余 洲,楊柏高,張 航,徐 茜,張培培,馮肖藝,曹建華,牛一凡,杜衛(wèi)華,郝海生,朱化彬,阿布力孜·吾斯曼,趙學(xué)明*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

隨著我國經(jīng)濟(jì)實(shí)力不斷提升,人均可支配收入隨之增加,人們對于綠色、自然、健康的食品也有了更高的需求。水牛奶中鈣、磷、鐵含量高,微量元素均衡,營養(yǎng)全面,被譽(yù)為“奶中之王”,水牛奶產(chǎn)品在世界奶類市場占比中逐年升高,擁有巨大消費(fèi)市場[1]。水牛具有耐高溫高濕、耐粗飼以及抗病能力強(qiáng)等優(yōu)良特性,其奶產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)且經(jīng)濟(jì)價(jià)值高,因此,水牛被聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織認(rèn)定為最具開發(fā)潛力和開發(fā)價(jià)值的家畜[2]。我國本土水牛為役用的沼澤型水牛,國外主要為奶用的河流型水牛,為了提高我國水牛的生產(chǎn)性能,于1957年和1974年從印度和巴基斯坦引進(jìn)了摩拉水牛和尼里-拉菲水牛,并與我國本土水牛進(jìn)行雜交,經(jīng)過長時(shí)間的改良工作,已使得我國雜交水牛的乳、肉生產(chǎn)性能得到了大幅提高[3]。

然而,在現(xiàn)代化規(guī)模養(yǎng)殖中,水牛發(fā)情不明顯的問題日益突出。研究表明,在夏季水牛發(fā)情鑒定過程中,安靜發(fā)情的水牛占到了總數(shù)的29%,這極大降低了水牛的發(fā)情鑒定效率[4]。此外,由于高精度發(fā)情檢測手段的缺乏,50%的水牛發(fā)情無法及時(shí)檢出,從而導(dǎo)致無法及時(shí)實(shí)施配種計(jì)劃[5]。在生產(chǎn)實(shí)踐中,約有20%的配種母牛因授精時(shí)間不當(dāng)而無法成功受孕,這極大地降低了牛群的整體生產(chǎn)力,并對水牛產(chǎn)業(yè)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6]。據(jù)報(bào)道,在生產(chǎn)中,因奶水牛發(fā)情問題導(dǎo)致的日均損失可達(dá)每頭6美元[7]。因此,精準(zhǔn)的發(fā)情鑒定對于奶水牛生產(chǎn)愈發(fā)重要。利用發(fā)情鑒定可以準(zhǔn)確的鑒別水牛的發(fā)情時(shí)期,提前計(jì)劃配種時(shí)間,擇優(yōu)劣汰,從而提高水牛的繁殖性能,使生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益最大化。

牛的發(fā)情階段分為:發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和發(fā)情間期。目前,根據(jù)發(fā)情周期已開發(fā)出多種發(fā)情鑒定方法,包括人工觀察法、人工涂蠟法和自動(dòng)化監(jiān)測法等。人工自然觀察法較為簡單,母牛發(fā)情前期會出現(xiàn)頻繁走動(dòng)、長時(shí)間處于站立狀態(tài)、與其余牛只貼靠等行為,發(fā)情中期接受爬跨,或出現(xiàn)舉尾躬腰體態(tài),到發(fā)情后期時(shí),母牛拒絕爬跨;此法簡單直接但易漏檢、誤檢,當(dāng)母牛的發(fā)情期集中于晚上時(shí)不易發(fā)現(xiàn),且當(dāng)母?？倲?shù)較多時(shí)費(fèi)時(shí)費(fèi)力[8-9]。人工涂蠟法是通過對發(fā)情母牛的尾椎使用蠟筆標(biāo)記,經(jīng)過爬跨的母牛后背的涂料會變淺,從而確定母牛是否發(fā)情,但是當(dāng)牛被毛被舔舐或下雨天氣時(shí)該方法失效[8]。自動(dòng)化監(jiān)測法有常見的計(jì)步器和其他智能檢測設(shè)備,計(jì)步器檢測法的準(zhǔn)確率在75%～90%之間,但無法區(qū)別假發(fā)情與安靜發(fā)情[10]。其他智檢設(shè)備包括智能耳標(biāo)[11]、項(xiàng)圈[12]、電子鼻[13]和背景差分技術(shù)[14]等,能對采食、反芻和趴窩等綜合行為進(jìn)行發(fā)情檢測,可以克服一些傳統(tǒng)視覺發(fā)情檢測方法的局限性,但設(shè)備和服務(wù)的高投入影響其大規(guī)模應(yīng)用[15]。以上方法尚不能滿足奶水牛規(guī)?；a(chǎn)發(fā)情鑒定的需求,亟待開發(fā)操作簡單、成本更低、精度更高的發(fā)情監(jiān)測手段。

最近的研究表明,血液[16]、尿液[17]、唾液[18]和宮頸陰道液(cervical-vaginal fluid, CVF)[19]等各種體液及糞便中生物分子表達(dá)差異成為母畜發(fā)情診斷的重要靶標(biāo)[20]。通過體液及糞便進(jìn)行發(fā)情鑒定具有準(zhǔn)確、及時(shí)、簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn),符合生產(chǎn)實(shí)際的現(xiàn)狀,并且使用該方法可以提高經(jīng)濟(jì)效益[21-22]。本文針對奶水牛該領(lǐng)域的研究進(jìn)行了總結(jié)和回顧,旨在為開發(fā)奶水牛發(fā)情鑒定新方法提供技術(shù)參考。

1 血液鑒定發(fā)情

1.1 促黃體生成素

發(fā)情周期內(nèi)各生殖激素濃度的變化一直是發(fā)情鑒定的研究熱點(diǎn)。促黃體生成素(luteinizing hormone, LH)為糖蛋白激素中的一種,其不僅促進(jìn)卵泡成熟至排出,還促進(jìn)卵泡排出后的一系列顆粒細(xì)胞黃體化以及保持黃體孕酮分泌,刺激卵泡膜細(xì)胞分泌雄激素[23]。在一項(xiàng)研究中,通過檢測水牛發(fā)情周期中的血清LH濃度,發(fā)現(xiàn)在發(fā)情當(dāng)天濃度最高[24]。Niswender等[25]報(bào)道,發(fā)情當(dāng)天的綿羊血清LH含量高于卵泡期和黃體期。而在一項(xiàng)對巴美肉羊的研究中,發(fā)現(xiàn)血清 LH呈脈沖式分泌,在發(fā)情期時(shí)含量最高[26]。

1.2 促卵泡素

促卵泡素(follicle-stimulating hormone, FSH),與LH一樣是糖蛋白類激素,主要由腺垂體分泌[23]。FSH對雌性動(dòng)物個(gè)體生長發(fā)育、卵泡內(nèi)膜細(xì)胞分化、顆粒細(xì)胞增生和卵泡液分泌起促進(jìn)作用,并在LH協(xié)作下可刺激卵泡的成熟與排出[23]。在一項(xiàng)研究中,通過檢測水牛發(fā)情周期血清FSH濃度,發(fā)現(xiàn)在發(fā)情當(dāng)天濃度最高[24]。Akbar等[27]報(bào)道,發(fā)情當(dāng)天的牛血清FSH水平高于卵泡期和黃體期。而在一項(xiàng)對巴美肉羊的研究中,發(fā)現(xiàn)血清 FSH也呈脈沖式分泌,在發(fā)情期時(shí)含量最高[26]。

1.3 孕酮

孕酮主要由卵巢內(nèi)的黃體分泌,隨著牛發(fā)情周期規(guī)律性變化。據(jù)報(bào)道,水牛血清孕酮濃度在發(fā)情當(dāng)天達(dá)到最低值[28]。Smith等[29]研究發(fā)現(xiàn),奶牛的血漿孕酮濃度在發(fā)情時(shí)濃度最低,低濃度會從發(fā)情前4 d一直持續(xù)到發(fā)情后4 d。另一項(xiàng)研究顯示,通過檢測血清孕酮水平,可有效鑒別同期發(fā)情處理母牛的假性發(fā)情,提高克隆胚胎移植妊娠率[30]。因此,可以通過檢測水牛血清孕酮濃度來鑒定其是否發(fā)情。

1.4 miRNAs

miRNAs是一種內(nèi)源性小RNA,它們通過與mRNA非編碼區(qū)結(jié)合位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)配對方式,從而調(diào)控靶基因的降解或抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯過程,以實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[31]。miRNAs在發(fā)情周期的牛卵巢組織中有周期性表達(dá),它們在發(fā)情周期的不同階段具有特定的作用[32-33]。在一項(xiàng)研究中,研究者將miRNAs測序和實(shí)時(shí)熒光定量PCR相結(jié)合,確定了在牛發(fā)情周期期間血漿中水平發(fā)生變化的miRNAs子集,發(fā)現(xiàn)在發(fā)情期let-7f、miR-125b、miR-99a-5p和miR-145的水平顯著升高[34]。Ioannidis和Donadeu等[16]針對奶牛的血漿進(jìn)行了相關(guān)研究,表明與奶牛發(fā)情周期的其他階段相比,發(fā)情期 miR-99a-5p、let-7f、miR-145 和 miR-125b 的水平顯著增加。另一項(xiàng)研究表明,血清miR-126-3p水平在排卵期和黃體期均高于卵泡期,且與雌二醇(estradiol, E2)值呈正相關(guān)[35]。

2 尿液鑒定發(fā)情

哺乳動(dòng)物能通過尿液、唾液、糞便和一些特殊的氣味腺體向外部環(huán)境排泄化學(xué)信號,這些信號的濃度可能會隨著動(dòng)物的階段和狀態(tài)而變化,在交流的各種來源中,尿液是參與信號-受體系統(tǒng)的主要來源之一[36-37]。

2.1 揮發(fā)性化合物

根據(jù)相關(guān)研究證明,在有蹄類動(dòng)物中,尿液和CVF中含有發(fā)情期指示信息素,這些信息素首先引起性嗅反應(yīng),隨后會導(dǎo)致行為的增加[38]。信息素釋放的時(shí)機(jī)通常對物種同期生殖行為至關(guān)重要,在亞洲母象發(fā)情期時(shí)(排卵之前)會釋放一種尿性信息素,這些信息素會使公象因?yàn)榛瘜W(xué)反應(yīng)而出現(xiàn)性嗅反射[39]。Rajanarayanan和Archunan[17]在母水牛尿液中鑒定出了14種不同的揮發(fā)性化合物,其中1-氯辛烷、4-甲基苯酚和9-十八碳烯酸僅在發(fā)情期出現(xiàn)。因此,可從奶水牛尿液成分開發(fā)發(fā)情鑒定標(biāo)記物。

2.2 miRNAs

在一項(xiàng)研究中評估了各種miRNAs,發(fā)現(xiàn)發(fā)情期水牛尿液中的miR-99a-5p和BTA-miR-125b水平低于發(fā)情前期和發(fā)情間期[40]。Ioannidis和Donadeu等[16]發(fā)現(xiàn),miR-99a-5p 和BTA-miR-125b在奶牛的卵泡期卵巢中表達(dá)較高,在發(fā)情期血漿水平較高。

2.3 LH

一些研究證明,用于檢測血液LH的抗體在檢測其他物種的純凈尿液LH時(shí),同樣會出現(xiàn)LH顯著增加的現(xiàn)象[41]。在水牛尿液中檢測到的LH濃度高于血清的LH,且據(jù)分析,發(fā)情期尿液中的LH與基礎(chǔ)值相比顯著增加了一倍,但發(fā)情前和發(fā)情后的尿液中LH并沒有顯著增加[42]。

3 CVF鑒定發(fā)情

CVF是來自陰道、宮頸內(nèi)膜、子宮蛻膜和羊膜分泌物的復(fù)雜混合物,具有發(fā)出生育信號、幫助授精、懷孕以及分娩等功能,采集相對安全、容易,可能作為妊娠的生物標(biāo)志物的來源[43]。

3.1 粘液形態(tài)

水牛的發(fā)情跡象并不明顯,尤其是CVF的分泌[17]。水牛發(fā)情期和發(fā)情間期的CVF相比,發(fā)情期的粘液量多、稀薄、清澈,而在發(fā)情間期,粘液稀少但濃稠[44]。然而,在發(fā)情期的整個(gè)過程中,外陰腫脹和CVF結(jié)晶的情況則十分明顯[45]。此外,牛的CVF在不同發(fā)情時(shí)期表現(xiàn)出的不同結(jié)晶模式(圖1)也可以作為發(fā)情鑒定的手段,這個(gè)結(jié)晶模式取決于雌激素和孕酮的濃度[46]。

a. 發(fā)情期晶體緊密且連續(xù)的葉狀排列;b. 發(fā)情間期結(jié)晶不連續(xù)a. Compact and continuous leafy arrangement of crystal during the estrus phase; b. Discontinuous crystallization during diestrus圖1 發(fā)情期水牛CVF結(jié)晶(風(fēng)干,150×)[19]Fig.1 CVF crystallization of estrus buffalo (air dried, 150×)[19]

3.2 蛋白質(zhì)組

有研究表明,在水牛整個(gè)發(fā)情周期的CVF中共鑒定出240種蛋白質(zhì),而在發(fā)情期只鑒定出176種蛋白質(zhì),再次對兩個(gè)時(shí)期的特定蛋白質(zhì)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)127種蛋白質(zhì)是發(fā)情期特有的,如水牛發(fā)情期CVF中的組蛋白H2B,其結(jié)果表明發(fā)情期CVF比發(fā)情間期CVF含有更多的特定蛋白。水牛發(fā)情期時(shí),CVF中HSPA1A蛋白的豐度高于發(fā)情間期,且HSP-70在發(fā)情期會出現(xiàn)高表達(dá)[19]。這些CVF的蛋白鑒定可以作為鑒定發(fā)情階段的一種有效方式。

4 糞便鑒定發(fā)情

糞便是代謝產(chǎn)物從動(dòng)物體內(nèi)排出的主要媒介之一,具有潛在的傳達(dá)動(dòng)物內(nèi)部生理信息的功能,因此成為許多物種獲取化學(xué)信號的重要來源之一[47]。據(jù)研究表明,無論是小型還是大型哺乳動(dòng)物,在發(fā)情期間,它們的糞便中都會釋放特定的化合物[48]。

牛在發(fā)情周期期間其糞便中的揮發(fā)性化合物發(fā)生顯著變化,在整個(gè)發(fā)情周期中,檢測到27種化合物,其中4-甲基苯酚和反式馬鞭草酚只存在于發(fā)情期,牛糞便中的這兩種化合物可以作為體現(xiàn)發(fā)情狀態(tài)的標(biāo)志[47]。而在另一項(xiàng)試驗(yàn)中,通過對發(fā)情前期、發(fā)情期和發(fā)情后期牛的糞便進(jìn)行分析檢測到10種不同的揮發(fā)性化合物,發(fā)現(xiàn)乙酸、丙酸等是發(fā)情期特有的,丁酸、羧酸和戊酸等是發(fā)情前期特有的,而丁烷等化合物僅存在于發(fā)情后期[49]。

5 唾液鑒定發(fā)情

唾液主要由腮腺、舌下腺和下頜腺3對唾液腺和口腔粘膜下大量的小唾液腺分泌物產(chǎn)生,主要包括水、一些非蛋白質(zhì)有機(jī)物,以及一些蛋白質(zhì)或多肽物質(zhì),它由淀粉酶、白蛋白、分泌型免疫球蛋白A和富含酪蛋白的蛋白質(zhì)組成[50]。唾液是動(dòng)物體內(nèi)重要和必需的體液,其富含類固醇激素、DNA、高分子敏感性RNA以及氧化應(yīng)激標(biāo)志物等成分,人體內(nèi)的大多數(shù)代謝物、激素、抗體和其他物質(zhì)都可以通過血液的被動(dòng)擴(kuò)散或主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入唾液[51]。唾液相對于其他的體液來說,具有易采集、易處理、成本低、樣品量充足、動(dòng)物應(yīng)激小等優(yōu)點(diǎn),在發(fā)情前期診斷有著非常重要的意義。利用PCR、代謝組、蛋白質(zhì)組學(xué)、色譜-質(zhì)譜分析及生物學(xué)分析等先進(jìn)技術(shù)手段,對家畜不同發(fā)情時(shí)期的唾液樣本進(jìn)行分析,尋找家畜在不同發(fā)情時(shí)期的特異性發(fā)情標(biāo)記物作為分子靶向,可以降低成本且極大的提高家畜發(fā)情鑒定效率[20]。

5.1 內(nèi)源性性激素

在女性的唾液和血液中,E2的含量與卵泡大小和數(shù)量成正比,并與卵泡的數(shù)量顯著相關(guān)。因此,可以通過檢測唾液中E2的含量來反映血漿游離激素水平[52]。在水牛中,血液和唾液的生殖激素水平在發(fā)情周期中基本趨于一致,唾液中E2、FSH和LH在發(fā)情當(dāng)天都達(dá)到了最高水平[24,53]。

5.2 蛋白質(zhì)組

Singh等[54]報(bào)道,與其他3個(gè)發(fā)情階段相比,水牛唾液中發(fā)情期時(shí)ENO3和SDF4的表達(dá)增加;SERPINB1在發(fā)情前期和發(fā)情期的表達(dá)顯著,而在發(fā)情后期和發(fā)情間期的表達(dá)幾乎可以忽略不計(jì)。一項(xiàng)研究證明,HSPA1A在水牛唾液的發(fā)情期出現(xiàn)特異性表達(dá)[55]。另一項(xiàng)研究報(bào)道,SERPINAI、HSP-70和ANXAI在發(fā)情當(dāng)天表達(dá)量增加[53]。此外,據(jù)一項(xiàng)水牛唾液直接轉(zhuǎn)錄分析顯示,發(fā)情水牛的HSP-70和TLR4轉(zhuǎn)錄水平更高[52]。一項(xiàng)關(guān)于豬不同發(fā)情階段唾液的研究發(fā)現(xiàn),在發(fā)情期P00335、P28491、F1SHL9、F1SDR7的表達(dá)顯著上調(diào),在發(fā)情后期顯著下調(diào),且它們與雌激素含量密切相關(guān)[50]。

5.3 miRNAs

水牛唾液中miR-16、miR-191、和miR-233含量與發(fā)情周期相關(guān),可以作為水牛發(fā)情標(biāo)記物。據(jù)報(bào)道,它們在發(fā)情期及第9～10天唾液中的含量低于發(fā)情周期的其他天數(shù),在研究樣本中發(fā)現(xiàn)發(fā)情間期和隨后連續(xù)發(fā)情階段的唾液miR-16、miR-191和miR-223水平高于發(fā)情期,表明這3種miRNAs在水牛發(fā)情周期的不同階段的唾液中動(dòng)態(tài)存在[56]。

5.4 結(jié)晶形態(tài)

與CVF一樣,唾液也會在不同的發(fā)情時(shí)期出現(xiàn)不同的結(jié)晶模式,雖然反芻動(dòng)物唾液結(jié)晶模式與生殖狀態(tài)有關(guān)的信息比較有限,但仍有一些關(guān)于牛的研究表明,結(jié)晶模式與生殖狀態(tài)之間存在顯著的關(guān)聯(lián)[57-59]。在澤布奶牛中(圖2)發(fā)現(xiàn),發(fā)情周期的第20天,所有的奶牛唾液中都觀察到了明顯的蕨類結(jié)晶模式[60]。

a. 樹枝狀;b. 蕨類;c. 冷杉類;d. 樹枝和冷杉類;e. 冷杉和蕨類;f. 樹枝和蕨類a. Branch like; b. Fern like; c. Fir like; d. Branch and fir like; e. Fir and fern like; f. Branch and fern like圖2 在奶牛唾液中觀察到的主要結(jié)晶模式(風(fēng)干,200×)[60]Fig.2 Major crystallization patterns observed in saliva of cows (air dried, 200×)[60]

6 小 結(jié)

奶水牛是重要的農(nóng)耕役畜,其優(yōu)質(zhì)的奶產(chǎn)品使其在生產(chǎn)上具有廣大的效益前景。然而,奶水牛發(fā)情并不明顯,現(xiàn)有發(fā)情鑒定技術(shù)手段不能滿足生產(chǎn)需求。開發(fā)新的奶水牛發(fā)情鑒定手段,不僅可以提高水牛的繁殖效率,還可以提高經(jīng)濟(jì)效益。隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,可以深入挖掘發(fā)情周期的分子變化,挖掘發(fā)情標(biāo)志物為發(fā)情鑒定方法研究提供更多可能性,開發(fā)出更為簡便、高效、準(zhǔn)確的發(fā)情檢測試劑盒。