陳 曦,王 一,王佳麗,楊 新,宋軍科,趙光輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,楊凌 712100)

毒害艾美耳球蟲(chóng)(Eimerianecatrix)屬于孢子蟲(chóng)綱、艾美耳科、艾美耳屬,是引起雞球蟲(chóng)病的主要致病病原之一,可造成雞的營(yíng)養(yǎng)吸收障礙、飼料轉(zhuǎn)化率降低、血痢等癥狀,感染嚴(yán)重的雛雞甚至?xí)霈F(xiàn)大批死亡[1-4]。產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一種革蘭陽(yáng)性厭氧菌,在自然界廣泛分布,可引起雞的壞死性腸炎[5],表現(xiàn)采食量下降,產(chǎn)蛋量減少,嚴(yán)重時(shí)雞只消瘦、排黑色稀便并伴有惡臭味,有時(shí)會(huì)出現(xiàn)血痢[6],多見(jiàn)于2～6周齡的肉雞,發(fā)病率和病死率較高,病死率最高可達(dá)50%[7-8],經(jīng)治療后的雛雞會(huì)出現(xiàn)發(fā)育遲緩、生產(chǎn)性能下降等,嚴(yán)重危害全球畜牧業(yè)的發(fā)展[9]。

納米PCR(nanoparticle-assisted PCR,nano-PCR)是納米技術(shù)結(jié)合分子生物學(xué)的一種新型PCR方法,通過(guò)向體系中加入納米顆粒,使PCR具有更好的靈敏性、特異性和反應(yīng)速率[10]。納米粒子良好的導(dǎo)熱性使納米PCR 檢測(cè)在擴(kuò)增過(guò)程中更快地達(dá)到目標(biāo)溫度,同PCR 相比減少了反應(yīng)在非目標(biāo)溫度下的時(shí)間,可以有效減少非特異性擴(kuò)增,增加反應(yīng)的靈敏度。有研究表明,加入納米粒子的PCR的靈敏度提高了5倍～10倍,實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度提高104倍[11-12]。同時(shí),納米粒子有同單鏈結(jié)合蛋白(single strand binding protein,SSB)相似的作用,可有效降低引物和模板的錯(cuò)配從而提高特異性[13]。此外,納米粒子還可通過(guò)在反應(yīng)體系中吸附DNA聚合酶、Mg2+、寡核苷酸引物或DNA模板,使PCR反應(yīng)物聚集,提高反應(yīng)效率[14]。由于納米PCR優(yōu)良的性能,近年來(lái)已經(jīng)應(yīng)用于犬巴貝斯蟲(chóng)(Babesiacanis)、犬肝簇蟲(chóng)(Hepatozooncanis)和食腦性阿米巴原蟲(chóng)(Acanthamoebaspp.、Balamuthiamandrillaris、Naegleriafowleri)等病原的檢測(cè)[15-16]。

臨床上,雞球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌常混合感染。為了實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)兩種病原的快速檢測(cè),本研究初步建立了檢測(cè)毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌的雙重PCR及雙重納米PCR檢測(cè)方法,以期為臨床雞毒害艾美耳球蟲(chóng)病和壞死性腸炎的診斷提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病原及質(zhì)粒

毒害艾美耳球蟲(chóng)、產(chǎn)氣莢膜梭菌、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、貝氏隱孢子蟲(chóng)、藍(lán)氏賈第蟲(chóng)、畢氏腸微孢子蟲(chóng)、芽囊原蟲(chóng)、禽毛滴蟲(chóng)、沙門菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌等病原的基因組DNA樣品由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提取、鑒定并保存。

pMD19-T-ITS2和pMD19-T-cpa質(zhì)粒均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。

1.2 主要試劑

E.Z.N.A. Stool DNA Kit購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-tek公司;納米PCR試劑盒購(gòu)自上海戶實(shí)醫(yī)藥科技有限公司;ExTaqDNA聚合酶、10×ExTaqBuffer(Mg2+free)、MgCl2、dNTP、6×Loading buffer、DL2000 DNA Marker、pMD19-T Vector、大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞JM109均購(gòu)自中國(guó)寶生物工程(大連)有限公司;DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的毒害艾美耳球蟲(chóng)ITS-2基因序列(GenBank登錄號(hào):AM922243、AM922242、AM922241、JN022588、JN022587)應(yīng)用軟件DNAMAN 7.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物EnITS2 F/R。產(chǎn)氣莢膜梭菌的特異性引物cpa398 F/R參考前人文獻(xiàn)[17]。引物均由生工生物技術(shù)(上海)有限公司合成(表1)。

表1 毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌雙重PCR和雙重納米PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primers for duplex PCR and duplex nano-PCR to detect E. necatrix and C. perfringens

1.4 毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌雙重PCR檢測(cè)方法的建立

雙重PCR預(yù)設(shè)定反應(yīng)體系:10×ExTaqBuffer(Mg2+free)1.25 μL、dNTP(2.5 mmol·L-1)1 μL、MgCl2(25 mmol·L-1) 1 μL、EnITS2 F/R(10 μmol·L-1)各0.5 μL、cpa398 F/R(10 μmol·L-1)各0.5 μL、ExTaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.07 μL、模板DNA 1 μL,ddH2O補(bǔ)至12 μL;反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。

退火溫度、引物濃度和MgCl2濃度優(yōu)化:在相同條件下,進(jìn)行不同退火溫度(50、52、53、55、57、59、60、62 ℃)的優(yōu)化;引物用量2～16 pmol進(jìn)行優(yōu)化,間隔2 pmol;MgCl2的使用體積為0.2～2.0 μL進(jìn)行優(yōu)化,間隔0.2 μL。

1.5 毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌雙重納米PCR檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化

雙重納米PCR預(yù)設(shè)定反應(yīng)體系:2×Nano-QPCR Buffer 6 μL、EnITS2 F/R各1 μL、cpa398 F/R各1 μL、Taqenzyme mix 0.2 μL、模板DNA 1 μL,ddH2O補(bǔ)至12 μL;反應(yīng)條件同“1.4”方法。

雙重納米PCR反應(yīng)體系及條件優(yōu)化:退火溫度梯度設(shè)置同雙重PCR,引物用量梯度設(shè)置同“1.4”方法。

1.6 特異性試驗(yàn)

分別用優(yōu)化后的雙重PCR和雙重納米PCR對(duì)毒害艾美耳球蟲(chóng)、產(chǎn)氣莢膜梭菌、藍(lán)氏賈第蟲(chóng)、芽囊原蟲(chóng)、畢氏腸微孢子蟲(chóng)、禽毛滴蟲(chóng)、貝氏隱孢子蟲(chóng)、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的DNA樣品,以及毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增,檢驗(yàn)所建立檢測(cè)方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)

重組質(zhì)粒pMD19-T-ITS2和pMD19-T-cpa經(jīng)10倍倍比稀釋得到不同濃度梯度的質(zhì)粒模板,分別用優(yōu)化后的雙重PCR和納米PCR進(jìn)行擴(kuò)增,檢測(cè)最低質(zhì)粒檢出量。

1.8 臨床糞便樣品檢測(cè)

本研究的糞便樣品采集自規(guī)?；u場(chǎng)雞的新鮮糞便,已用病原學(xué)(飽和鹽水漂浮法和形態(tài)學(xué))方法明確了毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染情況;E.Z.N.A. Stool DNA Kit提取這些糞便的基因組DNA,用所建立的雙重PCR和雙重納米PCR對(duì)這些樣品進(jìn)行檢測(cè),分析其臨床適用性。

2 結(jié) 果

2.1 毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌雙重PCR檢測(cè)方法的建立

優(yōu)化后的雙重PCR反應(yīng)體系為10×ExTaqBuffer(Mg2+free)1.25 μL、dNTP(2.5 mmol·L-1)1 μL、MgCl2(25 mmol·L-1)1.2 μL、EnITS2 F/R(10 μmol·L-1)各0.4 μL、cpa398 F/R(10 μmol·L-1)各0.4 μL、ExTaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.07 μL、模板DNA 1 μL,ddH2O補(bǔ)至12 μL;反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。

在優(yōu)化后的體系和條件下對(duì)毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌的混合DNA樣品進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增,在約150 bp左右出現(xiàn)了毒害艾美耳球蟲(chóng)的目的條帶,在約400 bp左右出現(xiàn)了產(chǎn)氣莢膜梭菌的目的條帶,擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收純化后送公司測(cè)序,經(jīng)序列比對(duì)證實(shí)約150 bp的條帶為毒害艾美耳球蟲(chóng)ITS-2基因的目的片段,約400 bp的條帶為產(chǎn)氣莢膜梭菌 α毒素基因的目的片段。

2.2 雙重PCR特異性試驗(yàn)

雙重PCR分別擴(kuò)增出E.necatrix和C.perfringens大小約為150和400 bp的目的條帶,其他寄生原蟲(chóng)和細(xì)菌均無(wú)目的條帶擴(kuò)增(圖1)。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) GL500;1. 毒害艾美耳球蟲(chóng)+產(chǎn)氣莢膜梭菌;2. 毒害艾美耳球蟲(chóng);3. 產(chǎn)氣莢膜梭菌;4. 藍(lán)氏賈第蟲(chóng);5. 芽囊原蟲(chóng);6. 畢氏腸微孢子蟲(chóng);7. 禽毛滴蟲(chóng);8. 貝氏隱孢子蟲(chóng);9. 柔嫩艾美耳球蟲(chóng);10. 沙門菌;11. 金黃色葡萄球菌;12. 大腸埃希菌;13. 陰性對(duì)照M. GL500 DNA marker; 1. E. necatrix+C. perfringens; 2. E. necatrix; 3. C. perfringens; 4. G. lamblia; 5. Blastocystis sp.; 6. E. bieneusi; 7. T. gallinae; 8. C. baileyi; 9. E. tenella; 10. Salmonella spp.; 11. Staphylococcus aureus; 12. Escherichia coli; 13. Negative control圖1 毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌雙重PCR特異性試驗(yàn)Fig.1 Specificity test of the duplex PCR for E. necatrix and C. perfringens

2.3 雙重PCR敏感性試驗(yàn)

所保存的質(zhì)粒pMD19-T-ITS2和pMD19-T-cpa濃度分別為1.81×1011和1.05×1011copies·μL-1。將重組質(zhì)粒pMD19-T-ITS2和pMD19-T-cpa 10倍倍比稀釋至濃度分別為1.81和1.05 copies·μL-1,對(duì)質(zhì)粒濃度梯度進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增,最低檢出質(zhì)粒量為pMD19-T-ITS2 181 copies和pMD19-T-cpa 1 050 copies。

2.4 毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌體系雙重納米PCR檢測(cè)方法的建立

優(yōu)化后的雙重納米PCR反應(yīng)體系為2×Nano-qPCR Buffer 6 μL、EnITS2 F/R各0.6 μL、cpa398 F/R各0.6 μL、Taqenzyme mix 0.2 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O補(bǔ)至12 μL;反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。

利用優(yōu)化后的反應(yīng)條件對(duì)毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌的混合DNA樣品進(jìn)行雙重納米PCR擴(kuò)增,分別在約150和400 bp左右出現(xiàn)了毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌的目的條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收純化后送測(cè)序,經(jīng)序列比對(duì)證實(shí)約150 bp左右的條帶為毒害艾美耳球蟲(chóng)ITS-2基因的目的片段,而約400 bp左右的條帶為產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因的目的片段。

2.5 雙重納米PCR特異性試驗(yàn)

雙重納米PCR分別擴(kuò)增出毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌大小約為150和400 bp的目的條帶,其它病原均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶(圖2)。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) GL500;1. 毒害艾美耳球蟲(chóng)+產(chǎn)氣莢膜梭菌;2. 毒害艾美耳球蟲(chóng);3. 產(chǎn)氣莢膜梭菌;4. 藍(lán)氏賈第蟲(chóng);5. 芽囊原蟲(chóng);6. 畢氏腸微孢子蟲(chóng);7. 禽毛滴蟲(chóng);8. 貝氏隱孢子蟲(chóng);9. 柔嫩艾美耳球蟲(chóng);10. 沙門菌;11. 金黃色葡萄球菌;12. 大腸埃希菌;13. 陰性對(duì)照M. GL500 DNA marker; 1. E. necatrix+C. perfringens; 2. E. necatrix; 3. C. perfringens; 4. G. lamblia; 5. Blastocystis sp.; 6. E. bieneusi; 7. T. gallinae; 8. C. baileyi; 9. E. tenella; 10. Salmonella spp.; 11. Staphylococcus aureus; 12. E. coli; 13. Negative control圖2 毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌雙重納米PCR特異性試驗(yàn)Fig.2 Specificity test of the duplex nano-PCR for E. necatrix and C. perfringens

2.6 雙重納米PCR敏感性試驗(yàn)

利用優(yōu)化好的雙重納米PCR擴(kuò)增不同濃度的重組質(zhì)粒pMD19-T-ITS2和pMD19-T-cpa,雙重納米PCR最低檢出質(zhì)粒量為pMD19-T-ITS2 1.81 copies和pMD19-T-cpa 105 copies。

2.7 臨床樣品檢測(cè)

利用本研究所建立2種方法對(duì)19份已明確毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌感染情況的雞的臨床糞便樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn),毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌的陽(yáng)性率分別為52.6%和47.4%,雙重感染的陽(yáng)性率為31.6%,與病原學(xué)的檢測(cè)結(jié)果一致。

3 討 論

臨床上,宿主感染毒害艾美耳球蟲(chóng)后,腸道黏膜會(huì)發(fā)生出血性損傷。此時(shí),產(chǎn)氣莢膜梭菌若趁機(jī)入侵大量繁殖則會(huì)繼發(fā)壞死性腸炎,加重腸道損傷,增加死亡率[18]。隨著我國(guó)對(duì)抗生素使用的限制以及2種病原不同的治療方式,當(dāng)臨床上出現(xiàn)便血等癥狀時(shí),對(duì)于球蟲(chóng)和梭菌單一或混合感染的判定顯得尤為重要。本研究基于毒害艾美耳球蟲(chóng)ITS-2序列和產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因設(shè)計(jì)特異性引物,經(jīng)過(guò)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化,成功建立了能夠同時(shí)檢測(cè)毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌的雙重PCR及雙重納米PCR方法。所建立的雙重納米PCR方法在檢測(cè)毒害艾美耳球蟲(chóng)時(shí)最低模板檢出量為1.81 copies,敏感性是雙重PCR的100倍;而檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌時(shí)最低模板檢出量為105 copies,敏感性是雙重PCR的10倍。同檢測(cè)其他病原的納米PCR相比,本研究建立的雙重納米PCR對(duì)于檢測(cè)毒害艾美耳球蟲(chóng)的敏感性為1.81 copies,高于Luo等[19]建立檢測(cè)豬偽狂犬病毒(敏感性6 copies)和檢測(cè)豬博卡病毒(敏感性95 copies)的雙重納米PCR,而對(duì)于檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的敏感性為105 copies,略低于檢測(cè)豬博卡病毒的敏感性。目前國(guó)內(nèi)外建立的多重納米PCR多用于樣品中病毒的特異性檢測(cè),敏感性差異較大,多為2～1 000 copies,這可能與納米PCR體系、基因位點(diǎn)選取和引物設(shè)計(jì)的不同有關(guān)[20-23]。2種方法對(duì)已明確毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌感染情況的雞的臨床糞便樣品檢測(cè)結(jié)果與病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致,表明2種方法可用于雞的臨床糞便樣品檢測(cè)。

隨著我國(guó)禽養(yǎng)殖的規(guī)模逐漸擴(kuò)大,毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的病例逐漸增加,迫切需要更加快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法應(yīng)用于臨床實(shí)踐。但目前國(guó)內(nèi)尚未有關(guān)于毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌雙重PCR檢測(cè)方法的商品化應(yīng)用,限制了對(duì)臨床上常見(jiàn)的2種重要病原體的檢測(cè)和防控。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上,建立了簡(jiǎn)便快捷的雙重 PCR和雙重納米PCR方法,操作簡(jiǎn)單,靈敏度高,特異性好,未來(lái)將對(duì)所建方法的臨床應(yīng)用進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估,以滿足臨床對(duì)于毒害艾美耳球蟲(chóng)和產(chǎn)氣莢膜梭菌2種病原的檢測(cè)需求。

4 結(jié) 論

本研究成功建立了適用于臨床檢測(cè)E.necatrix和C.perfringens特異、敏感的雙重PCR和雙重納米PCR檢測(cè)方法。