邵 鵬,唐崟梅,2,林亞秋,王 永,向 華,黃 煉,2*,朱江江,2*

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省/教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610207;2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院,成都 610207)

山羊肉具有肉質(zhì)細(xì)膩,低脂高蛋白等特點(diǎn),受到眾多國(guó)民的喜愛[1]。肌內(nèi)脂肪(IMF)為肌肉纖維之間的脂肪組織,是肉產(chǎn)品生產(chǎn)中一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀,其也被稱為大理石花紋,適當(dāng)?shù)腎MF含量可以增加肉產(chǎn)品的嫩度、多汁性和風(fēng)味,從而改善肉產(chǎn)品的口感和品質(zhì)[2-4]。IMF沉積由脂肪合成與分解代謝共同決定[5-6],其中脂肪合成的機(jī)制尚不明確,因此,需要對(duì)IMF沉積過程中脂肪合成的分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究,為改善山羊肉品質(zhì)提供理論參考依據(jù)。

蛋白酶體是存在于真核細(xì)胞中溶酶體外的蛋白水解體系,是依賴ATP的蛋白水解酶復(fù)合物[7],Xu等[8]研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體受到抑制后骨髓瘤細(xì)胞中脂質(zhì)代謝發(fā)生改變。蛋白酶體包括兩種形式:20S蛋白酶體和26S蛋白酶體[9]。有研究報(bào)道,26S蛋白酶體能直接或間接調(diào)控脂質(zhì)代謝過程[10]。26S蛋白酶體非ATPase調(diào)節(jié)亞基9(proteasome 26S subunit, non-ATPase 9,PSMD9),是26S蛋白酶體的調(diào)節(jié)因子,定位于染色體12q24.31～q24.32上[11-12]。Parker等[13]通過脂質(zhì)組學(xué)和蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PSMD9參與脂質(zhì)代謝的調(diào)控。在疾病上研究發(fā)現(xiàn),PSMD9與肥胖、II型糖尿病、血脂異常和心血管等疾病相關(guān)[14-18]。PSMD9可通過調(diào)節(jié)胰島素基因轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)脂肪合成,從而導(dǎo)致高膽固醇血癥[19-20]。此外,PSMD9可作為?；视偷尿?qū)動(dòng)因子調(diào)節(jié)肝酰基甘油代謝[21]。在小鼠上的研究發(fā)現(xiàn),干擾PSMD9基因能夠減少肝臟脂肪生成[13]。這些研究結(jié)果表明,PSMD9對(duì)機(jī)體脂質(zhì)代謝具有重要作用,然而,目前對(duì)PSMD9的研究主要集中在人類疾病和小鼠等模式動(dòng)物上,關(guān)于PSMD9基因在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積中的作用尚未見報(bào)道。

因此,本試驗(yàn)以簡(jiǎn)州大耳羊?yàn)檠芯繉?duì)象,利用PCR技術(shù)克隆山羊PSMD9基因序列,測(cè)定其在不同分化時(shí)期及不同組織中的表達(dá)水平,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過過表達(dá)和干擾PSMD9基因進(jìn)一步探究PSMD9對(duì)肌內(nèi)脂肪沉積的調(diào)控作用,為提高山羊IMF含量改善羊肉品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從四川省簡(jiǎn)陽大哥大牧業(yè)有限公司隨機(jī)挑選12只健康1周歲左右的簡(jiǎn)州大耳羊公羊,早上空腹,頸動(dòng)脈放血致死,然后在無菌條件下采集山羊心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌、臂三頭肌、小腸和皮下脂肪組織樣品,用配好的DEPC水清洗潔凈后快速分割,隨后立即用錫紙包裹并存放于液氮罐中用于提取組織總RNA。本試驗(yàn)所用的山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞來自本實(shí)驗(yàn)室前期凍存的1日齡羔羊的前體脂肪細(xì)胞。

主要試劑:Gel Extraction Kit購(gòu)自凱杰生物工程(深圳)有限公司(德國(guó)),gDNAse、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ與BamH I、pMD19-T購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自北京天恩澤生物技術(shù)公司(中國(guó)),QuantiFastTMSYBR?Green PCR Kit、QuantiTect Reverse Transcription Kit、DEME/F-12、opti-MEM購(gòu)自賽默飛世爾科技公司(美國(guó)),DH5α感受態(tài)細(xì)胞、高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司,宿主菌大腸桿菌E.coliDH5α購(gòu)自北京擎科生物技術(shù)有限公司,氨芐購(gòu)自北京孚博生物科技有限公司(德國(guó)),甘油三酯試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司,I型膠原酶購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司,胚胎牛血清購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司,無菌PBS、胰蛋白酶購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA合成 Trizol法提取山羊各組織的總RNA,用紫外分光光度計(jì)NanoDrop-ND-1000(Agilent)測(cè)定RNA樣品的濃度與OD值,所測(cè)數(shù)值均在1.8～2.0之間。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript Ⅲ All-in one RT SuperMix Perfect for qPCR)說明書,將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,具體操作如下:在RNase-free離心管中配制如下混合液:模板RNA 1 μg,Enzyme Mix 1 μL,5×All-in-one qRT SuperMix 4 μL,RNase-free ddH2O補(bǔ)充到總體積20 μL,使其充分混合,在PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)程序?yàn)?50 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 目的基因克隆 根據(jù)GenBank公布的山羊PSMD9的預(yù)測(cè)序列(XM_005691404.3)在Primer Premier 5.0軟件上設(shè)計(jì)引物(F: GCTACAGTTTCCTCGGGCGTCC; R:ACCACCTAGT-TCAGGCGTCCAG),預(yù)測(cè)長(zhǎng)度564 bp。

以山羊的肝臟組織為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR擴(kuò)增體系如下:1×T3 Super PCR Mix 12.5 μL,上、下游引物各1.0 μL,肝臟cDNA 1.0 μL,ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為98 ℃ 3 min;98 ℃ 30 s,62.2 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。PCR結(jié)束之后,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),根據(jù)TIANGEN公司生產(chǎn)的瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒說明書對(duì)克隆獲得的目的片段進(jìn)行回收。將回收片段連接到pMD-19 T載體,連接體轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單一呈圓形的陽性菌落,菌液PCR鑒定單一正確的目的基因條帶后,送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 對(duì)克隆得到的山羊PSMD9基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,具體生物信息學(xué)分析內(nèi)容及分析工具見表1。

表1 序列分析及其工具Table 1 Sequence analysis and analysis tools

1.2.4 山羊PSMD9基因組織表達(dá)差異分析和時(shí)序表達(dá)譜構(gòu)建 采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因的熒光特異性引物(表2),以UXT作為內(nèi)參基因矯正基因的相對(duì)表達(dá)水平,從12只公羊中隨機(jī)選取3只公羊組織樣,利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)PSMD9基因在簡(jiǎn)州大耳羊各組織中的mRNA表達(dá)水平和山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中0～8 d每間隔2 d的表達(dá)水平。RT-qPCR反應(yīng)體系:cDNA稀釋液1 μL,上、下游引物各0.2 μL,熒光染料(Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix)5 μL,ddH2O 3.6 μL。RT-qPCR程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)引物信息Table 2 Primers information for real-time quantitative PCR (RT-qPCR)

1.2.5 山羊PSMD9過表達(dá)載體構(gòu)建和干擾序列合成 根據(jù)山羊PSMD9基因CDS區(qū)763 bp的序列,利用BioXM2.6找出適宜的酶切位點(diǎn)(Hind Ⅲ、BamH I),并設(shè)計(jì)亞克隆引物(F:CCCAAGCT-TGCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGA-TAAGTCGGAGAAGGCGGGG;R:CGCGGATC-CTCATCTTTGCAATGGAATAATGTTGCA)。利用Hind Ⅲ和BamH I對(duì)pcDNA3.1載體和亞克隆獲得完整的山羊PSMD9基因CDS區(qū)序列進(jìn)行雙酶切,雙酶切體系為亞克隆產(chǎn)物10 μL,Hind Ⅲ1 μL,BamH I 1 μL,10*K Buffer 2.5 μL,ddH2O 5.5 μL。37 ℃水浴過夜,利用通用型DNA純化回收試劑盒(Universal DNA Purification kit)進(jìn)行純化,T4連接酶連接純化產(chǎn)物,隨后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,接種,挑取陽性菌落及測(cè)序,最后使用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH I對(duì)重組的pcDNA3.1-PSMD9質(zhì)粒進(jìn)行酶切后電泳,即雙酶切鑒定。山羊siRNA序列(S:GCGACAUUCAGGAACUGAUTT;A:AUCAGUUCCUGAAUGU-CGCTT)和Negative control(S:UUCUUCGAAC-GUGUCACGUTT; A:ACGUGACACGUUCGG-AGAATT)序列由上海吉瑪公司合成。siRNA經(jīng)12 000 r·min-1離心10 min,并溶解于62.5 μL DEPC水。

1.2.6 山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 37 ℃水浴解凍實(shí)驗(yàn)室凍存的山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞,將細(xì)胞接種含1%雙抗及10 mL·L-1胎牛血清的DEME/F-12培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng),待F3代細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí),將細(xì)胞接種至6孔板中,每孔細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)轉(zhuǎn)染。山羊PSMD9過表達(dá)組設(shè)置pcDNA 3.1-PSMD9組和pcDNA3.1陰性對(duì)照組。按轉(zhuǎn)染試劑的說明書配制預(yù)混液,即pcDNA 3.1-PSMD9質(zhì)粒1 μg,轉(zhuǎn)染試劑4 μL及90 μL的無血清培養(yǎng)基,輕微振蕩混勻后,室溫靜置15 min。將靜置好的預(yù)混液均勻滴加到饑餓4 h細(xì)胞中,振蕩混勻并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后,使用50 μmol·L-1油酸誘導(dǎo)細(xì)胞分化,48 h后利用Trizol法收集6孔板的細(xì)胞,提取細(xì)胞RNA后反轉(zhuǎn)錄,將cDNA置于-20 ℃冰箱保存。山羊PSMD9干擾組設(shè)置siPSMD9和Negative control(陰性對(duì)照組),轉(zhuǎn)染方法如下:siPSMD9和Negative control試劑6 μL,轉(zhuǎn)染試劑4 μL及90 μL無血清培養(yǎng)基配制好混合液,將混合液添加至饑餓的細(xì)胞中,振蕩混勻并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后,使用50 μmol·L-1油酸誘導(dǎo)細(xì)胞分化,48 h后利用Trizol法收集6孔板的細(xì)胞,提取細(xì)胞RNA后反轉(zhuǎn)錄,將cDNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.7 油紅O染色和甘油三酯測(cè)定 用于染色的細(xì)胞接種于6孔板,10 mL·L-1甲醛固定誘導(dǎo)48 h的細(xì)胞30 min,在固定細(xì)胞前后各用PBS緩沖液清洗,油紅O染色:利用適量油紅O工作液染色30 min,PBS洗去油紅O工作液,使用顯微鏡觀察脂滴情況并拍照[22]。按照甘油三酯測(cè)定試劑盒的說明書進(jìn)行操作,具體操作如下:每孔加入200 mL裂解液,吹打收集細(xì)胞于離心管中,混勻后室溫靜置10 min。取適量上清液70 ℃加熱10 min,室溫2 000 r·min-1離心5 min,上清液即可用于甘油三酯測(cè)定。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 組織表達(dá)差異分析、時(shí)序表達(dá)分析、過表達(dá)和干擾效率分析均以UXT為內(nèi)參基因[23],采用2-ΔΔCt法對(duì)RT-qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算,其中△△Ct=[(Ctgene-CtUXT)]試驗(yàn)組-[(Ctgene-CtUXT)]對(duì)照組。本研究中所有的結(jié)果數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)”表示,顯著性檢驗(yàn)使用Graphpad prism 8.0軟件中One-way ANOVA(and nonparametric or mixed)分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著;利用Graphpad prism 8.0繪圖。每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié) 果

2.1 山羊PSMD9基因克隆與生物信息學(xué)分析

以簡(jiǎn)州大耳羊肝臟組織RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,采用RT-PCR擴(kuò)增獲得山羊PSMD9基因核苷酸序列763 bp(圖1),其中5′UTR 67 bp,CDS區(qū)564 bp,3′UTR 132 bp,編碼187個(gè)氨基酸殘基,起始密碼子為ATG,終止密碼子為TGA。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. PSMD9基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M. DL2000 DNA marker; 1. PCR products of PSMD9 gene圖1 PSMD9基因目的片段的擴(kuò)增Fig.1 Amplification of target fragment of PSMD9 gene

利用BLAST對(duì)不同物種PSMD9基因的同源性進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)州大耳羊與綿羊(XP_004017391.1)、牛NP_001029613.1)、野豬(XP_003132922.1)、犬(XP_025329610.1)、人(NP_002804.2)、馬(XP_001496522.2)、水牛(XP_006047226.1)、大熊貓(XP_034528225.1)、駱駝(XP_006178110.1)的相似性分別為82.84%、81.86%、76.21%、74.76%、70.04%、74.63%、81.37%、75.24%、76.47%(圖2A)。采用MEGA5軟件將各物種的氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2B)。

A. PSMD9氨基酸相似性分析;B. PSMD9系統(tǒng)進(jìn)化樹分析;C. PSMD9親、疏水性分析;D. PSMD9磷酸化位點(diǎn)分析;E. 不同物種PSMD9蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);F. 山羊PSMD9蛋白相互作用蛋白預(yù)測(cè)分析A. PSMD9 amino acid similarity analysis; B. PSMD9 phylogenetic tree analysis; C. Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of PSMD9; D. Analysis of PSMD9 phosphorylation site prediction; E. Prediction of tertiary structure of PSMD9 proteins from different species; F. Prediction of PSMD9 protein-interacting proteins in goats圖2 山羊PSMD9基本理化性質(zhì)及序列分析Fig.2 Basic physicochemical properties and sequence analysis of goat PSMD9

理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn),PSMD9蛋白分子式為C881H1450N274O280S7,分子量為20 585.29 u,理論等電點(diǎn)(theoretical PI)為7.77,該蛋白體外半衰期在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞離體狀態(tài)下為30 h,其蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為57.37。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)為25,帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為26,原子總數(shù)為2 892,脂肪系數(shù)為84.01,總平均親水系數(shù)為-0.598。

PSMD9蛋白在176～183區(qū)有較強(qiáng)的疏水性,在25～52、55～70、80～92、94～129區(qū)有較強(qiáng)的親水性(圖2C),整個(gè)蛋白質(zhì)中親水性最大值是3.222(第107位氨基酸),最小值是-1.933(第181位氨基酸),推測(cè)出PSMD9為親水性蛋白。磷酸位點(diǎn)分析顯示,PSMD9具有36個(gè)磷酸位點(diǎn)(圖2D)。信號(hào)肽的預(yù)測(cè)顯示,發(fā)現(xiàn)山羊PSMD9不存在信號(hào)肽。跨膜結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)PSMD9蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)。

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,山羊PSMD9蛋白主要含α螺旋31.03%,無規(guī)則卷曲44.92%,β折疊5.88%。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,山羊、綿羊、牛、和豬的PSMD9三級(jí)結(jié)構(gòu)相似(圖2E)。利用STRING交互式數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白相互作用分析(圖2F),分析得出PSMD9蛋白可能與PSMC6、PSMC3、PSMC2、PSMD1、PSMD2、PSMD8和PSMD12等蛋白存在相互作用。

2.2 山羊PSMD9基因組織表達(dá)差異分析和時(shí)序表達(dá)譜構(gòu)建

以UXT為內(nèi)參基因,以PSMD9在心臟中的表達(dá)水平做歸一化處理。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,PSMD9在山羊不同組織中均有表達(dá),在肝臟中表達(dá)量最高,脾臟中表達(dá)量最低(圖3A)。山羊PSMD9基因在誘導(dǎo)分化的第0～8天肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中均存在表達(dá),誘導(dǎo)分化第8天時(shí)表達(dá)水平最高(圖3B),且顯著高于誘導(dǎo)分化之前表達(dá)水平(P<0.05)。

A. 山羊PSMD9基因組織表達(dá)譜;B. 山羊PSMD9基因在山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化過程中的相對(duì)表達(dá)水平。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)A. Tissue expression profile of PSMD9 gene in goats; B. Relative expression level of goat PSMD9 gene during the differentiation of goat intramuscular adipocytes. Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05); The same letters indicate insignificant difference(P>0.05)圖3 山羊PSMD9基因組織及肌內(nèi)脂肪細(xì)胞不同分化階段的相對(duì)表達(dá)水平Fig.3 Relative expression levels of PSMD9 gene in goat tissues and intramuscular adipocytes at different differentiation stages

2.3 PSMD9對(duì)山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響

pcDNA3.1-PSMD9轉(zhuǎn)染山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞并誘導(dǎo)48 h后,收集細(xì)胞,利用RT-qPCR檢測(cè)PSMD9過表達(dá)效率,結(jié)果顯示,過表達(dá)PSMD9基因后其相對(duì)表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組,表達(dá)效率約為對(duì)照組的192倍(P<0.01);干擾PSMD9后其相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),干擾效率為72%(圖4A)。甘油三酯測(cè)定結(jié)果顯示,pcDNA3.1-PSMD9組甘油三酯含量顯著高于pcDNA3.1組(P<0.05);干擾PSMD9基因后,siPSMD9組甘油三酯含量低于Negative control組(圖4B)。油紅O染色結(jié)果顯示pcDNA3.1-PSMD9組較pcDNA3.1組脂滴增加;siPSMD9組較Negative control組脂滴減少(圖4C)。

A. PSMD9過表達(dá)和干擾效率檢測(cè);B. 以GPO-Trinder酶法檢測(cè)甘油三酯含量;C. 油紅O染色。*.P<0.05, **.P<0.01,下同A. PSMD9 overexpression and interference efficiency detection; B. Triglyceride content by GPO-Trinder enzyme reaction;C. Oil Red O staining.*.P<0.05, **.P<0.01, the same as below圖4 PSMD9基因?qū)ι窖蚣?nèi)前體脂肪細(xì)胞的影響Fig.4 Effect of PSMD9 gene on intramuscular precursor adipocytes of goat

2.4 PSMD9對(duì)山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

干擾山羊PSMD9后,通過RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1(DGAT1)和脂肪酸合成酶(FASN)顯著下調(diào)(P<0.05),過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)極顯著下調(diào)(P<0.01),而二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶2(DGAT2)和硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)無顯著變化。過表達(dá)山羊PSMD9后,DGAT2極顯著上調(diào)(P<0.01),FASN和ACC顯著上調(diào)(P<0.05),而DGAT1、PPARγ和SCD1無顯著變化(圖5)。

A.干擾PSMD9基因?qū)χx相關(guān)基因表達(dá)的影響;B.過表達(dá)PSMD9基因?qū)χx相關(guān)基因表達(dá)的影響A. Effect of interfering with PSMD9 gene on the expression of genes related to lipid metabolism; B. Effects of overexpression of PSMD9 gene on the expression of lipid metabolism-related genes圖5 PSMD9對(duì)脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of PSMD9 on the expression of genes related to lipid metabolism

3 討 論

脂肪生成過程是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)過程,可分為兩個(gè)主要階段:轉(zhuǎn)化(從間充質(zhì)干細(xì)胞到前體脂肪細(xì)胞)和終末分化(從前體脂肪細(xì)胞到脂肪細(xì)胞)[24-25]。脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)是由脂肪細(xì)胞數(shù)量的積累以及體積的變化導(dǎo)致的,而成熟的脂肪細(xì)胞不具備分裂和分化的能力,因此脂肪細(xì)胞數(shù)量上的積累是因?yàn)榍绑w脂肪細(xì)胞的增殖分化,脂肪細(xì)胞體積的增大主要是因?yàn)榘麅?nèi)甘油三酯升高[26]。PSMD9基因在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積中的作用是未知的,為了探索PSDM9基因在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中對(duì)的脂質(zhì)沉積的作用,本試驗(yàn)克隆了PSMD9基因,得到了CDS區(qū)全序列,通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)PSMD9基因具有36個(gè)磷酸化位點(diǎn)修飾,這將有助于蛋白的翻譯后修飾及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[27]。將山羊PSMD9氨基酸序列與其他物種比對(duì)發(fā)現(xiàn),山羊與綿羊、牛的相似性較高,說明其在不同物種中的保守性較高,這與Hopper等[12]的研究結(jié)果一致。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明,山羊PSMD9與綿羊、牛具有較高的親緣性;對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),不同物種間的結(jié)構(gòu)相似,因此推測(cè)PSMD9基因在不同物種間可能發(fā)揮著相似的作用。

脂肪細(xì)胞的分化對(duì)肌內(nèi)脂肪沉積具有重要作用,為進(jìn)一步探討PSMD9基因?qū)ι窖蚣?nèi)脂肪沉積的作用,本研究利用RT-qPCR檢測(cè)了PSMD9基因在不同組織中的表達(dá)和山羊前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)。結(jié)果表明,PSMD9基因在山羊肝臟表達(dá)量最高,在腎和小腸等組織中均有表達(dá),這與Uhlen等[28]的研究結(jié)果PSMD9在腎臟組織中具有較高表達(dá)相一致。肝臟是脂質(zhì)代謝比較旺盛的組織[29],脂肪酸作為腸道的主要產(chǎn)物[30],本試驗(yàn)結(jié)果在肝臟和小腸中的高表達(dá)也體現(xiàn)了PSMD9基因?qū)φ{(diào)控脂質(zhì)代謝具有重要作用。通過分析PSMD9基因的時(shí)序表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSMD9基因在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的第0～8天均有表達(dá),且在誘導(dǎo)分化的第8天達(dá)到最高水平,顯著高于誘導(dǎo)分化之前表達(dá)水平(P<0.05),由此推測(cè),PSMD9基因在不同分化時(shí)期可能發(fā)揮不同的作用。

為了闡明PSMD9基因?qū)ι窖蚣?nèi)前體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響,本試驗(yàn)利用過表達(dá)和干擾手段進(jìn)行研究,結(jié)果顯示,過表達(dá)PSMD9基因后促進(jìn)山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的脂滴積累和甘油三酯合成,干擾PSMD9基因后山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞脂滴聚集減少、甘油三酯合成減少,這與Parker等[13]在小鼠中的研究結(jié)果一致,上調(diào)PSMD9基因可促進(jìn)脂質(zhì)增加。PPARs是研究脂質(zhì)代謝的重要候選基因,它屬于II型核受體超家族,是一類能夠被天然或人工合成的配體和前列腺素代謝物等激活,在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮重要調(diào)控作用的核轉(zhuǎn)錄因子。PPARs家族包括3種亞型,PPARα、PPARβ和PPARγ。三者在體內(nèi)的分布差別較大而功能也不盡相同。研究表明,PPARγ的表達(dá)足以維持脂肪細(xì)胞分化,且是脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)生成必不可少的轉(zhuǎn)錄因子[31-32]。DGAT1和DGAT2是甘油三酯合成所需的限速酶,是外源脂肪酸形成甘油三酯的關(guān)鍵酶,且研究證明過表達(dá)DGAT1和DGAT2基因可促進(jìn)脂質(zhì)沉積[33-36]。PSDM9的表達(dá)能夠顯著上調(diào)DGAT2的表達(dá),而siPSMD9處理顯著降低了DGAT1和PPARγ的表達(dá),這些數(shù)據(jù)表明,PSMD9能夠促進(jìn)脂質(zhì)沉積。FASN由多個(gè)亞基組成,是一種多功能復(fù)合酶,也是脂肪酸合成過程中的限速酶,其活性與動(dòng)物體內(nèi)脂肪酸的合成和體脂的沉積具有密切關(guān)系[37]。ACC在脂肪從頭生成中限制速率,并調(diào)節(jié)脂肪酸氧化,ACC可以抑制肝臟丙二酰輔酶A的產(chǎn)生,減少脂肪酸的合成和增加肝臟脂肪酸的氧化[38-39]。PSMD9的表達(dá)顯著增加了FASN和ACC的表達(dá),而siPSMD9處理顯著降低了FASN和ACC的表達(dá),這些數(shù)據(jù)表明,PSMD9似乎能促進(jìn)脂肪酸從頭合成。綜合以上結(jié)果,推測(cè)山羊PSMD9基因可能通過促進(jìn)脂肪合成代謝途徑從而促進(jìn)脂質(zhì)沉積。但闡明山羊PSMD9基因調(diào)控肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究克隆得到了山羊PSMD9基因核苷酸序列763 bp,編碼187個(gè)氨基酸殘基;其在肝臟組織中表達(dá)量最高,脾臟組織中表達(dá)量最低;山羊PSMD9基因隨著肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的分化而逐漸降低,在第4天表達(dá)量最低,之后表達(dá)量逐漸升高;PSMD9基因表達(dá)能夠顯著促進(jìn)山羊前體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積。這些結(jié)果將為進(jìn)一步闡明PSMD9在山羊肌內(nèi)脂肪沉積過程中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。