛發(fā)生長(zhǎng)緩慢，大約每周生長(zhǎng)0.25 cm，可用于檢測(cè)長(zhǎng)期接觸的藥物和毒素，頭發(fā)中的黃曲霉毒素生物標(biāo)志物可用來評(píng)估多年來生物接觸黃曲霉毒素的情況[23]。 關(guān)于檢測(cè)頭發(fā)中黃曲霉毒素的研究較少，僅有一項(xiàng)研究采用了高效液相色譜-熒光檢測(cè)器法對(duì)頭發(fā)中的AFB1進(jìn)行檢測(cè)，但該研究頭發(fā)樣本中的AFB1并不是由生物體內(nèi)轉(zhuǎn)入，而是采用黃曲霉毒素和頭發(fā)共同孵育的方式進(jìn)入頭發(fā)內(nèi)，缺少AFB1在頭發(fā)中的代謝過程和結(jié)構(gòu)形態(tài)等相關(guān)信息[18]。 AFG1經(jīng)類似的體內(nèi)代謝后會(huì)形成白蛋白加合物，AFB2、AFG2由于缺乏第8 和第9 碳原子之間的雙鍵，在體內(nèi)不能形成環(huán)氧化物[18]。 AFB1體內(nèi)代謝途徑可詳見文獻(xiàn)[16]。

2 樣品前處理方法

樣品前處理主要是為了消除基質(zhì)干擾，預(yù)濃縮目標(biāo)分析物，以便達(dá)到更好的檢測(cè)效果，并提供與分析技術(shù)相兼容的萃取物。 黃曲霉毒素的生物基質(zhì)主要是尿液和血液。 大部分生物體液可直接用于質(zhì)譜分析，這樣可最大限度地減少代謝物的損失。 比如尿液、透析液和消化液，通常只需要稀釋、調(diào)節(jié)pH 值、蒸發(fā)或離心即可，但為了進(jìn)一步消除干擾效應(yīng)，防止高鹽濃度基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物造成電離抑制，或是非揮發(fā)物對(duì)質(zhì)譜儀造成損害，上清液會(huì)根據(jù)需要做進(jìn)一步處理。 血清或血漿中存在高濃度蛋白質(zhì)、磷脂等物質(zhì)，需要在前處理步驟中除去[24]。

2.1 稀釋后進(jìn)樣

稀釋后進(jìn)樣（dilute and shoot，DAS）前處理方法在尿液中應(yīng)用較多。DAS 操作簡(jiǎn)單、成本低，但需要仔細(xì)優(yōu)化稀釋因子，且經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)和干擾基質(zhì)峰的現(xiàn)象，這可能會(huì)降低靈敏度[25]。JOHANNES等[26]采用直接稀釋后進(jìn)樣的方法對(duì)德國、海地、孟加拉國等地的人群尿液中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1進(jìn)行篩查，樣品經(jīng)離心后去除固體殘留物，再用體積比為0.94∶0.05∶0.01 的水-乙腈-甲酸溶液進(jìn)行稀釋，取上清液分析。該方法的回收率為109%~129%，AFM1僅在海地人群尿液樣本中檢出。DEBONGNIE 等[27]利用離心后取上清液過濾膜直接進(jìn)樣的方法對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行分析，黃曲霉素檢出限可達(dá)到pg級(jí)。

2.2 液液萃取

液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）是利用待測(cè)物質(zhì)與干擾物油水分配系數(shù)不同而將待測(cè)物與干擾物分離的提取分離技術(shù)[28]。 在LLE 過程中，加入鹽輔助提取可促使極性化合物從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中[29]。 SONG 等[30]采用鹽析輔助液液萃取法（salting-out assisted liquid-liquid extraction，SALLE）作為前處理方法，AFB1和AFM1的萃取回收率為85%~88%。分散液液微萃?。╠ispersive liquid-liquid microextraction ，DLLM）技術(shù)基于三元溶劑體系（高密度萃取溶劑、水溶性溶劑和極性分散劑溶劑），利用萃取溶劑的細(xì)小液滴在水相中進(jìn)行分散，萃取劑與水相之間的接觸表面積增大，使得萃取平衡較快[31]。 TOLOSA 等[32]運(yùn)用DLLM 提取魚血漿中的黃曲霉毒素， 血漿樣品用乙腈沉淀蛋白后取上清液，在上清液中加入0.2 g 氯化鈉，再加入分散劑溶劑（乙腈）和萃取劑（乙酸乙酯），渦旋離心，在4℃條件下經(jīng)相分離后提取有機(jī)相；該研究還比較了乙酸乙酯和三氯甲烷的萃取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯對(duì)黃曲霉毒素的萃取效果更佳。 SLOBODCHIKOVA等[16]運(yùn)用乙酸乙酯三步LLE 提取人血漿中的17 種霉菌毒素，其中包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，該方法所測(cè)霉菌毒素均無明顯的基質(zhì)效應(yīng)，4 種黃曲霉毒素的回收率均在80%以上；該研究還考察了乙酸乙酯與甲基叔丁基醚對(duì)黃曲霉毒素的提取效果，結(jié)果表明，乙酸乙酯對(duì)黃曲霉毒素的提取效果更佳。 LLE 的優(yōu)點(diǎn)在于選擇性好，可進(jìn)行多次萃取達(dá)到富集目標(biāo)物的目的，但不利于提取極性大的組分，并且在提取過程出現(xiàn)乳化現(xiàn)象還會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物的損失[28]。

2.3 固相萃取

固相萃取（solid phase extraction，SPE）的原理是將不同的填料作為固定相填入微型小柱， 基于吸附、分配、離子交換或其他親和作用，將目標(biāo)物或干擾物保留在柱子上，用適當(dāng)溶劑洗脫，從而將目標(biāo)物和干擾物相互分離[28]。SOLFRIZZO 等[33]將Oasis HLB固相萃取柱與Myco6in1 多種霉菌毒素免疫親和柱聯(lián)用，采用雙重凈化的方式對(duì)尿樣進(jìn)行純化和濃縮，結(jié)果表明，AFM1的平均回收率為95%。 CHEN 等[34]對(duì)血漿中的4 種黃曲霉素進(jìn)行測(cè)定，血漿用乙腈提取后利用Oasis PRiME HLB 固相萃取柱富集， 結(jié)果表明，Oasis PRiME HLB 固相萃取柱可降低基質(zhì)效應(yīng)，具有較高的萃取能力，回收率為92.1%~102%。固相萃取柱引入的干擾物質(zhì)少， 在優(yōu)化條件下有較高的萃取率，重現(xiàn)性好、樣品用量少，且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，但也存在價(jià)格昂貴，柱子易堵塞影響目標(biāo)物的分離效果，以及樣品需要預(yù)處理過程等限制[28]。

2.4 QuEChERS 法

QuEChERS 法是一種精簡(jiǎn)有效的前處理方法，由于具有快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、可靠及安全（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）等特點(diǎn)，故命名為QuEChERS[35]。根據(jù)樣品基質(zhì)和目標(biāo)物不同，QuEChERS 法有了不同程度的改進(jìn)。 JOSEP 等[36]運(yùn)用簡(jiǎn)化的QuEChERS 法提取乳汁中的黃曲霉毒素及其他霉菌毒素，該方法的回收率為64%~93%，黃曲霉素檢出限為1.25ng/mL。 凌阿茹等[37]運(yùn)用QuECh-ERS前處理技術(shù)提取畜禽組織中6 種黃曲霉毒素及雜色曲霉素。 畜禽組織經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶酶解后用10 mL 體積比為84∶16 的乙腈-水溶液提取，然后用1.0 g 氯化鈉和1.0 g 無水硫酸鎂鹽析除水凈化、5 mL 正己烷脫脂。 王瑞國等[38]運(yùn)用QuEChERS法提取動(dòng)物血漿中包括AFB1在內(nèi)的21 種霉菌毒素及其代謝物，黃曲霉毒素的定量限為0.05 ng/mL，黃曲霉毒素的平均回收率為62.0%~99.4%。 QuECh-ERS 法存在前處理回收率高，且可分析的物質(zhì)種類廣泛，樣品處理過程快速、簡(jiǎn)便，溶劑使用量少等優(yōu)勢(shì)，但也存在處理需要的樣品用量大，容易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)等問題[39]。

3 分析方法

黃曲霉毒素在生物基質(zhì)中的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、高效液相色譜-熒光檢測(cè)器法（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FD）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCtandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）、高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法（HPLC-high resolution mass spectrometry，HPLC-HRMS）等分析方法。 ELISA 適合對(duì)大量樣品進(jìn)行篩查；HPLC-FD 對(duì)黃曲霉毒素的定量具有很高的靈敏度；HPLC-MS/MS 分析速度快、靈敏度高，在定性定量分析已知目標(biāo)物有更大的優(yōu)勢(shì)； HPLC-HRMS 在定性分析未知代謝物和經(jīng)修飾的化合物方面具有重要的價(jià)值。 在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)分析要求選擇分析方法。

3.1 ELISA

MARTINEZ 等[40]采用ELISA 試劑盒檢測(cè)46 名志愿者的尿液。 結(jié)果表明，78.5%的尿樣可檢出AFM1，質(zhì)量濃度為0.1~3.1 ng/mL。 SEETHA 等[41]運(yùn)用ELISA 檢測(cè)馬拉維農(nóng)村230 人血液中的黃曲霉毒素賴氨酸加合物，血液中黃曲霉毒素賴氨酸加合物的檢出限為2.5 pg/mg 白蛋白[17]。 ELISA 操作簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)，適用于大量樣本的篩查，但易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，且重復(fù)性差[19]。

3.2 HPLC-FD

黃曲霉毒素具有香豆素結(jié)構(gòu)，在紫外光的照射下可發(fā)出熒光[42]。 GABRIELE 等[43]將免疫親和層析與HPLC-FD 聯(lián)用，測(cè)定血清中黃曲霉毒素-賴氨酸加合物的含量。ANDRADE 等[44]運(yùn)用HPLC-FD 測(cè)定母 乳 中 的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和 赭 曲 霉毒素A，結(jié)果顯示，定量限為0.005~0.03 ng/mL，回收率為73%~99.5%，在分析的224 個(gè)母乳樣本中，有2 個(gè)樣本檢出了AFB1。 熒光檢測(cè)器的選擇性好、靈敏度高，但干擾因素較多，熒光淬滅、背景熒光等會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，且使用熒光分析法缺乏結(jié)構(gòu)信息，不能對(duì)結(jié)構(gòu)上相似的黃曲霉素進(jìn)行鑒別，不能滿足在一次運(yùn)行過程中同時(shí)檢測(cè)大量分析物的需求[44-45]。

3.3 HPLC-MS/MS

HPLC-MS/MS 是分析黃曲霉毒素的最常用技術(shù)。 OSTERESCH 等[46]基于干血斑和干血清斑點(diǎn)技術(shù)對(duì)包括黃曲霉毒素在內(nèi)的27 種霉菌毒素及其代謝物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，黃曲霉毒素的定量限為0.05~0.125 ng/mL，但存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)，干血斑基質(zhì)和干血清斑點(diǎn)的基質(zhì)效應(yīng)分別為49%~423%、19%~125%。HPLC-MS/MS 只能檢測(cè)已知結(jié)構(gòu)的目標(biāo)物或代謝物，而不能檢測(cè)經(jīng)代謝或修飾的未知霉菌毒素[47]。

3.4 HPLC-HRMS

黃曲霉毒素的未知天然衍生物及在生物體內(nèi)經(jīng)修飾和代謝的未知化合物作為潛在污染物還需進(jìn)一步探索，對(duì)于未知化合物的結(jié)構(gòu)解析使用高分辨質(zhì)譜儀更有優(yōu)勢(shì)，高分辨質(zhì)譜儀將全掃描采集模式結(jié)合高分辨率和精確的質(zhì)量測(cè)定，能將目標(biāo)物分析與非目標(biāo)化合物的篩選、新化合物鑒定和回溯數(shù)據(jù)分析相結(jié)合。 SLOBODCHIKVA 等[16]運(yùn)用HPLCHRMS 檢測(cè)人血漿中的17 種霉菌毒素，檢測(cè)時(shí)間為33 min，定量限為0.1~3 ng/mL。 DASí-NAVARRRO 等[48]運(yùn)用HPLC-HRMS 檢測(cè)100 名女性尿液中 包 括AFB1、AFB2、AFG1和AFG2在 內(nèi) 的10 種 目標(biāo)霉菌毒素以及其他非目標(biāo)霉菌毒素。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尿液樣品中檢出了目標(biāo)黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1，還檢出了非目標(biāo)黃曲霉毒素代謝物AFM1、AFM2、AFP1。 HPLC-HRMS 雖然已被證明在定性分析中具有重要的價(jià)值，但其在靈敏度、穩(wěn)健性和線性動(dòng)態(tài)范圍上不及HPLC-MS/MS[24]。

4 應(yīng)用

黃曲霉毒素中毒可分為急性、亞急性或慢性中毒，這取決于黃曲霉毒素的攝入量、攝入時(shí)長(zhǎng)以及物種的特異性和敏感性[49]。 黃曲霉毒素急性中毒癥狀包括嘔吐、出血、腹痛、黃疸、腦水腫、昏迷、抽搐，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致死亡。 世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）根據(jù)世界范圍內(nèi)黃曲霉毒素中毒案例和體外實(shí)驗(yàn)的記錄，指出短時(shí)間內(nèi)經(jīng)常食用受AFB1污染的食品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥1 mg/kg），可能會(huì)導(dǎo)致人類急性中毒，而在1~3 周內(nèi)每天攝入0.02~0.12 mg/kg 被AFB1污染的食物，可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的黃曲霉毒素中毒甚至死亡[50]。 黃曲霉毒素被列為一類致癌物，應(yīng)減少與黃曲霉毒素的接觸[51]。研究表明，慢性乙型肝炎病毒感染和飲食中攝入黃曲霉毒素均會(huì)導(dǎo)致肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高[52]。 通過對(duì)生物基質(zhì)中黃曲霉毒素水平進(jìn)行評(píng)估，可監(jiān)測(cè)人群接觸黃曲霉毒素的情況，一方面有利于防止黃曲霉毒素急性中毒事件發(fā)生，另一方面可阻斷黃曲霉毒素的慢性毒害作用，對(duì)保護(hù)人類身體健康具有重要的意義。黃曲霉毒素檢測(cè)方法在生物基質(zhì)中的應(yīng)用詳見表1。

表1 黃曲霉毒素檢測(cè)方法在生物基質(zhì)中的應(yīng)用

4.1 黃曲霉毒素急性中毒

2004 年，肯尼亞有125 人因黃曲霉毒素急性中毒死亡。 通過對(duì)采集自黃曲霉毒素中毒爆發(fā)地區(qū)的玉米進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AFB1的濃度高達(dá)4 400 ×10-9，是肯尼亞規(guī)定的食品中AFB1限值（20 ×10-9）的220 倍[57]。 1991 年，13 人因食用被硼酸和黃曲霉毒素共同污染的菜肴死亡，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在肝、腎、心、脾、肺和腦等器官中，AFB1、AFB2、AFG1、AFM1和AFM2以及黃曲霉毒醇含量很高[58]。 2016 年，坦桑尼亞爆發(fā)了的黃曲霉毒素中毒事件，其中15 人死亡，患者血液中黃曲霉毒素白蛋白加合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36~32 800 pg/mg[59]。 除了意外中毒事件，還有利用黃曲霉毒素毒性自殺事件的發(fā)生。 一名25 歲的年輕女性兩天內(nèi)連續(xù)攝入5.5 mg AFB1試圖自殺，失敗后，該女性在兩周內(nèi)連續(xù)攝入35 mg AFB1自殺，但都只出現(xiàn)輕微的中毒癥狀（皮疹、惡心和頭痛）[60]。

4.2 評(píng)估黃曲霉毒素?cái)z入量及致癌風(fēng)險(xiǎn)

研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素污染地區(qū)肝癌患者的TP53 抑癌基因的第249 位密碼子發(fā)生了顛倒突變（AGG→AGT），而在非黃曲霉毒素污染區(qū)肝癌患者的TP53 抑癌基因的第249 位密碼子卻沒有發(fā)現(xiàn)變化，AFB1進(jìn)入體內(nèi)代謝后會(huì)形成DNA 加合物導(dǎo)致DNA 突變，從而促使癌癥發(fā)生[61]。 CHEN 等[34]對(duì)10名肝癌志愿者的血清樣本進(jìn)行分析，以評(píng)估AFB1膳食攝入與臨床研究中預(yù)期人類肝癌風(fēng)險(xiǎn)增加之間的關(guān)系，結(jié)果表明，膳食攝入AFB1與人類患肝癌風(fēng)險(xiǎn)增加呈正相關(guān)。 2009 年，在我國臺(tái)灣地區(qū)進(jìn)行的研究觀察到AFB1的尿液代謝物水平與患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)之間存在正相關(guān)，可用于預(yù)測(cè)肝癌風(fēng)險(xiǎn)[62]。 XIA等[12]運(yùn)用HPLC-MS/MS 測(cè)定195 份小麥和62 份大米樣品中AFB1的含量，并對(duì)巴基斯坦農(nóng)村人群（年齡4~80 歲，男性占比58%，n=264）尿液中相應(yīng)的尿液生物標(biāo)志物（AFM1）進(jìn)行分析。 結(jié)果顯示：66%的大米和3%的小麥中檢出AFB1；AFM1在尿液中的平均質(zhì)量濃度為（0.023±0.048） ng/mL，檢出率為69%。 尿液中的AFM1可作為AFB1的生物標(biāo)志物來評(píng)估AFB1攝入與肝癌的相關(guān)性。

無論是評(píng)估人群膳食攝入霉菌毒素量還是霉菌毒素生物監(jiān)測(cè)，都可以分別用預(yù)估攝入量（estimate dietary intake，EDI）和每日可能攝入量（probable daily intake，PDI）來估算霉菌毒素的日攝入量，EDI 和PDI 的計(jì)算方法如下[12]：

其 中：A表 示EDI，μg/（kg·d）；a表 示 食 物 消耗量，kg/d；b表示食物中霉菌毒素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/kg；c表示體重，kg。

其中：B表示PDI，ng/（kg·d）；d表示尿液中生物標(biāo)記物質(zhì)量濃度，ng/mL；e表示每日尿量，mL/d；g表示體重，kg；h表示尿液生物標(biāo)志物排泄率，%，AFB1 排泄率估計(jì)為2%。

在XIA 等[12]的研究中，由公式（1）、（2）可計(jì)算得出巴基斯坦農(nóng)村AFB1的平均EDI 為3.5ng/（kg·d）；AFB1平均PDI 為30.3 ng/（kg·d）。 若每天攝入黃曲霉毒素量達(dá)到20~120 μg/（kg·d），則在1~3 周內(nèi)會(huì)導(dǎo)致急性黃曲霉毒素中毒，癥狀為嘔吐和腹痛，嚴(yán)重者通常會(huì)導(dǎo)致死亡[57，63]。

AFB1是強(qiáng)致癌物，可誘導(dǎo)肝癌形成。攝入AFB1的致癌風(fēng)險(xiǎn)可通過暴露邊際（margin of exposure，MOE）來評(píng)估，計(jì)算方法如下：

其中：C表示MOE，i表示癌癥發(fā)生率為10%的95%基準(zhǔn)劑量置信區(qū)間下限值（BMDL10），其中歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）建議黃曲霉毒素的BMDL10為400 ng/（kg·d）[64]；j表示EDI 或PDI。

由公式（3）和EDI 可計(jì)算得出巴基斯坦農(nóng)村AFB1的MOE 為112.9，由公式（3）和PDI 可計(jì)算得出AFB1的MOE 為13.2。 根據(jù)EFSA 的建議[65]，黃曲霉毒素這種具有致癌性和基因毒性的物質(zhì)，MOE 低于10 000 被認(rèn)為是對(duì)人類健康有風(fēng)險(xiǎn)，需要采取管理行動(dòng)，這項(xiàng)研究得出的數(shù)據(jù)遠(yuǎn)低于10 000，這說明需要對(duì)接觸黃曲霉毒素所致的公眾健康問題引起重視。

考慮到AFB1和乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）在肝癌中的協(xié)同作用，分別對(duì)HBV 陽性和HBV 陰性人群的致癌潛力進(jìn)行評(píng)估。使用公式（4）、（5）可估算與AFB1攝入相關(guān)的癌癥風(fēng)險(xiǎn)。

其中：q表示致癌潛力，為非乙肝攜帶者與乙肝攜帶者每天每千克體重?cái)z入1 ng/kg 的AFB1所致的肝癌年發(fā)病率（/10 萬人）；P為乙肝病毒攜帶率，0.01 與0.3 分別為非乙肝攜帶者與乙肝攜帶者每天每千克體重?cái)z入1 ng/kg 的AFB1所致的肝癌年發(fā)病率（/10 萬人）[66]。 巴基斯坦的乙肝病毒攜帶率為2.4%。

其中：p表示癌癥風(fēng)險(xiǎn)，表示每年每10 萬人中因AFB1所致的肝癌癥人數(shù)；q表示致癌潛力；j表示EDI 或PDI。

運(yùn)用EDI 和PDI 來預(yù)估癌癥風(fēng)險(xiǎn)，XIA 等[12]推斷AFB1誘導(dǎo)的癌癥風(fēng)險(xiǎn)分別為每年0.059例/10萬人、0.514 例/10 萬人。

4.3 評(píng)估黃曲霉毒素與兒童生長(zhǎng)發(fā)育障礙之間的關(guān)系

目前，很多學(xué)者對(duì)黃曲霉毒素對(duì)兒童發(fā)育的影響進(jìn)行了評(píng)估，但目前關(guān)于黃曲霉毒素與對(duì)兒童健康造成影響的相關(guān)證據(jù)仍較少，且存在方法上的局限性。 與成人相比，兒童的代謝和排泄系統(tǒng)不成熟且生長(zhǎng)發(fā)育速度較快，這樣的生理特點(diǎn)使得其更易受到環(huán)境毒物的影響，而若是幼年時(shí)暴露于有害環(huán)境中會(huì)影響日后的生長(zhǎng)甚至誘導(dǎo)疾病產(chǎn)生。 研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素與幼兒生長(zhǎng)遲緩有關(guān)[67-68]。 根據(jù)相關(guān)動(dòng)物模型提供的信息和有限的人類數(shù)據(jù)，提出了流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)的若干機(jī)制：黃曲霉毒素對(duì)腸上皮細(xì)胞的毒性損傷，導(dǎo)致兒童營養(yǎng)物質(zhì)攝取不足；黃曲霉毒素相關(guān)的免疫抑制可增加兒童腹瀉的發(fā)病率[61，69]。MCMILLAN 等[69]運(yùn)用HPLC-HRMS 和同位素質(zhì)譜法對(duì)58 名尼日利亞兒童血漿中黃曲霉毒素-賴氨酸加合物進(jìn)行定量分析，血漿中黃曲霉毒素-賴氨酸加合物的檢出率為81%；檢出的黃曲霉毒素-賴氨酸加合物含量為0.2~59.2 pg/mg 白蛋白，中位數(shù)為2.6 pg/mg 白蛋白。營養(yǎng)不良的兒童血漿中黃曲霉毒素-賴氨酸含量更高，推測(cè)長(zhǎng)期接觸黃曲霉毒素超過閾值可能引起發(fā)育遲緩，但是實(shí)際過程影響因素眾多，還需要進(jìn)一步研究。 AYELIGN 等[54]運(yùn)用HPLC-MS 對(duì)大約200 名兒童尿液中的黃曲霉毒素進(jìn)行檢測(cè)，大約有17%的兒童尿液中檢出黃曲霉毒素，這表明兒童吃的食物中存在黃曲霉素污染的風(fēng)險(xiǎn)；該研究還通過皮爾遜相關(guān)系數(shù)來評(píng)價(jià)尿液中黃曲霉毒素含量與發(fā)育遲緩、兒童消瘦之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不存在相關(guān)性。 LAUER 等[70]運(yùn)用HPLCFD 評(píng)估220 名孕婦暴露于黃曲霉毒素環(huán)境中的情況，并對(duì)孩子出生后的體重、體重年齡指數(shù)以及頭圍-年齡指數(shù)進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母體黃曲霉毒素-賴氨酸加合物高水平與低出生體重、低出生體重年齡指數(shù)和低頭圍-年齡指數(shù)得分之間顯著相關(guān)。 由于方法檢測(cè)的指標(biāo)不同，影響生長(zhǎng)評(píng)估指標(biāo)的差異以及影響生長(zhǎng)發(fā)育的因素具有復(fù)雜性，目前表明黃曲霉素會(huì)造成兒童發(fā)育遲緩和營養(yǎng)不良的證據(jù)不足，還需進(jìn)一步長(zhǎng)期跟蹤性調(diào)查，以及需要更加全面可靠的評(píng)估指標(biāo)來闡明黃曲霉毒素對(duì)兒童生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

4.4 黃曲霉毒素職業(yè)攝入評(píng)估

接觸黃曲霉毒素的最常見途徑是由于食用直接或間接受污染的食物。 此外，人類和動(dòng)物也可能通過吸入或接觸受污染的粉塵而攝入黃曲霉毒素[71-72]。 工作在黃曲霉毒素暴露的環(huán)境中，特別是接觸黃曲霉毒素污染粉塵的工人，其患肺癌、支氣管和氣 管 腫 瘤 的 幾 率 較 高[73-74]。 DEBEGNACH 等[75]通 過對(duì)尿液中AFB1和AFM1進(jìn)行分析，探討職業(yè)性接觸黃曲霉毒素的可能原因：將志愿者分為兩組，工人組由意大利一家飼料廠的工人組成（n=32），對(duì)照組（n=29）由同一飼料廠的行政人員組成，總共收集并分析了120 個(gè)尿液樣品。 結(jié)果顯示：14 個(gè)樣品（12%）檢出了AFM1（質(zhì)量濃度為1.9~10.5 pg/mL），只有1個(gè)樣品的AFM1值超過了定量限值（10.5 pg/mL）。 工人組和對(duì)照組的黃曲霉毒素檢出平均值之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這表明在這種特定的環(huán)境中沒有發(fā)生職業(yè)攝入，但對(duì)黃曲霉毒素的關(guān)注卻不能放松，需要對(duì)可能接觸這些有毒化合物污染粉塵的人群健康狀況進(jìn)行系統(tǒng)監(jiān)測(cè)。SUSANA 等[72]運(yùn)用ELISA 對(duì)41名廢物處理廠工人和30 個(gè)對(duì)照人員血液中AFB1的含量進(jìn)行評(píng)估， 結(jié)果顯示，41 名廢物處理廠工人的結(jié)果都呈陽性，質(zhì)量濃度為2.5~25.9 ng/mL，而30 個(gè)對(duì)照人員均未檢出AFB1， 這說明廢物處理廠工人的霉菌毒素質(zhì)量濃度明顯高于對(duì)照組。 其中，有6 名廢物處理廠工人的工作是分類廢物和駕駛垃圾清運(yùn)車，工作接觸中高粉塵的機(jī)會(huì)更多，其AFB1水平高于20 ng/mL， 而其他廢物處理廠工人的AFB1水平均低于14 ng/mL。 VIEGAS等[14，76]利用ELISA 測(cè)定家禽屠宰場(chǎng)員工血清中的AFB1來評(píng)估該廠員工攝入黃曲霉毒素的情況。 結(jié)果顯示：14名屠宰場(chǎng)員工血清中檢出AFB1， 質(zhì)量濃度為1.06~4.03 ng/mL； 對(duì)照組員工血清中未檢出AFB1。 在屠宰場(chǎng)環(huán)境中，工人們除了可能吸入空氣中顆粒而吸入黃曲霉毒素外，還可能是接觸到了食用黃曲霉素污染飼料的雞鴨內(nèi)臟， 通過皮膚攝入黃曲霉毒素，在大多數(shù)工作場(chǎng)所，工人在處理禽類時(shí)都應(yīng)該使用手套避免霉菌的污染和傳播。 黃曲霉毒素對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生毒害作用，對(duì)可能接觸黃曲霉素的工作者需要配套好保護(hù)措施并對(duì)其健康狀態(tài)進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)。

5 展望與不足

目前，文獻(xiàn)所報(bào)道的對(duì)生物檢材中多種霉菌毒素進(jìn)行同時(shí)快速篩查的檢測(cè)方法中，黃曲霉素篩查的目標(biāo)物主要還是黃曲霉毒素原型或是代謝物AFM1，對(duì)黃曲霉毒素代謝物黃曲霉毒素Q、黃曲霉毒素-鳥嘌呤加合物、黃曲霉毒素-賴氨酸加合物的檢測(cè)比較少，在實(shí)際應(yīng)用中可能會(huì)低估黃曲霉毒素的污染流行率。